循環(huán)生物標志物在預(yù)測非小細胞肺癌免疫治療反應(yīng)的研究進展

杜鳳華 梅曉冬

檢查點阻斷免疫療法的出現(xiàn)，使癌癥治療發(fā)生了革命性的變化。目前已經(jīng)有超過七種免疫治療藥物已經(jīng)獲得FDA批準，并具有多種適應(yīng)癥，還有不計其數(shù)的藥物正在進行臨床試驗研究。然而，臨床對免疫治療的反應(yīng)在個體患者和癌癥類型之間存在高度異質(zhì)性。這對臨床醫(yī)生在選擇個性化藥物進行特異性免疫治療提出了挑戰(zhàn)。因此，在治療開始前預(yù)測腫瘤對免疫治療的反應(yīng)性是非常有價值的。最早提出的預(yù)測癌癥免疫治療反應(yīng)的生物標志物是基于PD1和PDL1表達，但其預(yù)測價值似乎僅限于特定的癌癥或患者群體。利用下一代測序技術(shù)對循環(huán)腫瘤細胞和宿主細胞進行單細胞分子分析的最新進展，極大地擴大了潛在有用的預(yù)測生物標志物的范圍。本文回顧了基于生物標志物的無創(chuàng)預(yù)測和腫瘤對免疫治療反應(yīng)治療中監(jiān)測的最新進展，著重總非小細胞肺癌的循環(huán)標志物。

免疫治療概述

循環(huán)液體活檢生物標志物是預(yù)測和跟蹤檢查點阻斷免疫治療反應(yīng)的非侵入性指標，對非小細胞肺癌具有最高質(zhì)量的證據(jù)。目前癌癥免疫治療有三大生物標志物，第一類系反應(yīng)腫瘤炎癥狀態(tài)的生物標志物，即PDL1表達，腫瘤PDL1表達并不能充分表達宿主免疫學和腫瘤微環(huán)境的復雜性，其預(yù)測價值似乎僅限于特定的癌癥或患者群體。第二類標志物則揭示腫瘤的免疫原性，循環(huán)腫瘤DNA、血液腫瘤突變負荷(TMB)、轉(zhuǎn)錄組特征、循環(huán)腫瘤細胞和宿主免疫標志物是最有希望轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的下一代液體活檢生物標志物。第三類標志物系宿主環(huán)境，如微生物環(huán)境等。選擇炎癥生物標志物來預(yù)測腫瘤對檢查點阻斷免疫治療的反應(yīng)，必須要與個體的遺傳背景、腫瘤微環(huán)境和免疫學特征之間的相互關(guān)聯(lián)?；蚪M學和蛋白質(zhì)組學方法的結(jié)合，配合人工智能和下一代測序技術(shù)的進步，將使癌癥免疫治療向個體化醫(yī)學過渡。

癌癥免疫治療的目的是通過免疫檢查點阻斷(ICB)來幫助免疫系統(tǒng)識別并攻擊癌細胞。檢查點阻斷免疫療法(CBI)的研究爆炸式增長，要歸功于其顯著提高了多種癌癥生存率。FDA批準的CBI適應(yīng)癥，包括非小細胞肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌等，以及正在進行的臨床試驗中其他多種腫瘤治療組合。盡管CBI取得了成功，但在將臨床獲益擴大到更多患者方面仍存在一些障礙。雖然檢查點免疫療法對確實達到臨床反應(yīng)的患者效果很好，但也有一部分患者對相同的治療沒有反應(yīng)或反應(yīng)較差。此外，對于哪種客觀指標能夠最好地預(yù)測臨床反應(yīng)，還沒有達成共識。確定這些指標將使臨床醫(yī)生能夠在開始治療前選擇特定的治療方法，并在整個治療過程中對治療策略進行監(jiān)測時，對治療策略進行潛在的調(diào)整和修改。直接從腫瘤標本中獲得的反映腫瘤免疫微環(huán)境和腫瘤細胞內(nèi)在特征的生物標志物，已被研究作為對CBI反應(yīng)的潛在標志物。例如瘤內(nèi)PDL1表達、腫瘤浸潤淋巴細胞密度(TIL)[1]、腫瘤突變負荷(TMB)[2]、DDR(腫瘤損傷修復)[3]等，這些都被認為與CBI的治療效果有關(guān)。然而，這些生物標記物需要侵入性取樣，而且從風險-收益的角度來監(jiān)測治療過程中的腫瘤反應(yīng)并不實用。循環(huán)液體活檢生物標志物最近顯示出作為腫瘤免疫治療反應(yīng)預(yù)測指標的前景，并將隨時間推移逐漸成為趨勢。本篇綜述簡要概述了FDA批準的檢查點阻斷免疫療法、它們的作用機制以及檢查點抑制劑的基本免疫學。然后，綜合近年來發(fā)表的研究成果，確定預(yù)測非小細胞肺癌免疫療法臨床反應(yīng)的潛在生物標志物，并識別有前途的生物標志物以期加快個性化藥物在非小細胞肺癌免疫治療中的應(yīng)用。

作用檢查點抑制劑免疫治療的藥物種類和作用機制是旨在阻斷細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4 (CTLA4)通路或程序性細胞死亡蛋白1通路(PD1/PDL1)的單克隆抗體。目前，F(xiàn)DA批準的癌癥免疫治療藥物有ipilimumab (CTLA4)、nivolumab (PD1)、pembrolizumab (PD1)、atezolizumab (PDL1)、avelumab (PDL1)、durvalumab (PDL1)和cemiplimab (PD1)。Ipilimumab是FDA唯一批準的以CTLA4為基礎(chǔ)的療法，也是第一個上市的免疫療法。在正常的T細胞介導的免疫反應(yīng)中，T淋巴細胞在體內(nèi)巡視，尋找感染、疾病或癌癥的跡象。通過T細胞受體(TCR)識別不健康細胞或抗原遞呈細胞(APCs)上的肽抗原，可導致T細胞活化和增殖。T細胞表面通常也表達PD1和CTLA4，它們是抑制受體，當分別與配體PDL1或CD80/CD86結(jié)合時，可以阻止T細胞活化。腫瘤可能通過異常表達PDL1或CD80/CD86來逃避這種監(jiān)測，這些異常表達可以激活PD1或CTLA4，從而抑制T細胞的活化和增殖。本篇綜述將主要關(guān)注檢查點阻斷免疫療法治療非小細胞肺癌患者的研究。

循環(huán)標志物對免疫治療反應(yīng)

用于預(yù)測免疫治療反應(yīng)的大多數(shù)生物標志物可以分為基因組和蛋白質(zhì)組標志物?；蚪M學研究的例子包括循環(huán)腫瘤細胞的全外顯子組測序,裸細胞游離DNA (cfDNA)或循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)[4]的分析，以及宿主免疫細胞的RNA轉(zhuǎn)錄組特征。蛋白質(zhì)組學標記包括存在于循環(huán)中的可溶性蛋白，如宿主細胞因子和趨化因子，或循環(huán)腫瘤或免疫細胞上的細胞表面標記，如PD1/PDL1和TCRs。另一類可預(yù)測免疫治療反應(yīng)的可溶性生物標志物是外泌體和細胞外囊泡。PDL1表達是第一個被提出的預(yù)測CBI治療反應(yīng)的蛋白組生物標志物，因為許多研究發(fā)現(xiàn)，在CBI患者中，腫瘤通過免疫組織化過度表達PDL1，改善了臨床結(jié)果。然而，大量PDL1水平較低的患者也表現(xiàn)出較強的反應(yīng)，這使得使用PD1/PDL1作為唯一的生物標志物變得復雜。此外，PDL1的評估方法是異質(zhì)性的，這使得比較不同試驗之間的重現(xiàn)性有所不同。其他蛋白質(zhì)組生物標志物與宿主免疫學有關(guān)。例如，中性粒細胞與淋巴細胞比率(NLR)已被發(fā)現(xiàn)是許多實體腫瘤生存的預(yù)后指標。

一、非小細胞肺癌

目前，PDL1是非小細胞肺癌(non -small cell lung cancer, NSCLC)中唯一在臨床應(yīng)用中選擇最可能受益于CBI的患者的生物標志物。目前針對于PD1/PDL1的免疫檢查點抑制劑(ICIs)在非小細胞肺癌的一線、二線甚至早期的臨床治療已經(jīng)得到廣泛證實[5-7]。全外顯子組測序(WES)或癌癥基因面板(CGP)[8]是目前已知的預(yù)測免疫療法反應(yīng)監(jiān)測手段，用于估計突變負荷，預(yù)測PD-1阻滯的臨床療效。研究表明下一代基因測序技術(shù)(NGS)能準確估計TMB, TMB的升高進一步提高了ICIs獲益的可能性。TMB與PD-L1表達無相關(guān)性，兩個變量的預(yù)測能力相似。將TMB和PD-L1表達結(jié)合到多變量預(yù)測模型中，可以獲得更高的預(yù)測能力[9]。多項研究均表明CTC計數(shù)可單獨或者聯(lián)合CYFRA21-1可作為檢測早期肺癌的依據(jù)，其表達與遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可為疾病復發(fā)和轉(zhuǎn)移提供依據(jù)[10]。在對24例接受nivolumab治療的四期NSCLC患者的研究中，PDL1陰性CTCs患者均獲得臨床獲益，而PDL1陽性CTCs患者均經(jīng)歷疾病進展[11]。然而，循環(huán)血液中ctDNA估計的TMB (bTMB)是否與免疫治療的臨床結(jié)果有關(guān)仍有待探索。在一項136名非小細胞肺癌患者研究中,更高的ctDNA突變負荷明顯與不良臨床CBI結(jié)果相關(guān)[12],這表明ctDNA可能反映了與腫瘤DNA不同的基因組特征。腫瘤突變負荷(TMB)，通過全外顯子組測序(WES)或腫瘤基因板(CGP)測量，與免疫治療反應(yīng)有關(guān)[13]。在后來的一項研究中，基于血液的TMB預(yù)測了阿特利珠單抗對NSCLC的臨床益處，并通過對兩項大型隨機試驗的回顧性分析證實了這一點。最近，一種用于肺癌患者篩查的血漿免疫相關(guān)miRNA-signature classifier (MSC)被應(yīng)用，以確定它是否也可以預(yù)測NSCLC對CBI的反應(yīng)，他們發(fā)現(xiàn)MSC檢測與總體和無進展生存相關(guān)[14]。ctDNA水平可以使早期評估免疫治療效果。ctDNA水平的下降是治療效果的早期標志，預(yù)示著接受免疫檢查點抑制劑治療的NSCLC患者的生存期延長?？偟膩碚f，ctDNA是一種非常有前途的非小細胞肺癌生物標志物。目前正在探索免疫宿主相關(guān)的生物標志物作為對CBI反應(yīng)的潛在預(yù)測因子。在最近的一項研究中收集了2015至2016年201例接受nivolumab的患者中，ECOG 性能狀態(tài)≤ 2, ALB(血清白蛋白) <3.7 g/dL, NLR(中性粒細胞與淋巴細胞比率)≥4, ALI(炎癥指數(shù)=BMI×ALB/NLR)<18 、PFS差和早期進展顯著相關(guān)[15]。175例患者接受nivolumab的研究中，多變量分析提示中性粒細胞與淋巴細胞比率(NLR)≥5與患者OS獨立相關(guān)[16]。在一項對70例初治NSCLC患者的研究中，生存期下降與PD1+、PD1+CD3+、PDL1+CD3+、PDL1+CD3+CD8+、PDL2+CD3+、PDL2+CD3+CD4+或PDL2+CD3+CD8+PBMCs水平升高有關(guān)，且細胞因子IL-2和TNF-α與響應(yīng)患者中T細胞上PDL1的表達密切相關(guān)[17]。

二、其他癌種

與非小細胞肺癌相比，其他癌癥的通用生物標志物的研究較少，本文總結(jié)了這些研究的一小部分結(jié)果。在一項對49名黑色素瘤患者的前瞻性研究中，使用定量的19個基因數(shù)字RNA標記(CTC評分)治療后7周內(nèi)CTC評分的下降與無進展生存期的顯著改善相關(guān)[危險比(HR,0.17;P=0.008)]和總生存率(HR, 0.12;P=0.04)[18]。另一項對35例CTLA4和PD1聯(lián)合阻斷治療患者的研究中，從治療前和治療中反復的液體活檢中研究了710個腫瘤相關(guān)基因。從ctDNA中提取的TMB在應(yīng)答者中高于非應(yīng)答者，其截斷值為TMB>23.1。此外，在治療的前3周，TMB的減少超過50%，導致總生存率增加[19]。在頭頸部腫瘤中，抗PD1藥物已成為治療鉑類難治性復發(fā)/轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)的標準藥物。在一項113例HNSCC患者的前瞻性研究中，檢測過表達PDL1的CTCs對HNSCC的預(yù)后有重要意義。與沒有治療結(jié)束時相比，治療結(jié)束時PDL1的過度表達具有較差的存活率[20]。PD-L1在黑色素瘤腫瘤細胞中的表達低于NSCLC或腎細胞癌細胞。PD-1抑制劑治療黑色素瘤患者的較高應(yīng)答率可能與腫瘤相關(guān)炎癥細胞中的PD-L1有關(guān)。炎癥細胞PD-L1表達在黑色素瘤中的預(yù)測作用及生物學意義有待進一步研究[21]。

總結(jié)與展望

本篇綜述，先簡要概述了FDA批準的檢查點阻斷免疫療法及其作用機制，然后總結(jié)了近年來發(fā)表的主要研究結(jié)果，確定了非小細胞肺癌相關(guān)檢查點阻斷免疫療法臨床反應(yīng)的潛在指標預(yù)測。一些研究已經(jīng)確定循環(huán)腫瘤DNA和腫瘤突變負荷是預(yù)后因素。循環(huán)蛋白組學標志物如細胞因子/趨化因子、特異性腫瘤免疫細胞(如中性粒細胞、CD4 T細胞和CD8 T細胞)的數(shù)量或比例也具有較高的預(yù)測價值。作為這些潛在預(yù)測因子的現(xiàn)有證據(jù)，需要共識和標準化才能將這些生物標志物廣泛應(yīng)用于更大的患者群體。除PD1/PDL1外，最有前途的生物標志物策略包括循環(huán)腫瘤DNA和細胞DNA的基因組分析(微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、特異性腫瘤突變、DNA損傷)、腫瘤突變負荷以及宿主免疫學的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組特征。雖然我們的研究重點是預(yù)測非小細胞肺癌對檢查點抑制劑免疫治療反應(yīng)的生物標志物，但其免疫治療模式也正在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中得到很好的探索。目前尚無循環(huán)生物標志物預(yù)測腫瘤對CART細胞免疫治療反應(yīng)的研究，需要做更多的工作來識別這些生物標志物。在更廣泛的非侵入性生物標志物中，最近的兩項研究已經(jīng)確定了基于多模態(tài)靶向成像的腫瘤反應(yīng)生物標志物，稱為放射組學[22,23]。例如，隨著針對各種癌癥的新型示蹤劑的開發(fā)，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)可以成為另一種非侵入性和定量的策略監(jiān)測治療方法。

總之，使用生物標志物的組合來預(yù)測免疫治療療效似乎已經(jīng)成為不可避免的趨勢，特別是對于非小細胞肺癌。問題在于如何組合，并找到對患者最適合的檢測技術(shù)。在未來，基因組學和蛋白質(zhì)組學方法的整合將與人工智能和下一代測序進一步結(jié)合，使非小細胞肺癌免疫療法向個體化醫(yī)療大幅度邁進。