半楓荷水、乙醇提取物對小鼠的鎮(zhèn)痛抗炎作用

蔣 楊，丘曉花，陳 博，鐘 平，劉 霞 （廣東醫(yī)科大學，廣東東莞 523808）

半楓荷為金縷梅科半楓荷屬常綠喬木，是我國特有的單種屬植物，主要分布于中國南部和東南部山區(qū)，其根、莖、葉枝均可入藥，全年可采，曬干入藥，用于治療風濕、類風濕性關節(jié)炎、腰腿疼痛、跌打損傷、刀傷出血等治療[1]。研究報道半楓荷根的醇提物具有鎮(zhèn)痛、抗炎、活血化瘀的作用[2]。李云燕等[3]用自制半楓荷散治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎有顯著療效。本研究分別采用水和乙醇兩種溶劑對半楓荷根進行提取，采用熱板法、醋酸扭體法、足跖腫脹及耳腫脹法對小鼠進行鎮(zhèn)痛抗炎實驗，結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康昆明種清潔級小鼠，體質量為18～22 g，雌雄兼用。由廣東醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK（粵）2015-0147。

1.2 藥品與儀器

新鮮半楓荷根2020 年采自福建龍巖，系人工養(yǎng)殖樹種，采挖經當?shù)乜h人民政府野生植物主管部門同意，并經我校林堅濤研究員鑒定為正品，風干、粉碎備用。阿司匹林腸溶片（蘇州弘森藥業(yè)有限公司，國藥準字H32025896）；1%角叉菜膠溶液（角叉菜膠批號YY13755，購自上海源葉生物科技有限公司）；0.6%醋酸溶液（冰醋酸購自南京化學試劑股份有限公司，批號20190906）；二甲苯（天津永晟精細化工有限公司，批號20190802），苦味酸，蒸餾水。YLS-6B 智能熱板儀（安徽正華生物儀器設備有限公司），YLS-7A足跖容積測量儀（淮北正華生物儀器設備有限公司），旋轉蒸發(fā)儀（上海遠懷實業(yè)有限公司），電子天平（上海精密儀器儀表有限公司），大小鼠打孔器（北京創(chuàng)博生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 配藥[4]半楓荷水提物的制備：取粉碎好的生藥粉100 g，用10倍容積的蒸餾水浸泡24 h，煎煮3次，第1次為1 h，第2、3次均為0.5 h。濾過，合并藥液減壓濃縮，55 ℃干燥得到干浸膏，取相應干膏用適量蒸餾水配成高(0.2 g/mL)、中(0.15 g/mL)、低（0.1 g/mL）3 個濃度的水提物。半楓荷乙醇提物的制備：100 g生藥粉加乙醇回流3次（80%乙醇5倍量，1.5 h；70%乙醇4倍量，1.5 h；50%乙醇3倍量，1.5 h），濾過，減壓回收乙醇，濃縮液水浴65 ℃蒸干，后置于真空55 ℃干燥得到干浸膏，用適量酒精溶解后，用蒸餾水配成高(0.2 g/mL)、中(0.15 g/mL)、低(0.1 g/mL)3 個濃度醇提物。取阿司匹林片（25 mg/片）20 片，研磨成粉末，加蒸餾水溶解至100 mL，制成5 g/L的阿司匹林混懸液。

1.3.2 分組與給藥 取64只小鼠，隨機分成8組，即對照組(生理鹽水溶液0.1 mL/10 g)，陽性對照組(5 g/L阿司匹林混懸液)，半楓荷水提物低(0.1 g/mL)、中(0.15 g/mL)、高(0.2 g/mL)劑量組，半楓荷乙醇提物低(0.1 g/mL)、中(0.15 g/mL)、高(0.2 g/mL)劑量組，每組8 只。給藥方式：每天灌胃1次，連續(xù)給藥1周。

1.3.3 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實驗[5]以小鼠舔后足作為痛反應指標，選取痛閾值10～30 s范圍內的雌性小鼠按“1.3.2”項下分組，給藥前分別進行2 次測定其痛閾值，取平均值作為小鼠給藥前的痛閾值。最后一次灌胃1 h 后，取小鼠置熱板儀內（55.0±0.5）℃，室溫（20.0±1.0）℃，記錄各組小鼠第l次舔后足時間，測定各組痛閾值，以60 s 為限，若超過60 s 者，以60 s 計算。計算各組痛閾提高百分率，痛閾提高百分率=[(用藥后痛閾值-用藥前痛閾值)/(用藥前痛閾值)]×100%。

1.3.4 扭體反應實驗[6]每只小鼠于末次給藥1 h后，腹腔注射0.6%冰醋酸10 mL/kg，記錄10 min 內小鼠腹部內凹、軀干扭曲、臀部抬高、后肢伸長等扭體反應的次數(shù)。抑制率=（對照組扭體反應次數(shù)-給藥組扭體反應次數(shù)）/對照組扭體反應次數(shù)×100%。

1.3.5 足趾腫脹實驗[7]每只小鼠于末次給藥1 h后，分別在小鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜膠生理鹽水溶液0.05 mL 致炎，致炎1 h 后分別容積法測量小鼠右后足跖的體積。足跖腫脹度=（右足跖體積-左足跖體積）/左足跖體積×100%，足跖腫脹抑制率=（對照組足跖腫脹度-給藥組足跖腫脹度）/對照組足跖腫脹度×100%。

1.3.6 耳腫脹實驗[8]每只小鼠于末次給藥1 h 后，用二甲苯（0.03 mL）均勻涂于各小鼠右耳內外兩側，30 min 后脫頸處死小鼠，沿著小鼠耳廓剪下雙耳，用打孔器分別在左右耳打下同一部位的相同大小的耳片，置天平稱重，以兩耳片的質量差作為腫脹度，計算腫脹抑制率。腫脹抑制率=[(對照組耳片腫脹度-給藥組耳片腫脹度)]/對照組耳片腫脹度×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對熱板法致小鼠疼痛的影響

給藥后，與對照組比較，半楓荷乙醇提物對小鼠痛閾值與痛閾提高百分率明顯升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)；與陽性對照組比較，半楓荷乙醇提物高劑量組對小鼠的痛閾值與痛閾提高百分率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 半楓荷水、乙醇提取物對小鼠熱板法致痛的鎮(zhèn)痛作用 (，n=8)

表1 半楓荷水、乙醇提取物對小鼠熱板法致痛的鎮(zhèn)痛作用 (，n=8)

與對照組比較：aP<0.05；與陽性對照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

2.2 對醋酸致小鼠扭體反應的影響

給藥后，與對照組比較，半楓荷水、乙醇提物對小鼠扭體反應次數(shù)均明顯減少，抑制率明顯增高，以乙醇提物組更為顯著，且呈劑量依賴性(P<0.05)。與陽性對照組比較，半楓荷乙醇提物中、高劑量組對小鼠的扭體反應次數(shù)與抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 半楓荷水、乙醇提取物對醋酸致小鼠扭體反應次數(shù)的影響(，n=8)

表2 半楓荷水、乙醇提取物對醋酸致小鼠扭體反應次數(shù)的影響(，n=8)

與對照組比較：aP<0.05；與陽性對照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

2.3 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響

給藥后，與對照組比較，半楓荷水、乙醇提物對角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹度明顯下降，抑制率明顯增高，以乙醇提物組更為顯著，且呈劑量依賴性(P<0.05)。與陽性對照組比較，半楓荷乙醇提物高劑量組對角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹度與腫脹抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 半楓荷水、乙醇提取物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(，n=8)

表3 半楓荷水、乙醇提取物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(，n=8)

與對照組比較：aP<0.05；與陽性對照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

2.4 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

給藥后，與對照組比較，半楓荷水、乙醇提物對角叉菜膠所致小鼠的耳腫脹明顯下降，抑制率明顯增高，以乙醇提物組更為顯著，且呈劑量依賴性(P<0.05)。與陽性對照組比較，半楓荷乙醇提物高劑量組對角叉菜膠所致小鼠的耳腫脹度與腫脹抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 半楓荷水、乙醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(，n=8)

表4 半楓荷水、乙醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(，n=8)

與對照組比較：aP<0.05；與陽性對照組比較：bP<0.05；與半楓荷水提物(低)比較：cP<0.05；與半楓荷水提物(中)比較：dP<0.05；與半楓荷水提物(高)比較：eP<0.05；與半楓荷乙醇提物(低)比較：fP<0.05；與半楓荷乙醇提物(中)比較：gP<0.05

3 討論

半楓荷作為我國傳統(tǒng)中藥材，有著悠久的臨床用藥歷史和確切的療效，具有祛風除濕、活血通絡的功效，是一類具有較大開發(fā)價值的植物群[9]。近幾年對半楓荷的研究主要集中在從根、莖、葉中分離出酸類、醇類及胡蘿卜苷等有效成分，顯示其具有抗炎、抗病毒、活血化瘀等作用[10]。楊武亮等[11]對半荷根的醇提物對鼠的鎮(zhèn)痛和抗炎作用進行研究，其結果表明半楓荷根的醇提物具有輕度的鎮(zhèn)痛作用，且具有很好的抗炎作用。梁偉江等[12]研究發(fā)現(xiàn)不同極性半楓荷提取物對血瘀模型大鼠均有活血化瘀的作用，但效果最明顯的是半楓荷提取物的水提物。孫靜等[13]用從半楓荷中提取的不同藥物組分作用于乙型肝炎細胞，發(fā)現(xiàn)半楓荷對病毒性肝炎的抗原具有抑制活性，其抗肝炎病毒活性成分主要為齊墩果酸。廖娜等[14]研究結果顯示金縷半楓荷多酚具有較強的抗氧化活性，對常見的菌種具有明顯的抑菌效果，顯示較廣的抗菌譜。目前對于半楓荷的開發(fā)利用研究，需要解決的主要問題是半楓荷不同部位的有效活性成分及其作用機理不明確，各種成分是單獨起作用，還是相互起作用尚不清楚[15]。

本研究分別用水和乙醇兩種溶劑對半楓荷根進行提取，對半楓荷水、醇提物的鎮(zhèn)痛、抗炎作用進行評價。研究結果表明，半楓荷乙醇提物高、中劑量均延長熱板所致小鼠的痛閾值，痛閾提高百分率大于50%，對熱板法引起的物理致痛具有鎮(zhèn)痛作用，且有劑量依賴性。而半楓荷水提物高、中、低劑量組之間的痛閾提高百分率均小于50%，對熱板法引起的物理致痛沒有鎮(zhèn)痛作用。對醋酸所致小鼠扭體反應的影響結果顯示，半楓荷水、乙醇提取物對小鼠的扭體反應均有抑制作用，以半楓荷乙醇提物高、中劑量的抑制作用最強，抑制率達100%，表明半楓荷這兩種提取物對醋酸引起的化學致痛均有鎮(zhèn)痛作用，可能是因為醋酸引起小鼠疼痛反應的同時還伴有炎癥反應，醋酸可引起化學遞質如前列腺素E2、組胺和腹膜內血清素的增加，導致血管通透性增加。半楓荷水提物可能是通過對抗炎反應而起到一定的鎮(zhèn)痛作用。半楓荷水、乙醇提物對角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹和二甲苯所致耳腫脹均有抑制作用，且腫脹抑制率與劑量呈依賴性，且以半楓荷乙醇提物效果較好。二甲苯誘導耳腫脹和角叉菜膠引起的足跖腫脹可能與某些化學物質像組胺、5-羥色胺、緩激肽、P 物質和前列腺素等誘發(fā)的神經源性水腫相關，結果顯示兩種提取物均具有顯著的抗炎活性，尤其是在炎癥的急性期[16-18]。半楓荷水提物和醇提物中有效成分可能既有相同部分，又有差異，其具體成分和發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的具體機制有待下一步研究。