誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在心血管領(lǐng)域的研究進(jìn)展

陳 塵，麥明杰，孫圖成，趙明一，朱 平

［1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510080；2.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080］

提要：隨著生活和醫(yī)療水平的提升，每年心血管疾病的病死率不降提升，隨著干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)也迅速發(fā)展起來(lái)，其衍生產(chǎn)品應(yīng)用到臨床越來(lái)越多的領(lǐng)域。本文綜述了誘導(dǎo)性干細(xì)胞的背景，制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法、安全性、有效性以及制備過(guò)程中遇到的問(wèn)題和挑戰(zhàn)。

2017 年的全球疾病負(fù)擔(dān)研究表明，自1990 年以來(lái)由于人口老齡化和人口增長(zhǎng)的推動(dòng)，包括心血管疾病和癌癥等在內(nèi)的非傳染性疾病的總死亡人數(shù)穩(wěn)步上升，而死于心血管疾病的總死亡人數(shù)最多，其次是腫瘤和慢性呼吸道疾病，在2007-2017 年期間，心血管疾病的總病死率增加了21.1%，缺血性心臟病和腦卒中占心血管疾病的84.9%［1］。如何改變這種情況并降低死亡人數(shù)是很多科學(xué)家思考的問(wèn)題。

干細(xì)胞是一種還未完全分化、發(fā)育不成熟的細(xì)胞，具有自我復(fù)制的能力和再生發(fā)育成各類(lèi)組織器官的潛能。在不同條件下，它可以分化成不同功能的細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細(xì)胞（somatic stem cell，SSC）。根據(jù)發(fā)育潛能將干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞（totipotent stem cell，TSC）、多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）和專(zhuān)能干細(xì)胞（unipotent stem cell，USC）。ESC 來(lái)源于哺乳動(dòng)物胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，同時(shí)具有自我復(fù)制增殖和分化成所有3 個(gè)胚層的細(xì)胞的能力。干細(xì)胞的具體分化和發(fā)育受著多種因素的影響，動(dòng)物ESC 在體外的成功培育為人ESC 應(yīng)用于臨床治療各個(gè)系統(tǒng)疾病奠定了基礎(chǔ)，然而，用動(dòng)物ESC 建立的動(dòng)物疾病模型研究人類(lèi)疾病可能存在物種差異而影響結(jié)果，在臨床廣泛使用人ESC 領(lǐng)域存在倫理問(wèn)題，患者移植后也可能出現(xiàn)組織排斥的問(wèn)題。解決這些問(wèn)題的一種方法是直接從患者細(xì)胞中產(chǎn)生特異性PSC 研究特異性治療。誘導(dǎo)性PSC（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是指將人類(lèi)體細(xì)胞經(jīng)過(guò)導(dǎo)入外源性轉(zhuǎn)錄因子重編程之后所產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞，其與ESC 非常相似。兩種類(lèi)型的細(xì)胞均表達(dá)人多能因子和ESC 表面標(biāo)志物，并具有分化成3 個(gè)胚層的潛力，不同條件下可將iPSCs 誘導(dǎo)分化成為不同的細(xì)胞，自十多年前iPSCs 技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)取得了巨大進(jìn)步，人類(lèi)iPSC 已廣泛應(yīng)用于疾病建模，藥物發(fā)現(xiàn)和干細(xì)胞治療［2］。

近年來(lái)，干細(xì)胞治療已經(jīng)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)多個(gè)領(lǐng)域，包括心血管病領(lǐng)域。iPSC 技術(shù)的發(fā)展拓寬了目前臨床上對(duì)于心血管疾病的治療的方向和手段，有效地改善了干細(xì)胞研究過(guò)程中出現(xiàn)的物種差異、免疫排斥以及潛在的倫理問(wèn)題，擁有巨大的應(yīng)用前景。

1 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的制備

目前已知的一些重編程方法包括（1）核移植；（2）細(xì)胞融合；（3）使用細(xì)胞提取物重編程；（4）直接重編程。早在19 世紀(jì)60 年代，科學(xué)家John Gurdon 做過(guò)從分化成熟的青蛙細(xì)胞中取出細(xì)胞核并注入去核卵母細(xì)胞中最后得到發(fā)育完全的青蛙的實(shí)驗(yàn)，首次證明了體細(xì)胞核的全能性，該實(shí)驗(yàn)也表明，在從細(xì)胞到個(gè)體的分化過(guò)程中，沒(méi)有發(fā)育所必需的關(guān)鍵遺傳物質(zhì)丟失。1997 年，通過(guò)體細(xì)胞核移植（SCNT）克隆綿羊“多莉”，也是將Gurdon 的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用到哺乳動(dòng)物上。2001 年Tada 等將胸腺細(xì)胞和ESC 通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)行雜交，雜合細(xì)胞表現(xiàn)出了多能性。2006年日本科學(xué)家Kazutoshi Takahashi 和Shinya Yamanaka［3］曾報(bào)道，在ESC 培養(yǎng)條件下引入4 種因子：Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4（OSKM 因子），進(jìn)一步誘導(dǎo)來(lái)自小鼠胚胎或成體成纖維細(xì)胞，能培養(yǎng)得到iPSCs，其表現(xiàn)出ESC 的形態(tài)和生長(zhǎng)特性，并表達(dá)ESC 表面標(biāo)志物。這些實(shí)驗(yàn)都體現(xiàn)了體細(xì)胞重編程的可能性。

體細(xì)胞重編程過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，個(gè)體的每個(gè)細(xì)胞都具有基本相同的DNA 序列和遺傳信息，不同的基因表達(dá)影響著細(xì)胞的分化方向?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)基于表觀遺傳學(xué)，例如由DNA 甲基化引起的基因沉默和由組蛋白乙?；蚣谆鸬娜旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的變化［3］。以往的研究表明，在轉(zhuǎn)錄因子中，Oct3/4、Sox2 和Nanog 可能下調(diào)參與誘導(dǎo)細(xì)胞分化的基因表達(dá)，以維持其未分化特性，并且OSKM 這4 個(gè)因子（包括c-Myc）都會(huì)引起表觀遺傳學(xué)的變化，如染色質(zhì)修飾和DNA 甲基化，從而產(chǎn)生iPSC。Nanog、Oct3/4 和Fbx15 的啟動(dòng)子區(qū)域在iPSC和ESC 基因表達(dá)過(guò)程中都有去甲基化［4-5］，體現(xiàn)了表觀遺傳學(xué)對(duì)體細(xì)胞重編程的重要性。

將重編程之后得到的iPSC 應(yīng)用于臨床雖然能解決物種差異、免疫排斥和倫理問(wèn)題，但是否會(huì)有其他影響，例如癌變？全世界的科學(xué)家紛紛展開(kāi)各種設(shè)想和實(shí)驗(yàn)，希望能將iPSC 技術(shù)在臨床應(yīng)用上盡早達(dá)到預(yù)期效果。

以往傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)方法是使用外源性遺傳物質(zhì)，對(duì)自體靶細(xì)胞的基因組存在著潛在影響，可能導(dǎo)致誘導(dǎo)失敗、靶細(xì)胞基因突變，甚至可能出現(xiàn)致癌性，而這就違背了科學(xué)家們研究iPSC 應(yīng)用于臨床的初衷。實(shí)際上，過(guò)去10 年中在小鼠和人類(lèi)細(xì)胞中的其他實(shí)驗(yàn)也表明，其他組的轉(zhuǎn)錄因子組合在將細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)領(lǐng)域同樣有效。作為OSKM 因子之一的Myc，偶爾誘導(dǎo)iPSC 衍生的嵌合體小鼠有腫瘤形成［6］。有研究表明，引入3 種轉(zhuǎn)錄因子（沒(méi)有c-Myc）也成功產(chǎn)生了iPSC，通過(guò)Myc2 產(chǎn)生的iPSC嵌合體小鼠在研究期間沒(méi)有發(fā)生腫瘤［7］。有研究?jī)H僅使用2 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4 和Klf4）即可從成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)出iPSC［4］，因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞比ESC 表達(dá)更高水平的內(nèi)源性Sox2 和c-Myc，這表明為不同種類(lèi)的自體細(xì)胞尋找適當(dāng)且最有效的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子組合，同時(shí)找到轉(zhuǎn)錄因子起作用的DNA 位點(diǎn)，從而提高安全產(chǎn)生iPSC 的效率，是有效地利用源自干細(xì)胞的組織或細(xì)胞來(lái)治療疾病的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。

iPSC 還有其他的制備方法。反轉(zhuǎn)錄病毒載體用于在初代iPSC 中表達(dá)外源重編程因子，仙臺(tái)病毒、腺病毒等均可以用于重編程，這些病毒可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的基因組整合，對(duì)于連續(xù)的基因表達(dá)以及有效的iPSC 產(chǎn)生是有益的。然而，盡管病毒誘導(dǎo)可用于細(xì)胞重編程的基礎(chǔ)研究，但在重編程后存在轉(zhuǎn)基因被重新激活的風(fēng)險(xiǎn)。腺病毒載體可降低這種風(fēng)險(xiǎn)，但不能降低到臨床應(yīng)用的水平，并且重編程效率低。仙臺(tái)病毒是單鏈的RNA 在細(xì)胞核外進(jìn)行復(fù)制，被認(rèn)為是最安全的病毒方法［8］。這為其他科學(xué)家開(kāi)展更多實(shí)驗(yàn)研究如何生成更安全的iPSC 衍生的臨床產(chǎn)品提供了思路，奠定了基礎(chǔ)。

還有科學(xué)家通過(guò)用微核糖核酸轉(zhuǎn)染的方法重新編碼體細(xì)胞，以避免使用病毒載體將基因組整合到宿主基因組中，并發(fā)現(xiàn)使用三種成熟的微核糖核酸（mir-200c、-302s 和-369s）直接轉(zhuǎn)染小鼠和人類(lèi)細(xì)胞，可以得到表達(dá)水平更高的ESC 和iPSC，并且可降低突變率和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［9］。

iPSC 的制備與免疫反應(yīng)也有一定關(guān)聯(lián)。早期已有報(bào)道，toll 樣受體3（TLR3）是重編程所必需的［10］，并且白細(xì)胞介素-6（IL-6）可促進(jìn)重編程［11］。還有研究表明，干擾素-g可能阻斷內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件或其他轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而阻止多能狀態(tài)的激活，此外，干擾素-g 的抑制作用僅表現(xiàn)在過(guò)渡到完全多能的最終階段，而不是在早期階段［12］。有趣的是，據(jù)報(bào)道，ESC 具有減弱先天免疫的特性，這表明先天免疫反應(yīng)可能與多能性不相容［13］。

在產(chǎn)生iPSC 的過(guò)程中，有些小分子化合物能促進(jìn)誘導(dǎo)出iPSC。根據(jù)研究表明，目前體細(xì)胞重編程過(guò)程中起促進(jìn)作用的小分子化合物主要有CHIR99021、丙戊酸（VPA）、Repsox 等。最早發(fā)現(xiàn)的化合物是丙戊酸，它是一種作用于組蛋白去乙?；福℉DAC）的抑制劑，丙戊酸通過(guò)促進(jìn)組蛋白乙?；?，改變細(xì)胞整體轉(zhuǎn)錄活性，從而將重編程效率分別能提高50 倍（三因子誘導(dǎo)）或100 倍（四因子誘導(dǎo)）［14］。有研究組發(fā)現(xiàn)，iPSC 誘導(dǎo)常用的成纖維細(xì)胞在重編程過(guò)程中會(huì)發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition，MET），與正常發(fā)育分化過(guò)程中常見(jiàn)的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（EMT）過(guò)程相反；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路是MET 所必需的信號(hào)通路，TGF-β信號(hào)通路的抑制劑A-83-01 可以促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，影響重編程速度；該研究還指出，鄧宏魁實(shí)驗(yàn)室在早期使用Oct4 一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)添加丙戊酸、GSK-3β信號(hào)通路的抑制劑CHIR99021、TGF-β信號(hào)通路抑制劑616452（Repsox）和LSD-1 抑制劑Parnate，這4 種小分子誘導(dǎo)出了小鼠iPSC，避免了使用原癌基因Klf4 和c-Myc，從而提高了安全性［15-16］。還有許多研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝，小分子化合物直接或間接地激活糖酵解或者抑制線粒體的氧化磷酸化，如使用2，6－二磷酸果糖（F2，6P，PFK1activator）、2，4－二硝基酚（DNP，mitochondriadecoupler）、槲皮素和PS48 這些化合物來(lái)提高重編程效率［17-19］。

至于其他問(wèn)題，例如除了成纖維細(xì)胞是否有其他體細(xì)胞可以重編程生成iPSC？雖然在產(chǎn)生iPSC 的實(shí)驗(yàn)研究中大部分將人成纖維細(xì)胞上作為重編程的體細(xì)胞來(lái)源，但是已經(jīng)報(bào)道了從其他體細(xì)胞類(lèi)型如胰腺β細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞中成功產(chǎn)生iPSC。值得注意的是，血液來(lái)源的細(xì)胞，如T 淋巴細(xì)胞，為重編程提供了一種易于獲取和非侵入性的供體細(xì)胞［4,20-22］。Maya 等［20］在2015年限制性乳酸鹽純化從人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生iPSC，能夠根據(jù)藥物測(cè)試或再生醫(yī)學(xué)的需要而產(chǎn)生的大量高純度的心肌細(xì)胞。Katharina 等［23］為了增強(qiáng)人羊水細(xì)胞（AFC）的增殖能力，通過(guò)用由OCT4、SOX2、KLF4 和c-MYC（OSKM）組成的逆轉(zhuǎn)錄病毒混合物轉(zhuǎn)導(dǎo)大量原代人羊水細(xì)胞，從而衍生出iPSC，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后約7 d 出現(xiàn)AFiPSC 集落，并且比其他人觀察到的成纖維細(xì)胞衍生的iPSC 早約兩周出現(xiàn)。Yasuaki 等［24］也研究了來(lái)自人類(lèi)第三磨牙的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可以通過(guò)三種轉(zhuǎn)錄因子OCT 3/4、SOX2 和KLF4 的轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)重新編程，最后成功誘導(dǎo)iPSCs。雖然任何人類(lèi)自體細(xì)胞在理論上都可以重編程為iPSC，但許多組織細(xì)胞獲得的有創(chuàng)性（如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等）阻礙了進(jìn)一步的研究，為了解決這一問(wèn)題，Zhou 等［25］提出了從尿液中存在的脫落腎上皮細(xì)胞產(chǎn)生人類(lèi)iPSC 的方法，該方法在許多情況下是有利的，因?yàn)槟蚣?xì)胞的分離很簡(jiǎn)單（30 mL 尿液就足夠了），成本有效且通用（可應(yīng)用于任何年齡，性別和種族）。此外，整個(gè)過(guò)程相當(dāng)快，尿細(xì)胞培養(yǎng)約2 周，重編程3-4 周，使用外源因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送，iPSC 集落的產(chǎn)量通常高達(dá)4%。尿iPSC（UiPSC）也顯示出極好的分化潛能，因此成為了從正常個(gè)體或遺傳疾病患者（包括影響腎臟的患者）生產(chǎn)自體PSC 的良好選擇。LEE 等［26］在2017年提出用非整合方法重新編程患有唐氏綜合征的患者的尿源細(xì)胞產(chǎn)生iPSCs，這也降低了這些細(xì)胞出現(xiàn)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的突變的可能性。

然而，值得注意的是，人和小鼠ESC 的維持需要不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路和培養(yǎng)條件。LIF/Stat3 是維持小鼠ESCs中未分化狀態(tài)所必需的，BMP4 可抑制MEK/ERK 分化途徑，從而導(dǎo)致小鼠ESC 自我更新。相反，人ESC 和人iPSC不需要人類(lèi)LIF，并且多能性的維持似乎主要依賴(lài)于FGF和MEK/ERK 信號(hào)傳導(dǎo)，這表明培養(yǎng)多能細(xì)胞的物種特異性要求［27］。

2018 年，Zeng 等［28］報(bào)道了microRNAs 是iPSC 產(chǎn)生和分化的重要調(diào)控因子。miRNA通常與RNA誘導(dǎo)的沉默蛋白復(fù)合物相關(guān)，這種作用在高等真核生物的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中起主要作用。miRNA 的應(yīng)用可以提高iPSC 產(chǎn)生的效率，使iPSC 集落數(shù)量的顯著增加。此外，miRNA 誘導(dǎo)的PSC（miR-iPSC）可以比傳統(tǒng)重編程實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞更快地獲得。目前miRNA 誘導(dǎo)的PSC 已被用于研究和治療各種疾病。

iPSC 的制備目前還有很多值得探索的地方，雖然自體取材誘導(dǎo)的iPSC 有更高的安全性和更低的免疫排斥問(wèn)題，但是低效率性和低產(chǎn)出率也阻擋了iPSC 在臨床上的廣泛應(yīng)用，如何解決這一問(wèn)題，是許多科學(xué)家即將研究的方向。

2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在心血管的臨床應(yīng)用

人類(lèi)iPSC 技術(shù)在人類(lèi)疾病建模，藥物發(fā)現(xiàn)和干細(xì)胞治療領(lǐng)域具有巨大潛力，而這種潛力才剛剛開(kāi)始實(shí)現(xiàn)。iPSC 技術(shù)引起了人們對(duì)再生醫(yī)學(xué)潛在適用性的極大興趣。第一項(xiàng)評(píng)估人類(lèi)iPSC 衍生細(xì)胞的臨床研究始于2014 年。該研究使用人類(lèi)iPSC 衍生的視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞治療黃斑變性，據(jù)報(bào)道該治療可改善患者的視力［29］。

2.1 疾病建模

源自患者的iPSC 模型使得可以在培養(yǎng)皿中重現(xiàn)疾病表型和病理學(xué)，從患者衍生的iPSC 分化的細(xì)胞可呈現(xiàn)分子和細(xì)胞表型。如果已知負(fù)責(zé)疾病表型的基因，則可以通過(guò)基因編輯方法確認(rèn)表型是否與疾病真正相關(guān)［30］。

近年來(lái)，基于人類(lèi)iPSC 的心臟病模型的研究已經(jīng)迅速增加，有研究提出，鈉/鉀通道功能障礙引起的長(zhǎng)QT 綜合征是一組與離子通道功能異常有關(guān)的遺傳性疾病，其特征是心電圖上QT 間期延長(zhǎng)和因?yàn)槭倚孕穆墒С?dǎo)致心源性猝死的高風(fēng)險(xiǎn)［31］。長(zhǎng)QT 綜合征（LQTS）可發(fā)生威脅生命的室性心動(dòng)過(guò)速（室速）。尖端扭轉(zhuǎn)型室速可導(dǎo)致暈厥和心源性猝死，病死率高達(dá)50%［32］。兩種最常見(jiàn)的疾病形式是LQTS1 和LQTS2，占所有患者的40%～55%和30%～35%。這些形式的疾病是由復(fù)極化鉀通道的α-亞基中的功能喪失突變引起的。LQTS1 和LQTS2 分別來(lái)自KCNQ1 和KCNH2 基因的突變，這些基因編碼介導(dǎo)延遲整流鉀電流的兩種不同鉀電流的α-亞基。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出基于iPSC 的這兩種突變模型。該研究還報(bào)道了多種心律失常和心肌病，均建立了相應(yīng)的疾病模型。對(duì)于未知的基因突變的疾病，iPSC 的效用不太明顯。如果在患者心肌細(xì)胞中存在可辨別的功能缺陷，則這些可能存在于源自患者特異性iPSC 的心肌細(xì)胞中，并且基于iPSC 的體外疾病模型的創(chuàng)建很復(fù)雜。此外，由iPSC 衍生的心肌細(xì)胞尚不成熟，而除了先天性心臟病以外，大部分心臟疾病是發(fā)生在成體成熟甚至衰老的心肌細(xì)胞中的，誘導(dǎo)的幼稚iPSC 并不能很好地研究這些疾病的發(fā)展機(jī)制。因此，能夠產(chǎn)生與成體心肌細(xì)胞具有更大相似性的細(xì)胞的方案的開(kāi)發(fā)是iPSC 心臟病模型的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

2.2 藥物發(fā)現(xiàn)

除了使用人類(lèi)iPSC 模型研究疾病發(fā)展機(jī)制，還可以進(jìn)行藥物篩選和治療效果的檢測(cè)，并且已經(jīng)使用表型或基于靶標(biāo)的篩選鑒定了潛在的治療一些疾病的候選藥物。iPSC 模型還可以用來(lái)篩查藥物毒性。新藥的開(kāi)發(fā)成本非常高，高成本主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過(guò)程中的失敗，尤其是后期臨床試驗(yàn)中的失敗，而這些失敗又常常是由于意外的副作用。許多新的候選藥物在臨床前試驗(yàn)中出現(xiàn)了不可預(yù)測(cè)的副作用，其中心臟和肝臟毒性尤其令人擔(dān)憂(yōu)。阿霉素是常見(jiàn)的化療藥物，具有與劑量相關(guān)的心臟毒性，可導(dǎo)致部分患者心臟衰竭。但是，哪些患者會(huì)發(fā)生阿霉素引起的心臟毒性是不可預(yù)測(cè)的，可以運(yùn)用患者特異性iPSCs 衍生的心肌細(xì)胞，在細(xì)胞水平預(yù)測(cè)患者是否發(fā)生心臟毒性。

因此，人們對(duì)開(kāi)發(fā)可以更有效地預(yù)測(cè)候選藥物引起嚴(yán)重副作用的可能性的方法有相當(dāng)大的興趣，從而能夠選擇由于后期試驗(yàn)中的毒性而不太可能失敗的候選物。

2.3 干細(xì)胞治療

目前干細(xì)胞應(yīng)用于治療心臟疾病領(lǐng)域主要是涉及修復(fù)損傷和再生領(lǐng)域，除了其直接的組織再生作用外，干細(xì)胞還可能通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子而產(chǎn)生臨床影響。干細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)通過(guò)多種機(jī)制的組合改善心臟功能，例如減輕組織損傷，抑制纖維化重構(gòu)，促進(jìn)血管生成，動(dòng)員宿主組織干細(xì)胞和減少炎癥。干細(xì)胞分泌因子的心臟保護(hù)作用機(jī)制非常重要，目前已知有b 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-10、血小板衍化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，胸腺素-β4、Wnt5a、血管緊張素-1 和血管緊張素-2，趨化因子-1 和促紅細(xì)胞生成素［8］。

將iPSC 衍生出的心肌細(xì)胞移植到心肌梗死區(qū)域以補(bǔ)充缺血受損死亡的心肌細(xì)胞從而維持心肌的基本功能，或iPSC 衍生的內(nèi)皮細(xì)胞移植于病變的血管，從而恢復(fù)供血都是全世界科學(xué)家一直在做的嘗試。Schenke 等［8］用小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSC 通過(guò)形成胚狀體（embryoid bodies，EBs），誘導(dǎo)出了功能性心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞。這種由iPSC 誘導(dǎo)出來(lái)的心肌細(xì)胞不僅具有典型的心肌細(xì)胞標(biāo)志物，而且還能產(chǎn)生收縮反應(yīng)。隨后，Nelson 等［33］將iPSC 植入子宮，觀察到iPSCs 在子宮內(nèi)分化為心臟細(xì)胞，將這些心臟細(xì)胞植入受損心臟后，發(fā)現(xiàn)了重新構(gòu)建的心臟、血管平滑肌、內(nèi)皮組織具有心肌細(xì)胞的收縮性、心室壁厚度和電位穩(wěn)定性等特征，然而開(kāi)展臨床上移植干細(xì)胞的療效實(shí)驗(yàn)未得到成功結(jié)果。2001 年，Lee 等［？］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述了作為單層的人iPSC 的有效心臟分化的14 d 方案，這個(gè)方案誘導(dǎo)的細(xì)胞通常產(chǎn)生混合細(xì)胞群，其中超過(guò)50%是心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。當(dāng)iPSC 分化時(shí)，將來(lái)自該方案第6 天的細(xì)胞注射到大鼠心臟的梗死周?chē)鷧^(qū)域；在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎和再灌注后，能夠顯示人iPSC 衍生的細(xì)胞移植后，分化成心肌細(xì)胞和平滑肌，并且在梗死后持續(xù)至少10 周。注射iPSC 衍生細(xì)胞的心臟顯示出在心肌梗死后保護(hù)避免功能下降的非顯著趨勢(shì)，通過(guò)10 周的磁共振成像評(píng)估，使得iPSC 處理的心臟中10 周的射血分?jǐn)?shù)為62%～4%，與對(duì)照梗死心臟相比，射血分?jǐn)?shù)只有45%～9%（P＜0.2）?？傊?，該實(shí)驗(yàn)證明了人類(lèi)iPSC 的有效分化，其產(chǎn)生了保留在梗死的大鼠心臟中的細(xì)胞，并且在缺血性損傷后減少了心臟的重構(gòu)。這是將iPSC 應(yīng)用于臨床治療心臟疾病重要的一步。2014 年，Lei 等［34］將人iPSC 移植到豬的心肌梗死模型上，結(jié)果也證明移植細(xì)胞能發(fā)育成功形成良好的心肌細(xì)胞和血管，可明顯改善左心室壁應(yīng)力、梗死面積、收縮期增厚分?jǐn)?shù)、血管密度和ATP 轉(zhuǎn)換率。

直接重編程方法涉及將人成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為其他譜系特異性細(xì)胞，例如神經(jīng)元，不會(huì)消除細(xì)胞衰老標(biāo)記物。實(shí)際上，通過(guò)直接重編程從老化的成纖維細(xì)胞衍生的神經(jīng)元維持細(xì)胞年齡，因此，提供了替代的細(xì)胞模型來(lái)研究與年齡相關(guān)的疾病。直接轉(zhuǎn)換迫使靶體細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）表達(dá)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子并將一個(gè)體細(xì)胞狀態(tài)重編程為另一個(gè)體細(xì)胞狀態(tài)而不通過(guò)iPSC 狀態(tài)。這又為疾病的建模提供了方向，以后對(duì)于成熟體細(xì)胞出現(xiàn)的非遺傳性疾病，可以嘗試用直接轉(zhuǎn)換的方法產(chǎn)生成熟的iPSC，以便研究發(fā)病機(jī)制與治療方案。對(duì)干細(xì)胞治療也有很大的推動(dòng)作用。

3 小 結(jié)

iPSC 作為同時(shí)擁有自我更新以及多向分化的能力的細(xì)胞，被寄予著人類(lèi)從心血管疾病中延緩生命的厚望。從多年前的體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的啟發(fā)研究到十多年前第一次用重編程體細(xì)胞誘導(dǎo)出iPSC 的實(shí)驗(yàn)，都為干細(xì)胞研究的進(jìn)步奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，在全世界掀起了挖掘干細(xì)胞潛能的風(fēng)潮。解決的倫理、免疫排斥等問(wèn)題又再次肯定了iPSC的重要性，在iPSC 誘導(dǎo)過(guò)程中所需因子的減少到可以使用非整合病毒等基因編輯等方法，是無(wú)數(shù)實(shí)驗(yàn)失敗成功的結(jié)果，也是人類(lèi)在干細(xì)胞研究的一大進(jìn)步，CRISPR-Cas9技術(shù)等輔助技術(shù)的開(kāi)發(fā)又能大大縮短干細(xì)胞進(jìn)展所需的時(shí)間。除了iPSC 的制備，重中之重一直是成功的將iPSC廣泛而安全的應(yīng)用于臨床，為人類(lèi)生命做出巨大貢獻(xiàn)，疾病建模和藥物檢測(cè)在干細(xì)胞應(yīng)用中越發(fā)出彩的同時(shí)，不斷出現(xiàn)的新方法比如直接轉(zhuǎn)換體細(xì)胞等，雖然看似跳過(guò)了iPSC 狀態(tài)，其實(shí)是iPSC 的衍生發(fā)展，也同樣具有廣闊的前景，國(guó)外也開(kāi)展了iPSC 衍生產(chǎn)品應(yīng)用于臨床患者的研究，也期待臨床使用iPSC 衍生細(xì)胞治療心血管疾病的研究結(jié)果能讓干細(xì)胞研究譜寫(xiě)出新的篇章。