基于CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建小鼠胚胎干細(xì)胞雙熒光標(biāo)記細(xì)胞系△

姜浩東，匡俊企，翟梓蔚，賽喜雅拉圖，朱爍基，陳寄梅，朱 平，

［1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；2.中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣州 510530；3.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080］

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是來(lái)自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能性細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，在一定條件下可以分化成體內(nèi)所有細(xì)胞類(lèi)型［1-2］，為早期胚胎發(fā)育、再生醫(yī)學(xué)、體外疾病模型構(gòu)建等研究提供了良好的載體［3-5］。多種轉(zhuǎn)錄因子、表觀(guān)遺傳修飾因子、信號(hào)蛋白等在ESCs 維持更新和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、穩(wěn)定的表觀(guān)遺傳狀態(tài)和特定的細(xì)胞周期譜也是將ESCs與高度分化的體細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)的特征［6-9］。然而，ESCs 這些特性背后的分子機(jī)制還不完全清楚。p53 是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子和抑癌因子，對(duì)維持機(jī)體基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要［10-11］。在無(wú)應(yīng)激條件下，p53 在體細(xì)胞內(nèi)保持低表達(dá)水平，在多種應(yīng)激壓力和致癌因素介導(dǎo)下，p53 可通過(guò)各種轉(zhuǎn)錄后修飾使其表達(dá)量上調(diào)并通過(guò)直接調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因如細(xì)胞周期阻滯［12-13］（p21）、凋亡［14］（Puma、Noxa）、衰老［15］（PAI-1）等來(lái)保持體細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。ESCs在生長(zhǎng)特性、分化能力、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、代謝特征等方面與癌細(xì)胞具有相似處，但p53 在ESCs 中的作用目前尚不完全清楚。

Nanog是小鼠ESCs（mouse embryonic stem cells，mESCs）多能性標(biāo)志之一，對(duì)維持mESCs 多能性狀態(tài)十分重要［16-17］。Nanog 是mESCs 核心多能性標(biāo)志中唯一在細(xì)胞間存在異質(zhì)性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，Chambers［18］首次報(bào)道了這一現(xiàn)象并證實(shí)Nanog 的表達(dá)在細(xì)胞間存在異質(zhì)性。此外，Chambers 還發(fā)現(xiàn)Nanog 低表達(dá)的細(xì)胞雖然仍可形成克隆，但是其形成克隆的數(shù)量顯著低于Nanog 高表達(dá)細(xì)胞。Nanog 敲除不影響體外培養(yǎng)過(guò)程中mESCs 自我更新及向三胚層分化的能力，但在體內(nèi)發(fā)育過(guò)程中，不能形成生殖細(xì)胞。后續(xù)有多項(xiàng)研究［19-23］對(duì)Nanog 異質(zhì)性進(jìn)行了探討，但其背后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

基因編輯技術(shù)是精準(zhǔn)研究基因功能的一個(gè)重要手段，基因編輯手段經(jīng)過(guò)多代發(fā)展，已由最初的鋅指核酸酶（ZFNs）［24］、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）［25］介導(dǎo)的基因編輯發(fā)展至利用CRISPR-Cas9 技術(shù)［26-27］介導(dǎo)的基因編輯，CRISPR-Cas9技術(shù)具有制作簡(jiǎn)單、周期短、突變效率高以及成本低等特點(diǎn)，可根據(jù)不同策略靈活實(shí)現(xiàn)基因的敲除及敲入。而基于基因敲入的熒光報(bào)告基因細(xì)胞系的構(gòu)建是研究基因功能的重要工具，本研究采用CRISPR-Cas9 基因敲除結(jié)合同源重組的方法構(gòu)建了小鼠ESCsp53-EGFP、Nanog-mcherry 雙熒光標(biāo)記細(xì)胞系，并在此基礎(chǔ)上對(duì)p53 在mESCs 中的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠ESCs 細(xì)胞系（129）、飼養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑與儀器包括N2-supplement（gibco）、B27-supplement（gibco）、非必須氨基酸（non-essential amino acids，NEAA）（gibco）、谷氨酰胺（gibco）、丙酮酸鈉（gibco）、β-巰基乙醇（2-ME）（gibco）、小分子化合物PD0325901（MCE）、小分子化合物CHIR99021（MCE）、小鼠白血病抑制因子（mouse leukemia inhibitory factor，MLIF）（Millipore）、Knock-Out DMEM（gibco）、高糖DMEM（gibco）、胎牛血清（RMBI，NTC）、0.25%胰酶（gibco）、限制性?xún)?nèi)切酶（NEB）、10×NEB Buf2（NEB）、Solution I（NEB）、篩選抗生素puro、blasticidin（Thermo Scientific）、質(zhì)粒小提試劑盒（天根）、lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen）、OptiMEM（gibco）、NP40 裂解液（Thermo Scientific）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑（Vazyme）、T7 內(nèi)切酶鑒定試劑（NEB）、小鼠p53 抗體（cell signaling technoligy）、小鼠Nanog抗體（Bethyl Laboratories）、PCR 儀（BIO-GENER）、金屬?。▕W盛）、感受態(tài)細(xì)胞、分光光度計(jì)（天根）、生物安全柜（Thermo Scientific）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）、流式細(xì)胞分析儀（BD LS-RFortessa X-20）、流式細(xì)胞分選儀（BD FACSAria Ⅲ）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胚胎干細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與傳代 飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基：10%胎牛血清（NTC）、NEAA（100×）、谷氨酰胺（100×）、高糖DMEM。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（serum+2i+lif）：15%胎牛血清（RMBI）、NEAA（100×）、谷氨酰胺（100×）、丙酮酸鈉（100×）、β-巰基乙醇（0.1 mmol/L）、PD0325901（2 000×）、CHIR99021（2 000×）、mLif（5 000×）、高糖DMEM?；蚓庉嫾?xì)胞維持培養(yǎng)基（N2+B27+2i+lif）：N2（200×）、B27（100×）、NEAA（100×）、谷氨酰胺（100×）、丙酮酸鈉（100×）、β-巰基乙醇（0.1 mmol/L）、PD0325901（2 000×）、CHIR99021（2 000×）、mLif（5 000×）、高糖DMEM與Knock out DMEM 1：1 混合。細(xì)胞復(fù)蘇：提前1 d 復(fù)蘇飼養(yǎng)層細(xì)胞以合適密度種下，并用10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，待飼養(yǎng)層細(xì)胞貼壁后，以serum+2i+lif 培養(yǎng)基復(fù)蘇mESCs 并以合適密度種下，密度合適即傳代。細(xì)胞傳代：培養(yǎng)皿提前用0.1%明膠包板0.5 h 以上，DPBS 洗滌細(xì)胞后加入0.25%胰酶消化，離心后重懸細(xì)胞，以合適比例種下，密度合適即傳代。

1.3.2 p53-sgRNA 基因敲入質(zhì)粒構(gòu)建，轉(zhuǎn)染及T7內(nèi)切酶切割鑒定 依據(jù)NCBI 基因序列在sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站（CHOPCHOP，http：//chopchop.cbu.uib.no/）設(shè)計(jì)3 對(duì)sgRNA，選取原則參考網(wǎng)站排名及切割效率，引物上下游兩端加入Bbs1 酶切位點(diǎn)，將引物退火后［退火條件：正鏈3 μL（100 μmol/L）、負(fù)鏈3 μL（100 μmol/L）、10×NEB Buffer2 5 μL、H2O 39 μL，退火程序?yàn)?5℃（10 min），95℃～85℃（每秒減1℃），85℃～25℃（每秒減1℃），16℃（保存）與Bbs1 酶切后的PX330 載體連接［連接條件：Solution I 5 μL、退火片段4 μL、載體（50 ng），16 ℃2 h］，提前取感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，向連接產(chǎn)物中加入30 μL 感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min，隨后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌涂布棒將其涂在含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，倒置放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，隨后分裝5 mL 含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，將單個(gè)菌落挑至培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h，用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，并送測(cè)序。選擇測(cè)序正確的質(zhì)粒，經(jīng)由脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)入mESCs，轉(zhuǎn)染體系：在24 孔板中，optiMEM（50 μL/孔）、sgRNA（2 μg/孔）與p3000（1.5 μL/孔）混合后加入lipo3000（1.5 μL/孔）與optiMEM（50 μL/孔）的混合物，靜置10～15 min，懸浮轉(zhuǎn)染mESCs，細(xì)胞密度為5×104/孔，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基為serum+2i+lif 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染8 h 后換液，36 h 后收樣并用20 μL NP40 裂解液裂解（裂解條件為56℃，99℃10 min），以裂解產(chǎn)物為模板，利用設(shè)計(jì)好的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行T7內(nèi)切酶鑒定，跑膠判斷條帶是否正確。

1.3.3 p53-donor 載體構(gòu)建，共轉(zhuǎn)染，篩選及敲入鑒定 根據(jù)選擇的sgRNA 切割位點(diǎn)，利用同源重組的原理將小鼠基因組上切割位點(diǎn)上下游各1 000 bp（去除轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)）構(gòu)建至D5S donor 載體上，經(jīng)過(guò)重組、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌擴(kuò)增、質(zhì)粒提取并經(jīng)測(cè)序正確后，與sgRNA 以脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方式懸浮轉(zhuǎn)染mESCs，轉(zhuǎn)染體系為8 h 后換液，48 h 后加含嘌呤霉素的培養(yǎng)基（2 μg/mL）篩選，篩選后傳代并挑單克隆，將單克隆一傳二傳代，分別用于保種與鑒定。

1.3.4 p53EGFP、Nanogmcherry 雙熒光報(bào)告細(xì)胞系構(gòu)建 在純合p53EGFP/EGFP 敲入細(xì)胞系構(gòu)建基礎(chǔ)上，基于同樣的原理，在Nanog 啟動(dòng)子后方插入紅色熒光蛋白mcherry，首先根據(jù)Nanog 終止密碼子附近基因組序列設(shè)計(jì)sgRNA 并構(gòu)建sgRNA，經(jīng)過(guò)sgRNA 切割效果驗(yàn)證后選定合適的sgRNA 并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并構(gòu)建Nanog-donor 載體，donor 載體構(gòu)建選用Blastcidin 作為篩選抗性，隨后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雙載體進(jìn)行熒光蛋白表達(dá)基因插入操作，使用Blastcidin 進(jìn)行細(xì)胞篩選（飼養(yǎng)層細(xì)胞因其無(wú)分裂能力，故可通過(guò)多次傳代將其從靶細(xì)胞中去除），最后進(jìn)行純雜合驗(yàn)證后得到純合及雜合p53EGFP、Nanogmcherry 雙熒光報(bào)告細(xì)胞系。

1.3.5 免疫熒光 提前制備24 孔板細(xì)胞爬片，用0.1%明膠包板并種下細(xì)胞，待合適密度后用DPBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛500 μL 固定0.5 h，DPBS 洗滌1 次，500 μL 封閉通透液作用40 min，DPBS 洗滌1 次，用封閉通透液按合適比例配置一抗（p53 1∶2 000，Nanog：1000）并在濕盒內(nèi)將玻片細(xì)胞面朝下孵育1.5～2.0 h，DPBS 洗滌4 次，每次5 min，用封閉通透液配置二抗（1∶500），濕盒內(nèi)避光孵育1.0～1.5 h，DPBS 洗滌5 次，每次5 min，用封閉通透液配置DAPI（1∶4 000），將玻片細(xì)胞面朝上放于原孔中，加入DAPI 后染色1 min，DPBS 洗滌3 次，每次5 min，將玻片細(xì)胞面朝下置于滴有封片劑的蓋玻片上，4℃避光報(bào)存。

1.3.6 流式細(xì)胞分析 用0.25%胰酶將敲入細(xì)胞系完全消化成單細(xì)胞，用DPBS 重懸至合適密度后利用流式細(xì)胞分析的方法分析敲入細(xì)胞的綠色熒光蛋白發(fā)光強(qiáng)度在細(xì)胞群體內(nèi)的分布情況。

1.3.7 流式細(xì)胞分選 用0.25%胰酶消化細(xì)胞后，用分選液（1 mmol/L EDTA+1%BSA）重懸細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)度用流式分選儀將選定細(xì)胞分選出來(lái)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 p53-EGFP knock-in 細(xì)胞系構(gòu)建策略

在NCBI 上下載小鼠p53 基因組序列，將終止密碼子附近100 bp 左右序列復(fù)制到sgRNA 設(shè)計(jì)網(wǎng)站中，綜合考量切割位點(diǎn)及預(yù)期切割效率，切割位點(diǎn)距離終止密碼子越近，預(yù)期切割效率最高為優(yōu)選，選擇三條sgRNA 作為候選sgRNA，并依次經(jīng)過(guò)退火連入pX330 載體中進(jìn)行初步切割效果驗(yàn)證。選定合適的sgRNA 并將切割位點(diǎn)下游1 000 bp 的基因組序列作為同源重組載體的3′arm，而將終止密碼子上游1 000 bp 作為同源重組載體的5′arm，完整構(gòu)建p53 基因敲入的同源重組載體。sg-RNA載體及Donor 載體如圖1。

圖1 p53-EGFP knock-in 細(xì)胞系構(gòu)建策略圖（A：sgRNA 設(shè)計(jì)位點(diǎn)；B：基于同源重組原理插入熒光蛋白及Donor 載體示意圖；C：sgRNA 載體示意圖）

2.2 p53-EGFP 敲入鑒定策略及鑒定結(jié)果

切割效率鑒定首先要利用T7 內(nèi)切酶可以識(shí)別sgRNA 切割位點(diǎn)的特點(diǎn)，利用sgRNA 載體轉(zhuǎn)染小鼠ESCs，經(jīng)puro 篩選后利用NP40 裂解液處理后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，切割效率鑒定上下游引物距離切割位點(diǎn)距離相差100 bp，T7 內(nèi)切酶與PCR 產(chǎn)物作用后跑膠，選擇有明顯切割條帶的sgRNA。挑選經(jīng)過(guò)雙載體共轉(zhuǎn)染及puro 篩選后存活的小鼠ESCs 單克隆，并一傳二分別用于保種及鑒定。使用預(yù)先設(shè)計(jì)在5′arm 同源臂、EGFP、3′arm 同源臂的鑒定引物進(jìn)行p53-EGFP knock-in 細(xì)胞系純合、雜合鑒定，若為純合細(xì)胞，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳可鑒定出單個(gè)長(zhǎng)度為1 837 bp 的條帶，即鑒定引物PF與插入片段設(shè)計(jì)的引物PR-1之間的片段，未敲入細(xì)胞的條帶長(zhǎng)度為1 171 bp，即鑒定引物PF與插入片段設(shè)計(jì)的引物PR-2 之間的片段，而雜合細(xì)胞則同時(shí)出現(xiàn)上述兩個(gè)條帶（圖2）。

圖2 p53-EGFP knock-in 細(xì)胞系敲入鑒定及純雜合鑒定圖（A：sg-RNA 切割效果驗(yàn)證策略；B：純雜合敲入驗(yàn)證策略；C：sg-RNA 切割效果驗(yàn)證結(jié)果；D：純雜合敲入驗(yàn)證結(jié)果）

2.3 小鼠胚胎干細(xì)胞中p53 表達(dá)具有異質(zhì)性且與Nanog 表達(dá)互斥

經(jīng)過(guò)鑒定得到p53-EGFP 純合和雜合細(xì)胞系，倒置熒光顯微鏡下可以看到純合、雜合細(xì)胞系與野生型對(duì)照細(xì)胞相比，有一定程度的綠色熒光出現(xiàn)。流式細(xì)胞分析可以看出，純合細(xì)胞系FITC熒光峰值高于對(duì)照，而雜合細(xì)胞系則位于兩者之間。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，以免疫熒光染色的p53 的紅色熒光為對(duì)照，可發(fā)現(xiàn)p53-EGFP 細(xì)胞系的綠色熒光較好地反映了p53表達(dá)情況，且細(xì)胞群體間p53的表達(dá)具有異質(zhì)性的特點(diǎn)。此外，利用免疫熒光對(duì)小鼠ESCs多能性標(biāo)志Nanog 進(jìn)行共染后發(fā)現(xiàn)，p53 表達(dá)與Nanog表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即p53 高表達(dá)的細(xì)胞里Nanog表達(dá)較低，而p53低表達(dá)的細(xì)胞里Nanog表達(dá)較高。

2.4 p53 抑制小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形成

將敲入細(xì)胞系按熒光強(qiáng)弱即p53 表達(dá)高低進(jìn)行分選，分選比例為熒光強(qiáng)弱大約各20%，分選完成后再次進(jìn)行流式分析，可發(fā)現(xiàn)純合、雜合細(xì)胞p53 高表達(dá)細(xì)胞群體與低表達(dá)細(xì)胞群體相比為兩個(gè)不同細(xì)胞群體。將分選后的細(xì)胞重新種下進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)，p53 高表達(dá)細(xì)胞與低表達(dá)細(xì)胞相比，克隆形成數(shù)量下降，重新消化種下一代后，可得到類(lèi)似結(jié)果。

2.5 p53-EGFP、Nanog-mcherry 雙熒光標(biāo)記細(xì)胞系構(gòu)建

基于同樣的原理，在p53-EGFP knock-in 細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，在Nanog 終止密碼子后方插入紅色熒光蛋白mcherry 用于指示Nanog 蛋白的表達(dá)水平。敲除效率驗(yàn)證顯示預(yù)先設(shè)計(jì)的三條sgRNA 均有一定的切割效果。雙載體轉(zhuǎn)染、篩選后，經(jīng)純合、雜合鑒定可得到Nanog-mcherry knock in 純合及雜合細(xì)胞系。倒置熒光顯微鏡下可以看到純合、雜合細(xì)胞系相比對(duì)照而言都有一定程度的紅色熒光出現(xiàn)，將純合敲入細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、DAPI 染色后在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察可發(fā)現(xiàn)綠色熒光與紅色熒光呈互斥關(guān)系，見(jiàn)圖3、4。

圖3 小鼠ESCs 中p53 表達(dá)具有異質(zhì)性且與Nanog 表達(dá)互斥（A：熒光顯微鏡觀(guān)察對(duì)照、純合、雜合p53-EGFP 敲入細(xì)胞系；B：流式細(xì)胞分析對(duì)照、純合、雜合p53-EGFP 敲入細(xì)胞系熒光分布；C：p53-EGFP 綠色自發(fā)熒光與免疫熒光染色p53 紅色熒光對(duì)應(yīng)關(guān)系；D：p53 表達(dá)與Nanog 表達(dá)互斥）

圖4 p53-EGFP、Nanog-mcherry 雙熒光標(biāo)記細(xì)胞系構(gòu)建（A：sg-RNA 切割效果驗(yàn)證；B：純合、雜合敲入驗(yàn)證；C：倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察對(duì)照、純合、雜合雙熒光標(biāo)記細(xì)胞；D：共聚焦觀(guān)察雙熒光標(biāo)記細(xì)胞中p53與Nanog 互斥關(guān)系）

2.6 小鼠ESCs 中p53 可以抑制Nanog 表達(dá)

經(jīng)過(guò)流式分析紅色熒光表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，純合Nanog-mcherry knock in 細(xì)胞系紅色熒光分布峰圖明顯右移，而雜合敲入細(xì)胞峰圖則位于純合及對(duì)照之間，見(jiàn)圖5。過(guò)表達(dá)p53 后可以發(fā)現(xiàn)紅色熒光分布明顯左移，表明p53 可以在Nanog 上游發(fā)揮作用，即p53可以抑制Nanog表達(dá)，見(jiàn)圖6。

圖5 p53 抑制小鼠ESCs 克隆形成（A：流式分選不同熒光強(qiáng)度的純合、雜合p53-EGFP 敲入細(xì)胞；B：p53 高表達(dá)抑制小鼠ESCs 克隆形成）

圖6 小鼠ESCs 中p53 可以抑制Nanog 表達(dá)（A-B：流式細(xì)胞分析對(duì)照、純合、雜合Nanog-mcherry 敲入細(xì)胞系熒光分布；C：在純合細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)p53 后，紅色熒光減弱）

3 討論

CRISPR-Cas9 基因編輯工具為研究基因功能提供極大的便利，基于同源重組原理的基因敲入技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在基因組特定位點(diǎn)特異性插入外源片段。基于此原理，本研究利用CRISPR-Cas9 基因敲入技術(shù)成功構(gòu)建了小鼠ESCsp53、Nanog 雙熒光報(bào)告細(xì)胞系，通過(guò)在p53 基因編碼序列末端引入綠色熒光蛋白EGFP，Nanog 基因組終止密碼子處引入紅色熒光蛋白mcherry，理論上，p53 蛋白表達(dá)量與EGFP 相同，而Nanog 蛋白表達(dá)量與mcherry相同，因此，在熒光顯微鏡下分別觀(guān)察EGFP、mcherry 的熒光強(qiáng)度即可反映活細(xì)胞狀態(tài)下p53、Nanog 蛋白的表達(dá)水平，無(wú)需額外檢測(cè)，為研究p53 在ESCs 命運(yùn)調(diào)控中的具體作用機(jī)制提供了有力工具。

ESCs 一個(gè)重要的特性是在保持自我更新能力的同時(shí)具有向三胚層分化的能力，ESCs 如何在自我更新和分化能力之間取得平衡是干細(xì)胞相關(guān)研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。而細(xì)胞間異質(zhì)性則可能是干細(xì)胞在對(duì)誘導(dǎo)分化信號(hào)做出反應(yīng)的同時(shí)保持其自我更新潛力的內(nèi)在機(jī)制。多項(xiàng)研究已報(bào)道多個(gè)與多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在ESCs 中以異質(zhì)性的方式表達(dá)，如Nanog、Gata6、Rex1 等。大約10%～20%的ESCs 中不表達(dá)Nanog，Nanog 高表達(dá)細(xì)胞群體未分化克隆形成數(shù)量高于Nanog 低表達(dá)細(xì)胞，而Nanog 陰性細(xì)胞則顯示出更高的分化傾向，且這種異質(zhì)性的狀態(tài)是處于動(dòng)態(tài)波動(dòng)的，即Nanog 高表達(dá)細(xì)胞與低表達(dá)細(xì)胞可以相互轉(zhuǎn)化，提示ESCs 能夠在偏向自我更新和偏向分化的狀態(tài)之間切換，以在響應(yīng)不同胞外信號(hào)時(shí)做出不同反應(yīng)。

p53 作為抑癌因子在抑制成熟體細(xì)胞向無(wú)限增殖的惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但在ESCs 中發(fā)揮什么樣的作用目前尚未可知。有研究發(fā)現(xiàn)，在紫外線(xiàn)或Doxorubicin 的作用下，mESCs 中p53 蛋白第315 位絲氨酸可發(fā)生磷酸化進(jìn)而提高其蛋白濃度，而Nanog 啟動(dòng)子上游存在兩個(gè)p53 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，在損傷誘導(dǎo)條件下，p53 通過(guò)第315 位絲氨酸的磷酸化提高其蛋白濃度并招募共抑制因子mSin3a，實(shí)現(xiàn)對(duì)Nanog 的直接轉(zhuǎn)錄抑制，進(jìn)而對(duì)ESCs 的細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行調(diào)控［28］。然而，在目前的相關(guān)研究中，對(duì)P53 在ESCs中作用的研究通常是在體外人為創(chuàng)造誘導(dǎo)分化環(huán)境（去除LIF）［29］或誘導(dǎo)內(nèi)源活性氧增多（去除β-巰基乙醇）［30］等條件下得到的相應(yīng)結(jié)論，在mESCs正常體外培養(yǎng)過(guò)程中，p53 能否在mESCs 維持自我更新中發(fā)揮一定作用以及與Nanog 是否仍具有調(diào)控關(guān)系，由于缺乏合適的細(xì)胞模型，目前尚未有相關(guān)結(jié)論。在本研究中，我們構(gòu)建的P53、Nanog 雙熒光標(biāo)記細(xì)胞系為當(dāng)前研究提供了便利，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)P53 在mESCs 中存在異質(zhì)性表達(dá)的特點(diǎn)，且其異質(zhì)性表達(dá)與Nanog 蛋白表達(dá)呈互斥關(guān)系，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)P53 可抑制Nanog 表達(dá)，即P53 可通過(guò)調(diào)控Nanog 表達(dá)參與小鼠ESCs 正常維持培養(yǎng)過(guò)程中不同狀態(tài)的調(diào)控，為P53 參與調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制提供新的見(jiàn)解。