慢加急性肝衰竭預(yù)后標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀

李 健，杜亞秋，李德釗，季慧范，張成港，劉慶夏，郭曉林

吉林大學(xué)第一醫(yī)院 肝膽胰內(nèi)科，長春 130021

慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償，常伴隨肝臟和肝外器官衰竭，是常見的重癥肝病類型之一。目前，有關(guān)的臨床報道表明ACLF患者28 d無移植病死率高達(dá)50%～90%，預(yù)后差[1-3]。病毒性肝病、酒精性肝病或兩者共同作用是ACLF的主要病因[4]，因地區(qū)差異，病因分布并不完全相同。ACLF的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為全身性炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴在ACLF和隨后的器官衰竭中起著中心作用[5]。對酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)-ACLF，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)是核心機(jī)制，而在HBV-ACLF中，HBV激活引起的免疫-代謝失衡發(fā)揮了核心作用[6]。

在ACLF中，過度的免疫反應(yīng)使肝細(xì)胞大量壞死，并逐漸擴(kuò)散至全身，致肝外臟器受累，這種過度和不可控的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步惡化肝損傷[7]，使得ACLF患者短期病死率高。因此，早期、準(zhǔn)確的判斷患者病情及預(yù)后對于提高ACLF患者的生存率及優(yōu)化資源配置具有重要意義。隨著定量蛋白組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，肝病候選生物學(xué)標(biāo)志物，尤其是非侵入性血清標(biāo)志物亦得到發(fā)展[8]。近年來新發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)標(biāo)志物如炎癥相關(guān)性、代謝相關(guān)性、免疫反應(yīng)相關(guān)性等逐漸進(jìn)入研究者視野，本文就上述不同類型生物學(xué)標(biāo)志物在ACLF預(yù)后中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為ACLF預(yù)后評估提供參考。

1 炎癥相關(guān)的標(biāo)志物

1.1 白細(xì)胞介素(IL)

1.1.1 IL-23及其受體(IL-23R) 在所有T淋巴細(xì)胞亞群中，輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17作為CD4+效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，被認(rèn)為是參與多種急慢性肝病發(fā)病機(jī)制的主要效應(yīng)細(xì)胞[9]，目前研究已經(jīng)證明ACLF患者的外周血和肝臟實質(zhì)中Th17增多，同時IL-23R在ACLF患者的Th17上呈現(xiàn)高表達(dá)。HBV感染通過抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-23，一方面與Th17上的IL-23R結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)通路，促使Th17功能激活和成熟[10-12]，另一方面通過IL-23/IL-17軸介導(dǎo)肝損傷[13]。激活的Th17產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，導(dǎo)致致病微環(huán)境，從而促進(jìn)炎癥加重和疾病進(jìn)展。故在ACLF患者中，異常增高的IL-23/IL-23R介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)、加重炎癥，與肝病炎癥程度密切相關(guān)[14]，可以作為預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物。

1.1.2 白細(xì)胞介素-22(IL-22) IL-22由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，但主要靶向上皮細(xì)胞，最初IL-22被鑒定為一種肝保護(hù)性細(xì)胞因子，隨后被證明可保護(hù)多個器官免受損傷。此外，IL-22還通過刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量抗菌蛋白來防止細(xì)菌感染。肝臟再生的過程由多種細(xì)胞因子和生長因子激活的多條信號通路共同調(diào)控[15]。在這些通路中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和STAT3主要由IL-6和IL-22激活，是促進(jìn)肝臟再生的有效途徑；以IFNγ為主的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT1是阻斷肝臟再生的的有效途徑。故STAT1和STAT3激活的平衡在控制肝損傷和肝臟再生中起著關(guān)鍵作用。綜上，IL-22對重癥肝病的預(yù)后有一定提示作用。

1.1.3 白細(xì)胞介素-6(IL-6) 全身炎癥反應(yīng)是ACLF的標(biāo)志[1,16]。IL-6在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生，并啟動急性期蛋白的產(chǎn)生，同時升高的IL-6被認(rèn)為是一種明顯的促炎細(xì)胞因子，能迅速激活宿主防御系統(tǒng)，發(fā)揮多種功能[17]。在靶細(xì)胞上，IL-6與IL-6受體(IL-6R)結(jié)合，IL-6/IL-6R復(fù)合物與第二受體蛋白糖蛋白(gp)130結(jié)合，啟動信號傳導(dǎo)，信號通路持續(xù)激活可能導(dǎo)致肝損傷。已有研究[18]表明，IL-6的動態(tài)變化與疾病相關(guān)病死率有關(guān)，IL-6動態(tài)升高或持續(xù)高水平的患者病死率較高，故IL-6水平及持續(xù)時間同時對疾病的預(yù)后有提示作用。

1.2 B、T淋巴細(xì)胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator, BTLA) BTLA是CD28超家族的成員，與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxie T lylnphoeyte assoeiated antigen-4, CTLA-4)、程序性壞死因子1(programmed death-1,PD-1)共同構(gòu)成了一組抑制性受體。已有研究[19]表明，BTLA負(fù)性調(diào)節(jié)病毒特異性T淋巴細(xì)胞的功能、維持T淋巴細(xì)胞免疫耐受。ACLF的特點(diǎn)是易感染和T淋巴細(xì)胞免疫障礙。一項在健康人群、慢性乙型肝炎、HBV-ACLF患者中開展的研究[20]發(fā)現(xiàn)，HBV-ACLF患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的BTLA表達(dá)明顯增加，而交聯(lián)BTLA可進(jìn)一步抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡，使機(jī)體喪失清除病原體的能力，最終導(dǎo)致感染加重，從而影響ACLF的預(yù)后。

1.3 程序性死亡因子1(PD-1) PD-1是一種廣泛表達(dá)于多種類型免疫細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白[21]，如CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞，且作為一種抑制性調(diào)控因子，與程序性死亡因子配體(programmed death ligand, PD-L)結(jié)合后，可以抑制T淋巴細(xì)胞增殖、IL-2及IFNγ等細(xì)胞因子產(chǎn)生，屬于負(fù)向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞作用的刺激信號[22]。研究表明，PD-1的上調(diào)可能有效地減輕CD8+T淋巴細(xì)胞的致病性反應(yīng)和肝損傷[5,23]，即隨著ACLF病情加重，外周血CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)增高，與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，故PD-1/PD-L的監(jiān)測在ACLF疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中具有重要意義[24]。

1.4 損傷相關(guān)的分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs) DAMPs是細(xì)胞損傷或激活后釋放的多種具有免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞內(nèi)分子，可通過模式識別受體誘導(dǎo)自身免疫[25]。主要包括高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)、細(xì)胞核來源的組蛋白、熱休克蛋白、尿酸、線粒體轉(zhuǎn)錄因子等。其中HMGB1是一種很強(qiáng)的炎性因子，在炎癥過程中，HMGB1由壞死或凋亡細(xì)胞釋放，與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥因子釋放，包括TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、MIPs等，導(dǎo)致持續(xù)的、放大的全身炎癥反應(yīng)，并發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷[26]。HMGB1水平越高，ACLF預(yù)后越差，故可作為ACLF的一種預(yù)后標(biāo)志物。

2 代謝相關(guān)的標(biāo)志物

2.1 脂多糖(lipopolysaccharides, LPS) LPS是由脂質(zhì)和多糖組成的內(nèi)毒素成分，是一種重要的炎癥誘導(dǎo)因子，可通過與炎癥相關(guān)細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并激活下游信號通路，合成促炎因子，推動炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。細(xì)菌易位、LPS和DAMPs已經(jīng)被證實是肝衰竭發(fā)病中的重要因素[20]，肝臟Kupffer細(xì)胞在LPS的作用下，分泌功能亢進(jìn)，生成和釋放大量氧自由基和細(xì)胞因子等，加重肝損傷，同時研究還表明LPS可引起Kupffer細(xì)胞微結(jié)構(gòu)改變及自噬[27]。因此，對于有高內(nèi)毒素風(fēng)險的患者來說，監(jiān)測LPS水平顯得較為重要，LPS水平更高可能預(yù)示患者預(yù)后不佳，而及時有效的控制內(nèi)毒素會使得患者獲得更大的臨床效益。

2.2 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate , S1P) S1P是內(nèi)皮完整性的關(guān)鍵因子，可以調(diào)節(jié)肝臟再生、血管張力控制和免疫應(yīng)答等過程[28]。在ACLF中，維護(hù)血管屏障的完整性是一個重要的過程，可防止某些并發(fā)癥的出現(xiàn)，如出血、組織水腫、液體失衡、炎癥風(fēng)暴等[29]。有研究[30]表明慢性重癥肝病患者血清S1P水平隨肝病進(jìn)展而進(jìn)行性下降，可作為早期死亡的預(yù)測指標(biāo)。

2.3 M30/M65 M30/M65是一種反應(yīng)肝細(xì)胞壞死及凋亡的標(biāo)志物。角蛋白18(cytokeratin18, CK18)是構(gòu)成肝細(xì)胞骨架的主要中間絲蛋白之一，參與肝細(xì)胞骨架的構(gòu)成，對肝細(xì)胞周期及凋亡起一定的調(diào)控作用。CK18在肝細(xì)胞凋亡過程中，被切割成M30抗原片段，故通過血清M30能夠反映肝細(xì)胞凋亡水平。在壞死過程中，完整的CK18和角蛋白復(fù)合體被釋放出來，M65能夠?qū)ζ浼扒懈钸^的CK18片斷進(jìn)行識別，故在此過程中，M65水平隨著壞死過程的進(jìn)行而升高。目前已被用作急慢性肝病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和急性肝衰竭(ALF)。且已有研究[31]表明，在ACLF患者中M30和M65水平均明顯升高，且是3個月短期病死率的獨(dú)立預(yù)測因子。

2.4 甲胎蛋白(AFP) 目前的臨床研究很少有通過肝臟再生角度來評價ACLF的預(yù)后。AFP是一種體內(nèi)豐富的血漿蛋白，是一種肝細(xì)胞再生的標(biāo)志物。成人血清AFP高表達(dá)通常表明慢性肝炎或肝硬化患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的可能性增高[32]。有研究表明[33]，在除外肝癌、胃癌等惡性腫瘤，AFP水平越高，HBV-ACLF預(yù)后越好，log10AFP≥2提示ACLF患者短期生存時間越長，這表明log10AFP是預(yù)測ACLF預(yù)后的有用指標(biāo)。AFP可能是預(yù)測ACLF患者病死率的另一個重要指標(biāo)。

2.5 纖溶酶原 纖溶酶原是一種蛋白酶原，主要合成于肝臟，存在于血漿，在激活物作用下變成有活性的纖溶酶，且在肝功能嚴(yán)重受損時會顯著降低。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，入院時低水平的纖溶酶原與ACLF患者的病死率顯著相關(guān)，且在住院期間，纖溶酶原水平在生存組中逐漸升高，死亡組中逐漸下降。這種變化反映了ACLF患者病情改善、惡化和波動的過程?？赡軝C(jī)制是：在ACLF患者中，纖溶酶原活化系統(tǒng)中的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和纖溶酶可活化肝細(xì)胞生長因子，參與肝損傷后基質(zhì)重塑、調(diào)節(jié)肝損傷后肝細(xì)胞再生，故低水平的纖溶酶原可以阻礙肝細(xì)胞再生[34-35]，由此出現(xiàn)肝損傷、纖溶酶原消耗、肝細(xì)胞再生受損的惡性循環(huán)。故纖溶酶原可能是HBV-ACLF的一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。

3 免疫相關(guān)的標(biāo)志物

3.1 補(bǔ)體3(complement factor 3, C3) 補(bǔ)體是廣泛存在于血清、組織液和細(xì)胞膜表面的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，其中C3水平在補(bǔ)體系統(tǒng)中最高。肝臟是生成免疫因子的重要器官，隨著肝功能的惡化，肝臟合成補(bǔ)體的能力逐漸降低。在NAFLD中，補(bǔ)體系統(tǒng)的廣泛激活與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系已經(jīng)得到證實[36]，現(xiàn)多研究其在慢性乙型肝炎、ACLF中的作用。在ACLF患者中，研究發(fā)現(xiàn)生存組的C3和C3a的水平明顯高于死亡組，同時C3和C3a水平與MELD和CLIF-C Ofs評分呈負(fù)相關(guān)，這提示補(bǔ)體C3和C3a可能是ACLF的獨(dú)立預(yù)測因子[37]。

3.2 可溶性CD163(sCD163)和可溶性甘露糖受體(soluble mannose receptor, sMR) 肝臟Kupffer細(xì)胞占機(jī)體巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%以上，在病毒性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎的肝臟炎癥和纖維化中起著關(guān)鍵作用[38]。CD163作為血紅蛋白結(jié)合珠蛋白清除劑受體，僅位于巨噬細(xì)胞和某種單核細(xì)胞上，并在脫落后，作為sCD163釋放到循環(huán)中。sMR在人血清中被發(fā)現(xiàn)，是一種主要在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的甘露糖受體的脫落產(chǎn)物，盡管對于該標(biāo)志物研究較少，但在肝病、感染患者的血清中，sMR水平高于健康人群[39-40]。當(dāng)被細(xì)菌和其他促炎細(xì)胞因子刺激時，預(yù)激活的Kupffer細(xì)胞會引發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)，使得血清sCD163和sMR水平升高，從而促進(jìn)ACLF的進(jìn)展。研究[41]表明，炎癥標(biāo)志物sCD163、sMR與MELD評分、CLIF-C ACLF可作為ACLF患者28、90和180 d病死率的預(yù)測因子。這提示肝Kupffer細(xì)胞在ACLF發(fā)生和發(fā)展中的重要性，因此，將巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物，如sCD163、sMR等納入預(yù)后評分(如CLIF-C ACLF和CLIF-C AD)中，可能預(yù)測能力更佳。

3.3 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)沉積蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) NGAL是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(lipocalin-2, LCN2)的基因表達(dá)產(chǎn)物，廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞[42]，作為一種急性期蛋白，可以調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)。當(dāng)腎小管損傷時，腎臟合成NGAL增加，故尿NGAL水平升高，可作為腎功能不全的預(yù)測因子。最近研究[42]發(fā)現(xiàn)，在ACLF患者中，LCN2在肝臟總體表達(dá)顯著上調(diào)，并與INR和膽紅素相關(guān)，這提示肝細(xì)胞損傷可能導(dǎo)致NGAL升高。此外，中性粒細(xì)胞是表達(dá)LCN2的主要細(xì)胞類型，參與抗炎過程，也可以導(dǎo)致血漿NAGL增加。由此，ACLF血漿NGAL升高可能歸因于嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷與中性粒細(xì)胞活化[43-44]，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的器官功能障礙，影響疾病預(yù)后。一項研究[42]結(jié)果顯示，肝硬化患者的NGAL水平顯著增加并與ACLF患者的預(yù)后呈現(xiàn)相關(guān)性。另外，CANONIC研究數(shù)據(jù)[45]亦顯示NGAL是ACLF病死率的重要預(yù)測因子。

4 核酸類標(biāo)志物

miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼微小RNA，其功能是抑制特定的靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)，從而調(diào)節(jié)特定的細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞表型。miRNA通過控制mRNA的穩(wěn)定性或翻譯過程來調(diào)節(jié)表達(dá)，從而影響細(xì)胞的分化、發(fā)育和凋亡[46]。越來越多證據(jù)[47]表明，某些miRNA可能與肝衰竭預(yù)后有關(guān)。其中miRNA-122是一種肝臟特異性miRNA，約占成人肝臟總miRNA數(shù)量的70%。miRNA-122在嚴(yán)重的ACLF和凝血疾病患者中明顯上調(diào)[48]。另有研究[49]發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p、miR-122-3p和miR-328-3p等是ACLF短期死亡的獨(dú)立預(yù)測因子。這為進(jìn)一步研究miRNA在ACLF發(fā)病機(jī)制及預(yù)后中的作用奠定基礎(chǔ)。

5 氧化應(yīng)激標(biāo)志物

氧化應(yīng)激反應(yīng)可以觸發(fā)體內(nèi)細(xì)胞凋亡，是各種疾病發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products, AOPP)是體內(nèi)氧化應(yīng)激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白質(zhì)交聯(lián)物。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，氧化還原反應(yīng)失衡導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化速率急劇增加，導(dǎo)致體內(nèi)AOPP水平明顯升高，同時AOPP主要經(jīng)肝臟清除，在肝功能衰竭時，AOPP清除率降低，導(dǎo)致AOPP產(chǎn)生與清除失衡，加重氧化應(yīng)激過程。同時研究還發(fā)現(xiàn)AOPP能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌TNFα等炎癥因子，加重肝細(xì)胞的凋亡。血清AOPP反映HBV-ACLF患者的氧化應(yīng)激、炎癥狀態(tài)[26]，故可作為預(yù)測HBV-ACLF患者預(yù)后的重要潛在標(biāo)志物。

6 小結(jié)與展望

目前ACLF 缺乏除肝移植以外的有效治療措施，具有高臨床病死率。因此，盡早探尋ACLF早期診斷、預(yù)警、預(yù)測的分子標(biāo)志物至關(guān)重要。血清生物學(xué)標(biāo)志物具有非侵入性、易于檢測、可反映肝損傷程度等特征，有廣闊的臨床應(yīng)用前景。盡管本文總結(jié)了多種預(yù)后相關(guān)指標(biāo)，但可用于臨床實際的標(biāo)志物仍缺乏可靠依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)參考值，需要更多的實驗數(shù)據(jù)和大量的臨床病例來驗證。期待靈敏度更高、特異性更好、便于臨床檢測的預(yù)后標(biāo)志物出現(xiàn)，以提升ACLF患者的多臟器衰竭的防治水平，有效改善ACLF的轉(zhuǎn)歸。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李健、郭曉林負(fù)責(zé)擬定寫作思路；李健、杜亞秋、李德釗、張成港、劉慶夏負(fù)責(zé)檢索文獻(xiàn)，分析資料；季慧范、郭曉林負(fù)責(zé)修改文章并最終定稿。