桃果套袋對6 種典型農(nóng)藥沉積分布和殘留的影響

陳茜茜, 王曉珊, 趙洋洋, 邢天天, 張智超

(南開大學(xué) 農(nóng)藥國家工程研究中心，天津 300071)

桃Prunus persica(L.) Batsch 屬薔薇科李屬桃亞屬，味美芳香，營養(yǎng)豐富，廣為人們所喜愛。我國的桃產(chǎn)量位居世界第一位，其總產(chǎn)量占世界桃總產(chǎn)量的54.0%[1]。桃在生產(chǎn)過程中主要病蟲害為穿孔病、褐腐病、炭疽病、流膠病、食心蟲、蚜蟲、紅蜘蛛和介殼蟲等。化學(xué)農(nóng)藥施用是防治桃園病蟲害的主要措施，但不合理使用易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，如毒死蜱、吡蟲啉、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈等在桃中常有檢出[1-2]。

據(jù)報道，果實(shí)套袋有助于降低蘋果[3-6]、梨[7-8]、番茄和黃瓜[9]、香蕉[10]、芒果[11-12]、枇杷[13]中農(nóng)藥的原始沉積量及最終殘留量；但也有研究結(jié)果表明，套袋可導(dǎo)致荔枝果實(shí)中甲氰菊酯和敵百蟲殘留量的增加[14]；此外，有研究表明，套袋會降低農(nóng)藥在水果中的降解速率，且與農(nóng)藥本身的性質(zhì)有關(guān)[15-17]。然而，以上研究只關(guān)注了套袋對農(nóng)藥在可食部位上沉積和殘留的影響，沒有研究套袋對農(nóng)藥在作物葉片和土壤中沉積和殘留的影響；同時，有關(guān)套袋對農(nóng)藥在桃園體系（桃葉、桃果和土壤）中沉積和殘留的影響尚未見報道。因此，本研究選擇用于桃樹的6 種典型登記農(nóng)藥 (吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環(huán)唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯) 為研究對象，開展桃果套袋和不套袋兩種處理對6 種農(nóng)藥在桃園體系中沉積分布和殘留的影響，旨在為果農(nóng)合理用藥及桃套袋技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 290 Infinity Ⅱ UPLC-6470A MS/MS，超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (配有電噴霧離子源 (ESI)) 和 Agilent 7890B GC-7000C QQQ，氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (配有電子轟擊離子源 (EI))(美國Agilent 公司)；TGL-15B 高速臺式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；CK2000 高通量組織研磨儀 (北京托摩根生物科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng) (德國Heidolph 公司)；渦旋儀 (北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；XPE105萬分之一電子分析天平 (梅特勒-托利多集團(tuán))；SQP 百分之一電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；移液器 (德國Eppendorf 公司)。

吡蟲啉 (99.82%，imidacloprid)、嘧菌酯 (99.23%，azoxystrobin)、腈苯唑 (99.90%，fenbuconazole)、苯醚甲環(huán)唑 (99.90%，difenoconazole)、毒死蜱(99.89%，chlorpyrifos) 和β-氯氰菊酯 (97.82%，βcypermethrin) 標(biāo)準(zhǔn)品，購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；甲酸 (色譜純) 購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈和甲醇 (色譜純)購于北京迪科馬科技有限公司；高溫蒸餾水購于廣州屈臣氏食品飲料有限公司；N-丙基乙二胺 (PSA)、十八烷基鍵合硅膠 (C18) 和石墨化碳黑 (GCB, 40 μm)，購于天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2019 年8 月下旬至9 月上旬在天津市靜海區(qū)進(jìn)行。供試桃樹Prunus persica(L.) Batsch品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N‘國慶王’，供試藥劑為10%吡蟲啉可濕性粉劑 (施藥劑量為2 500 倍液，下同)、325 g/L 苯甲 ? 嘧菌酯懸浮劑 (1 000 倍液)、522.5 g/L 氯氰 ? 毒死蜱乳油 (1 000 倍液) 和24%腈苯唑懸浮劑 (1 600 倍液)?；旌鲜┧? 次，施藥間隔期為7 d。每小區(qū)3 棵桃樹，設(shè)套袋和不套袋兩個處理，每處理3 個重復(fù)。對于套袋處理組，選擇外黃內(nèi)黑單層復(fù)合紙袋，并于果實(shí)套袋后開展施藥，施藥方式、濃度和時間與不套袋處理組相同。

取樣：1) 桃果及桃葉。分別于第2 次施藥后2 h 及1、3、7、14 和21 d 采用隨機(jī)取樣法，在試驗(yàn)小區(qū) (樹) 的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位采集12 個以上 (不少于2 kg) 生長正常、無病害、成熟的桃果實(shí) (不少于12 個桃) 以及生長正常、新鮮的桃葉 (不少于0.5 kg)；2) 土壤。在桃樹的樹冠覆蓋范圍內(nèi)，采用隨機(jī)取樣法，選擇9 個采樣點(diǎn) (地表以下10 cm)，每個小區(qū)每次采集土壤樣本不少于2 kg。

采集的桃葉、桃果 (去除柄和果核) 和土壤樣品分別制備成實(shí)驗(yàn)室樣品，于 ?20 ℃條件下保存。其中，桃果的檢測部位為去除果核后的整個果實(shí)，但殘留量計算為包括果核在內(nèi)的整個果實(shí)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 準(zhǔn)確稱取一定量的樣品 (桃葉5.0 g、桃果10.0 g、土壤10.0 g) 于50 mL 聚乙烯離心管中，加入10.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.2% 的甲酸-乙腈溶液 (土壤樣品另加入3.0 mL 蒸餾水)，振蕩提取5 min，加入1.0 g 氯化鈉和4.0 g 無水硫酸鎂，振蕩3 min 后于4 000 r/min 下離心5 min，取上清液，待凈化。

1.3.2 樣品凈化 準(zhǔn)確移取3.0 mL 上述上清液于25 mL 圓底燒瓶中，先在35 ℃的水浴溫度和10 kPa 左右的真空度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再用1.5 mL 的V(丙酮) :V(異辛烷) = 1 : 1 溶液復(fù)溶后，轉(zhuǎn)移至裝有一定量凈化劑 (桃葉：20.0 mg GCB+40.0 mg PSA+150.0 mg 無水硫酸鎂；桃果和土壤：50.0 mg PSA+150.0 mg 無水硫酸鎂) 的2 mL 離心管中，渦旋1.5 min 后于8 000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，待GC-MS/MS 測定毒死蜱和β-氯氰菊酯含量；另從離心后的50 mL 聚乙烯離心管中移取1.5 mL 上清液至另一個裝有一定量凈化劑 (桃葉：20.0 mg GCB+40.0 mg PSA+150.0 mg 無水硫酸鎂；桃果和土壤：50.0 mg C18+150.0 mg 無水硫酸鎂) 的2 mL 離心管中，渦旋1.5 min 后于8 000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，待UPLC-MS/MS 測定吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環(huán)唑含量。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS) 色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)；流動相A 為乙腈溶液，流動相B 為體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋? min 時20% A-80% B，0.50～1.50 min 為65% A-35% B，1.60 min 時變?yōu)?0% A-10% B，保持到3.00 min，3.10 min 時恢復(fù)到初始流動相比例 (20% A-80%B)；流速為0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：帶有安捷倫噴射流技術(shù)的電噴霧離子源 (AJS ESI)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 模式；毛細(xì)管電壓4.0 kV；霧化氣壓力1.7 × 105Pa；干燥氣流量10 L/min，溫度325 ℃；鞘氣流量11.0 L/min，溫度350 ℃；離子源溫度325 ℃；質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)譜條件參數(shù) (UPLC-MS/MS)Table 1 Mass spectrometry parameters for imidacloprid, azoxystrobin, fenbuconazole and difenoconazole (UPLC-MS/MS)

1.4.2 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GCMS/MS) 色譜條件：DB-17MS 色譜柱 (30 m ×250 μm，0.25 μm)；載氣為氦氣，柱流速1.3 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流進(jìn)樣，分流比5 : 1；進(jìn)樣量1 μL；柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?20 ℃，以20 ℃/min 升至290 ℃，保持8 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；碰撞氣為高純氮?dú)?，流?.5 mL/min；淬滅氣為高純氦氣，流速2.25 mL/min；溶劑延遲6.0 min；質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 毒死蜱和β-氯氰菊酯質(zhì)譜條件參數(shù) (GC-MS/MS)Table 2 Mass spectrometry parameters for chlorpyrifos and β-cypermethrin(GC-MS/MS)

1.5 方法確證

按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[18]要求，通過線性范圍、添加回收試驗(yàn) (準(zhǔn)確度和精密度)以及檢出限進(jìn)行分析方法驗(yàn)證。

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 1) 分別準(zhǔn)確稱取一定量的吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)母液。2) 分別準(zhǔn)確稱取一定量的毒死蜱和β-氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，用異辛烷溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)母液。用溶劑或經(jīng)提取凈化后的空白基質(zhì)溶液稀釋上述混合標(biāo)準(zhǔn)母液，配成0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 和5 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4 節(jié)的條件測定。以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x，mg/L)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo) (y) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 基質(zhì)效應(yīng) 對于質(zhì)譜，由于共同洗脫雜質(zhì)的干擾影響電噴霧接口的離子化效率，從而引起離子化抑制或增強(qiáng)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性或假陽性或不精確的定量，因此基質(zhì)效應(yīng)是質(zhì)譜分析時方法驗(yàn)證的重要參數(shù)[19]。按1.5.1 節(jié)所述，繪制溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式 (1) 計算基質(zhì)效應(yīng) (Me)。當(dāng)Me的絕對值小于20% 時，認(rèn)為可以忽略基質(zhì)效應(yīng)；反之，則應(yīng)考慮消除基質(zhì)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)[20-21]。

式中：A和B分別表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率。

1.5.3 添加回收試驗(yàn) 分別向空白桃葉、桃果及土壤樣品中添加6 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液。GB 2763—2019[22]規(guī)定，吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環(huán)唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯在桃中的最大殘留限量 (MRL) 分別為0.5、2、0.5、0.5、3 和1 mg/kg。根據(jù)上述規(guī)定，本研究設(shè)置了0.05、0.5 及5 mg/kg(桃果中為2 mg/kg) 3 個添加水平，每個水平5 個重復(fù)，另設(shè)空白對照。添加后混勻靜置30 min后進(jìn)行提取測定，計算平均添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

此外，本研究還增加了桃葉中10 mg/kg (吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環(huán)唑) 和20 mg/kg(毒死蜱和β-氯氰菊酯) 的添加回收試驗(yàn)，以覆蓋桃葉樣品檢測的最高殘留量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

原始沉積量為所測得的各介質(zhì)中原始沉積濃度，結(jié)合桃園種植體系中對應(yīng)介質(zhì)的生物量數(shù)據(jù)得到。其中，每棵桃樹上桃葉、桃果的總重估值分別以8 420 g 和12 000 g 計；土壤以每棵樹周邊半徑1 m、深度為10 cm、土壤容重為1.2 g/cm3的土壤重量計。

對同一種農(nóng)藥在兩種處理下的殘留量數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 線性范圍及基質(zhì)效應(yīng) 在0.01～1 mg/L 范圍內(nèi)，吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環(huán)唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間呈良好線性關(guān)系，R2在0.987 3～1.000 之間。其中，6 種農(nóng)藥在桃葉和土壤基質(zhì)中的|Me|分別為48%～173%和29%～125%，基質(zhì)效應(yīng)明顯；在桃果基質(zhì)中，嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環(huán)唑的|Me|<7%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，而其余3 種農(nóng)藥的|Me|均大于20%，基質(zhì)效應(yīng)明顯。考慮到基質(zhì)效應(yīng)及定量分析的需求，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正定量分析。

2.1.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 在0.05～20 mg/kg(桃葉)、0.05～2 mg/kg (桃果) 和0.05～5 mg/kg (土壤) 添加水平下，6 種農(nóng)藥在桃葉、桃果和土壤樣品中的平均回收率在72%～111% 之間，RSD 在0.90%～18%之間 (n= 5)，可滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求[18]。以添加回收試驗(yàn)的最低添加水平作為分析方法的定量限 (LOQ)，則6 種農(nóng)藥的LOQ 均為0.05 mg/kg。

2.2 套袋對6 種農(nóng)藥在桃葉、桃果及土壤中沉積分布規(guī)律的影響

分別測定6 種農(nóng)藥在桃葉、桃果和土壤樣品中的原始沉積量。結(jié)果 (表3) 表明：桃果套袋后，6 種農(nóng)藥在桃果上的原始沉積量大大降低，除毒死蜱外，其余5 種農(nóng)藥的原始沉積量均低于定量限；土壤中的原始沉積量升高，但兩種處理下毒死蜱和β-氯氰菊酯在0.05 水平上差異不顯著(P<0.05)、嘧菌酯在0.01 水平上差異不顯著 (P<0.01)，其余3 種農(nóng)藥在兩種處理下均有極顯著差異 (P<0.01)；對于桃葉，除苯醚甲環(huán)唑在兩種處理下差異顯著 (P<0.05) 外，其余5 種農(nóng)藥的原始沉積量均無顯著差異 (P<0.05)。表明套袋可以有效隔離農(nóng)藥與果實(shí)接觸，從而減少了農(nóng)藥在果實(shí)上的原始沉積量，這與已有的文獻(xiàn)報道[5,8-9,13]相符。

表3 套袋和不套袋處理下6 種農(nóng)藥在桃葉、桃果及土壤中的原始沉積量Table 3 The initial deposition contents of six pesticides in peach leaf, peach fruit and soil with fruit bagging and non-bagging

6 種農(nóng)藥在桃葉、桃果及土壤中原始沉積量的占比規(guī)律見圖1。結(jié)果表明，不套袋處理下，農(nóng)藥噴施后沉積量占比順序?yàn)樘胰~ (56.7%～69.4%)>土壤 (25.3%～39.2%)>桃果 (3.3%～6.5%)(圖1A)。套袋后，苯醚甲環(huán)唑在土壤中的沉積量占比最大，其沉積量占比順序?yàn)橥寥?桃葉>桃果；而其余5 種農(nóng)藥的主要沉積部位依然為葉片，但桃葉和桃果中的沉積量占比明顯降低，土壤中的沉積量占比相對升高，分別為47.8%～64.3%、< 1% 和34.9%～52.2% (圖1B)。這可能是因?yàn)楣奈锢砀綦x作用不僅可以減少桃果與農(nóng)藥的直接接觸而降低桃果中農(nóng)藥的殘留量，而且可能會影響農(nóng)藥在葉片上的原始沉積。套袋后葉片上的沉積量均有一定程度的下降 (4%～14%)，在施藥或采樣過程中的系統(tǒng)誤差可能造成苯醚甲環(huán)唑在桃葉中的沉積量顯著降低，從而影響其沉積量占比順序。

2.3 套袋對6 種農(nóng)藥在桃中消解行為的影響

2.3.1 6 種農(nóng)藥在桃葉中的消解規(guī)律 套袋和不套袋兩種處理下，6 種農(nóng)藥在桃葉上的消解規(guī)律均符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型，其半衰期在4.8～26.7 d之間。其中，嘧菌酯和腈苯唑的半衰期相對較長，均大于20 d。此外，6 種農(nóng)藥在套袋和不套袋兩種處理下的半衰期接近，表明桃果套袋對農(nóng)藥在桃葉上的消解行為無影響 (表4)。

2.3.2 6 種農(nóng)藥在桃果中的消解規(guī)律 套袋處理下，毒死蜱在桃果中的殘留量為0.06～0.1 mg/kg，其余5 種農(nóng)藥的殘留量均低于LOQ (0.05 mg/kg)；但6 種農(nóng)藥的消解動態(tài)試驗(yàn)數(shù)據(jù)不規(guī)律，因此無法得到套袋處理下6 種農(nóng)藥的消解動態(tài)曲線。

不套袋處理下，第2 次施藥后6 種農(nóng)藥的殘留量隨時間呈明顯下降趨勢，亦符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程。除毒死蜱的半衰期為9.4 d 外，其余5 種農(nóng)藥的消解速率均較慢，半衰期在19.3～36.5 d之間 (表4)。與已有的文獻(xiàn)報道[23-26]相比，本研究中6 種農(nóng)藥在桃果上的半衰期相對較長。究其原因：一方面，作物品種以及作物的生長時期會影響農(nóng)藥的半衰期，本試驗(yàn)開展期間桃果處于成熟前的慢速生長期，可能會導(dǎo)致農(nóng)藥消解速率慢；另一方面，可能還受試驗(yàn)?zāi)攴莸牟煌瑲夂驐l件及環(huán)境條件等的影響。

表4 6 種農(nóng)藥在桃葉和桃果中的消解動態(tài)Table 4 Dissipation dynamics of 6 pesticides in peach leaf and fruit

2.4 套袋對6 種農(nóng)藥在桃果上最終殘留量的影響

由表5 可知，套袋和不套袋兩種處理下，第2 次施藥后14 和21 d 時6 種農(nóng)藥在桃果中的最終殘留量均低于我國規(guī)定的MRL 值[22]，但與不套袋相比，套袋后6 種農(nóng)藥在桃果上的殘留量均顯著降低 (p<0.05)。套袋后，除毒死蜱在第2 次施藥后14 和21 d 的殘留量分別為 (0.09 ± 0.01) mg/kg和 (0.06 ± 0.02) mg/kg 外，另外5 種農(nóng)藥均未檢出。這與前人關(guān)于套袋后毒死蜱[5]、苯醚甲環(huán)唑[23]在蘋果中殘留，氯氰菊酯在翠冠梨[8]、黃瓜和番茄[9]中殘留的研究結(jié)論一致；而王建武等[14]、李胤均等[11]的研究結(jié)果表明，采取套袋前施藥的方式，套袋處理組的荔枝果肉和芒果中農(nóng)藥殘留量增加，施藥方式的不同導(dǎo)致農(nóng)藥殘留結(jié)果的差異。

表5 套袋處理對6 種農(nóng)藥在桃果中最終殘留量的影響Table 5 The effect of bagging on the terminal residues of six pesticides in peach fruit

3 結(jié)論

本研究建立了利用超高效液相色譜/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS 或GC-MS/MS) 測定桃葉、桃果和土壤中吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環(huán)唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯6 種農(nóng)藥殘留的分析方法，該方法的平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差以及定量限均可滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。

從沉積分布結(jié)果來看，果實(shí)套袋后施藥可以極大地降低農(nóng)藥在桃果上的原始沉積量，6 種農(nóng)藥在各介質(zhì)中的沉積分布占比順序?yàn)樘胰~>土壤>桃果，其中苯醚甲環(huán)唑可能因?yàn)槭┧幖安蓸舆^程中的系統(tǒng)誤差造成了其沉積量占比順序不一致。從消解行為來看，6 種農(nóng)藥在桃葉和桃果上的消解規(guī)律均符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型，在桃葉上消解半衰期為4.8～26.7 d，桃果中的消解半衰期為9.4～36.5 d；果實(shí)套袋對農(nóng)藥在桃葉中的消解行為無影響，但顯著降低了6 種農(nóng)藥在桃果上的殘留量，除毒死蜱外均低于LOQ。從最終殘留量 (第2 次藥后14 d 和21 d) 來看，套袋和不套袋兩種處理下6 種農(nóng)藥在桃果中的殘留量均低于我國規(guī)定的MRL 值。