角叉菜膠致大鼠慢性前列腺炎模型的影響因素

朱佩軒 范瓊尹 張晶璇 高健 劉逍遙 趙睿學(xué) 蘇澤琦 王停

摘要 目的：明確角叉菜膠注射部位、注射濃度、注射劑量對慢性前列腺炎大鼠模型建立的影響，以形成穩(wěn)定、可靠的模型制備方案。方法：選用成年雄性SD大鼠，采用角叉菜膠直接注射到前列腺的方法制備模型。分別考察不同注射部位（前列腺背側(cè)葉、腹側(cè)葉）、角叉菜膠不同濃度（1%、3%、5%）和注射劑量（50 μL、80 μL）對模型制備的影響，以前列腺組織HE染色結(jié)果為指標進行判定，同時對成模時間及穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果：1）僅注射腹側(cè)葉時，病理一致性較好，且操作簡便易行，模型穩(wěn)定。2）每針注射50 μL較80 μL引起的病理改變更為均衡。3）注射1%角叉菜膠時病理改變較輕，注射3%角叉菜膠的模型一致性較好。4）角叉菜膠注射7 d、21 d、35 d后，均有符合慢性前列腺炎的炎癥反應(yīng)。5）本模型病理改變以巨噬細胞增殖聚集為主，伴有一定程度的混合炎癥細胞（單核細胞、淋巴細胞、漿細胞等）浸潤。結(jié)論：在SD大鼠前列腺左、右腹側(cè)葉各注射兩針3%角叉菜膠50 μL（共計200 μL），可在7 d后成功建立慢性前列腺炎模型且模型能至少維持4周。本研究可為慢性前列腺炎動物模型的制備完善提供數(shù)據(jù)支撐，同時對于慢性前列腺炎發(fā)病機制研究及新藥研發(fā)具有理論指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 慢性前列腺炎;慢性骨盆疼痛綜合征;動物模型;大鼠;角叉菜膠;病理;模型評價

Abstract Objective：To explore injection site，injection concentration and injection dose on the establishment of chronic prostatitis rat model induced by carrageenan，so as to form a stable and reliable preparation of chronic prostatitis rat model.Methods：In this experiment，adult male SD rats of SPF grade were selected，and a chronic prostatitis model was induced by carrageenan injection into the prostate.Different injection sites（the dorsal lobe of the prostate，the ventral lobe of the prostate），different concentrations of carrageenan（1%，3%，5%），and different injection doses of carrageenan（50 μL and 80 μL per needle）were investigated.In all experiments，the results of hematoxylin-eosin staining of rat prostate tissue were used as an index for model judgment，the time to establish the model and the stability of the model was evaluated at the same time.Results：1）Compared with only injected the dorsal lobe or injected the dorsal lobe and the ventral lobes at the same time，the pathological consistency is better when only ventral lobes are injected，meanwhile the operation is more simple and the model is more stable.2）The pathological changes of the 50 μL per needle injection group were more balanced than the 80 μL per needle injection group.3）The pathological changes were the lightest when 1% carrageenan was injected，and the pathological changes of 3% and 5% carrageenan were heavier than 1%，and the model with 3% carrageenan had better consistency.4）There was an inflammatory response consistent with chronic prostatitis after 7 d，21 d，35 d injection with carrageenan.5）The pathological changes of rats chronic prostatitis induced by carrageenan are mainly the proliferation and aggregation of macrophages，accompanied by a certain degree of mixed inflammatory cells infiltration（monocytes，lymphocytes，plasma cells，etc.）.Conclusion：Based on the results of the study，two injections of 50 μL（200 μL in total）of 3% carrageenan were injected into both the left and right ventral lobes of the prostate of SD rats can make the chronic prostatitis model after 7 days and the model can be maintained for at least 4 weeks.This study can provide data support for the preparation of animal models of chronic prostatitis，and can provide theoretical guidance for the study of the pathogenesis of chronic prostatitis and the development of new drugs.

Keywords Chronic prostatitis; Chronic pelvic pain syndrome; Animal model; Rat; Carrageenan; Pathology; Model evaluation

中圖分類號：R284;R697文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.007

慢性前列腺炎（Chronic Prostatitis，CP）又稱慢性骨盆疼痛綜合征（Chronic Pelvic Pain Syndrome，CPPS），我國CP發(fā)病率為6.0%～32.9%，是泌尿外科的常見疾病之一[1]。臨床主要表現(xiàn)為尿急、尿頻、尿痛、尿不盡、陰囊潮濕、骨盆區(qū)域疼痛或不適等，嚴重影響患者生命質(zhì)量[2]。CP病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚未被完全闡明[3-4]，對其進行基礎(chǔ)研究具有重要意義?，F(xiàn)有CP動物水平研究中，以應(yīng)用角叉菜膠直接注射至大鼠前列腺中誘導(dǎo)CP發(fā)生為主要造模方法，但現(xiàn)有文獻對角叉菜膠的注射部位、注射濃度、注射劑量以及模型維持時間均無統(tǒng)一標準，未形成標準化實驗流程，實驗中的細節(jié)缺乏交待，導(dǎo)致在模型建立中出現(xiàn)大量重復(fù)性的工作。因此，本研究針對角叉菜膠致大鼠CP的關(guān)鍵因素，重點觀察上述因素對模型建立的影響，以形成相對穩(wěn)定、炎癥反應(yīng)程度較一致的模型制備方案，為CP動物水平的研究提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，9周齡，體質(zhì)量350～380 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SYXK（京）2016-0038。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物室，飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水，光照周期明暗各12 h，溫度控制在（24±2）℃，相對濕度控制在40%～70%。實驗方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準（動物倫理審批號：BUCM-4-2019102601-4027）。

1.1.2 試劑與儀器 角叉菜膠（SIGMA公司，美國，生產(chǎn)批號：C1013-25G）;0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號：1809252004）;硫酸卡那霉素（GENVIEW公司，中國香港，生產(chǎn)批號：AK177-25G）;10%甲醛中性組織固定液（南昌雨露實驗器材有限公司，生產(chǎn)批號：190515）;蘇木精-伊紅（HE）染色液套組（南昌雨露實驗器材有限公司，生產(chǎn)批號：190601）;一次性注射器（山東頤興醫(yī)療器械有限公司，生產(chǎn)批號：190309）;分體式包埋機（Leica公司，德國，型號：EG1150）;半自動輪轉(zhuǎn)式切片機（Leica公司，德國，型號RM2245）;病理圖像采集系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本，型號：BX53-DP26）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）角叉菜膠生理鹽水溶液的配制與模型制備方法。將0.1 g角叉菜膠定容于10 mL生理鹽水中，配制成1%角叉菜膠生理鹽水溶液。同理配置其他濃度角叉菜膠生理鹽水溶液。溶液全程在潔凈工作臺上配置并儲存于無菌離心管中。參考Yang等[5]的造模方法，用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（劑量：50 mg/kg）麻醉大鼠，用剃毛器剔除大鼠下腹部被毛。在無菌條件下，用聚維酮碘消毒大鼠腹部皮膚，于下腹部正中開約2 cm的縱切口，逐層打開后找到膀胱，將膀胱輕輕挑起，用1 mL無菌注射器將角叉菜膠生理鹽水溶液注入前列腺中。注射完畢后將臟器歸位，在傷口處滴適量抗生素以預(yù)防感染，逐層縫合肌肉、皮膚，用聚維酮碘消毒傷口并將傷口周圍的血跡擦凈，再將大鼠放回籠內(nèi)，并對大鼠手術(shù)傷口和整體狀態(tài)進行密切觀察。2）角叉菜膠不同注射部位對模型的影響實驗分組。將12只大鼠采用隨機數(shù)字表法按體質(zhì)量隨機分為A、B、C3個不同注射部位組，均采用文獻報道最小濃度即1%角叉菜膠生理鹽水進行注射。A組：前列腺左、右腹側(cè)葉各注射50 μL。B組：前列腺背側(cè)葉注射100 μL。C組：前列腺左、右腹側(cè)葉各注射50 μL，背側(cè)葉注射100 μL。在注射7 d后取材觀察病理指標，技術(shù)路線見圖1。3）角叉菜膠不同注射劑量對模型的影響實驗分組。將12只大鼠采用隨機數(shù)字表法按體質(zhì)量隨機分為D、E 2個不同注射劑量組，根據(jù)“角叉菜膠不同注射部位對模型的影響實驗”結(jié)果，選取A組方案作為注射部位使用方案，同時提升注射濃度為3%并增加注射點為每側(cè)2針，其中，D組每針注射量為50 μL;E組每針注射量為80 μL。注射7 d后取材觀察病理指標，技術(shù)路線見圖2。4）角叉菜膠不同注射濃度對模型的影響及模型穩(wěn)定性評價實驗分組。綜合上述2個實驗的研究結(jié)果，將33只大鼠采用隨機數(shù)字表法按體質(zhì)量隨機分為F、G、H3組，分別給予1%、3%、5%角叉菜膠生理鹽水溶液，于前列腺左、右腹側(cè)葉各注射角叉菜膠溶液50 μL。在注射7 d后進行模型評價，并觀察注射后第21天、第35天的模型穩(wěn)定性，技術(shù)路線見圖3。

1.2.2 檢測指標與方法 大鼠麻醉后取下前列腺組織，放入組織固定液固定24 h，根據(jù)HE染色標準化操作流程，進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，制成3～5 mm切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察前列腺組織病理形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 對病理結(jié)果進行頻數(shù)和百分比統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 角叉菜膠不同注射部位對模型的影響 由于手術(shù)造成動物死亡，12只大鼠取材后共獲得合格樣本9個。其中，左、右腹側(cè)葉注射組（A組）100%出現(xiàn)了腹側(cè)葉巨噬細胞增殖聚集改變，同時50%的大鼠出現(xiàn)腹側(cè)葉混合炎癥細胞浸潤;僅注射背側(cè)葉組（B組）有33.3%出現(xiàn)背側(cè)葉巨噬細胞增殖聚集現(xiàn)象，亦有33.3%的巨噬細胞增殖聚集現(xiàn)象出現(xiàn)于腹側(cè)葉;左、右腹側(cè)葉及背側(cè)葉同時注射組（C組）僅在腹側(cè)葉出現(xiàn)了巨噬細胞增殖聚集和混合炎癥細胞浸潤，但3組的病理表現(xiàn)均為輕微或輕度。見表1、圖4。由此可見，A組方案即左、右腹側(cè)葉注射組病理一致性較好，但由于注射濃度及劑量較小，故病變程度較輕。

2.2 角叉菜膠不同注射劑量對模型的影響 當(dāng)每針注射50 μL時（D組），大鼠前列腺同時出現(xiàn)巨噬細胞增殖聚集及混合炎癥細胞病理改變，且分布相對均衡;每針注射80 μL時（E組），有83.3%的大鼠出現(xiàn)了重度巨噬細胞增殖聚集及輕微的混合炎癥細胞浸潤。見表2、圖5。因此，每針注射50 μL更能體現(xiàn)慢性前列腺炎的炎癥狀態(tài)。

2.3 角叉菜膠不同注射濃度對模型的影響及模型穩(wěn)定性評價結(jié)果 造模7 d后，G組1只因前列腺組織與腹腔粘連，未取獲取合格組織樣本;H組在造模手術(shù)后死亡1只，故最終納入合格大鼠13只。其中，注射1%角叉菜膠（F組）的病理改變最輕，注射3%角叉菜膠（G組）和5%角叉菜膠（H組）的病理改變均大于1%角叉菜膠組，且以3%角叉菜膠注射組（G組）的模型一致性較好。見表3、圖6。對各組模型穩(wěn)定性進行評價，研究結(jié)果可知，在注射角叉菜膠21 d后，不同濃度組病理改變基本相當(dāng);在注射角叉菜膠35 d后，各組均有一定程度的病理改變，其中注射3%角叉菜膠組病理改變的持續(xù)性最好。故該模型在造模21 d后和35 d后仍具有穩(wěn)定性，且注射3%角叉菜膠組（G組）的模型穩(wěn)定性最佳。見表4、圖7。

3 討論

3.1 角叉菜膠致大鼠CP常用制備方案 目前雖然有較多研究在使用角叉菜膠致大鼠CP模型，但其中具體的實驗參數(shù)卻不盡相同。由于大鼠前列腺分為腹側(cè)葉（左右各一）及背側(cè)葉，故注射部位及取材部位的選擇尤為重要，同時，不同文獻報道了不同的注射劑量和注射濃度以及不同的成模周期和穩(wěn)定性[5-16]。因此，經(jīng)查閱相關(guān)文獻，將常用的角叉菜膠致大鼠CP模型制備方法及觀察內(nèi)容進行總結(jié)。見表5。并在此基礎(chǔ)上設(shè)計并開展了本項研究工作。

3.2 角叉菜膠不同注射部位、劑量、濃度對CP模型的影響 通過研究可以看出，角叉菜膠不同注射部位、不同注射劑量以及不同注射濃度對大鼠慢性前列腺炎模型的最終形成均存在一定程度的影響。

在注射部位的選擇上，因大鼠前列腺有左、右腹側(cè)葉與背側(cè)葉之分，不僅需要考慮注射角叉菜膠后病理改變的一致性，實驗操作流程的便捷性和規(guī)范性也值得關(guān)注。從本實驗可以看出，腹側(cè)葉是角叉菜膠注射的理想位置。由于腹側(cè)葉靠近膀胱兩側(cè)，大鼠開腹后視野暴露良好，相較背側(cè)葉操作簡便，能夠有效避免因翻轉(zhuǎn)膀胱尋找背側(cè)葉所致的腹腔臟器牽拉，同時在病理表現(xiàn)上，單純注射腹側(cè)葉時各鼠病理改變相對一致。在實驗中還發(fā)現(xiàn)，無論是巨噬細胞增殖聚集，還是混合炎癥細胞浸潤，前列腺組織病理改變往往發(fā)生在角叉菜膠的注射部位附近，不易在全部前列腺中擴散，因此在實際操作過程中，左、右兩腹側(cè)葉側(cè)注射時位置應(yīng)相對對稱，在進行模型評價及藥物干預(yù)研究中，也應(yīng)選取注射部位附近的前列腺組織進行觀察，以保證實驗結(jié)果的真實性和可靠性。

在角叉菜膠注射劑量的選擇上，文獻報道中常見總注射劑量介于20～200 μL之間，腹側(cè)葉總的注射量為100 μL，發(fā)現(xiàn)引起的炎癥反應(yīng)很輕，造成的模型難以評價藥效，故選擇了總注射量為200 μL（每針50 μL）。我們還對更高劑量（即總共320 μL，每針80 μL）進行了探究，前期預(yù)試發(fā)現(xiàn)若每針大于100 μL則可能導(dǎo)致溶液滲出，故選取了每針50 μL和100 μL中間的一個量，即80 μL。為了讓角叉菜膠更均勻地分布于前列腺組織，本研究優(yōu)化了注射方法，運用了多點注射法，分別于左、右腹側(cè)葉各注射2針，在每側(cè)葉上1/3處和下1/3處進針，針尖朝向該葉中部進行注射，由于大鼠前列腺組織有一定的韌性，故在操作時應(yīng)當(dāng)平穩(wěn)進針、緩慢推注，以免造成角叉菜膠漏出或?qū)η傲邢俳M織造成損害。操作流程規(guī)范化后，角叉菜膠能夠均勻注入大鼠前列腺組織中，且不會產(chǎn)生滲漏，保證了注射量的穩(wěn)定性。通過比較每針50 μL和80 μL對模型的影響，我們可以看到，每葉各注射50 μL時，大鼠的病理表現(xiàn)更為均衡，也更能體現(xiàn)慢性前列腺炎的炎癥狀態(tài)。因此，我們最終確立了在左、右腹側(cè)葉各注射2針，每針50 μL，合計200 μL的注射方法。

在角叉菜膠注射濃度的選擇上，文獻報道中多為1%和3%，我們對更高濃度5%也進行了探究，故設(shè)計了1%、3%、5%3個濃度組，研究結(jié)果顯示3%的病理結(jié)果一致性較好。1%濃度的角叉菜膠造成的炎癥反應(yīng)較輕，在后續(xù)的藥物干預(yù)實驗中，不便于評價藥物的療效;5%濃度的角叉菜膠比較黏稠，容易出現(xiàn)抽取到注射器時較困難和溶解度不佳的問題，最終影響了模型的病理評價。

關(guān)于模型的成模時間及穩(wěn)定性，文獻報道中以注射后7 d成模為多，觀察節(jié)點最遲在注射后30 d。我們在實驗中對此進行了驗證，發(fā)現(xiàn)在注射7 d后能成功制作該模型，模型在注射后第21天和注射后第35天仍有較好的穩(wěn)定性，故得出該模型成模后至少能維持4周，在藥物干預(yù)實驗中能滿足給藥4周以內(nèi)的要求。

綜合研究結(jié)果，應(yīng)用角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠CP模型時，最優(yōu)方案為用3%角叉菜膠生理鹽水向前列腺左、右腹側(cè)葉各注射兩針，每針50 μL，手術(shù)7 d后能制作成較穩(wěn)定的CP模型，且該模型能維持至少4周。

3.3 CP模型制備中的其他關(guān)鍵因素 本研究除了考察角叉菜膠注射部位、劑量、濃度及模型穩(wěn)定性因素之外，對于影響CP模型制備的其他關(guān)鍵因素也進行了總結(jié)和思考。首先，在大鼠種屬選擇上，雖然SD大鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠、Wistar大鼠、Copenhagen大鼠均有報道用以制備CP模型，但本研究最終選取SD大鼠，是因為相較其他4種大鼠，其自發(fā)CP的概率較低，能夠避免自發(fā)性CP發(fā)生對模型建立的影響[17]，且SD大鼠具有較好的適應(yīng)性和抗病能力，能夠更好地耐受手術(shù)創(chuàng)傷。其次，在CP臨床患者觀察中，其病理表現(xiàn)主要為混合炎癥細胞浸潤[18-19]，而角叉菜膠誘導(dǎo)所致的CP大鼠模型則表現(xiàn)為以巨噬細胞增殖聚集為主，伴有散在混合炎癥細胞浸潤的病理改變，存在一定的物種差異。這是由于慢性前列腺炎為非特異性慢性炎癥，又以單核巨噬細胞系統(tǒng)的激活作為重要特征[20]，由于混合炎癥細胞浸潤直接反映機體對損傷的持續(xù)炎癥反應(yīng)，故在臨床中為慢性前列腺炎的典型病理表現(xiàn)。而混合炎癥細胞包含單核細胞、淋巴細胞、漿細胞，單核巨噬細胞系統(tǒng)包括血液中的單核細胞和組織中的巨噬細胞，故在大鼠CP模型中，出現(xiàn)了以巨噬細胞增殖聚集為主，伴有散在混合炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象，因此在評價大鼠CP病理表現(xiàn)時，不能簡單地與臨床CP病理表現(xiàn)相對應(yīng)，需加以區(qū)別應(yīng)用。與此同時，病理觀察時顯微鏡物鏡的放大倍數(shù)對于觀察大鼠前列腺組織的炎癥表現(xiàn)也存在一定的影響，我們初期根據(jù)常規(guī)觀測倍數(shù)采用物鏡放大40倍進行觀察，但視野偏小，后期通過調(diào)整發(fā)現(xiàn)，物鏡放大倍數(shù)為20倍時即可清晰觀察病變部位，且視野更廣，更便于病理結(jié)果的評價，故采用物鏡放大倍數(shù)為20倍較為適宜。

本研究所采用的角叉菜膠是從紅藻中提取而得到的一種多糖，含有多個重復(fù)的D-半乳糖與3，6-無水-D-半乳糖，平均分子量大于100 kDa[21]，是誘導(dǎo)非特異性炎癥的經(jīng)典試劑。除應(yīng)用角叉菜膠進行CP誘導(dǎo)之外，還有以下幾種CP模型的常用建立方法。1）化學(xué)性誘導(dǎo)CP模型：如Lang等[22]使用化學(xué)刺激物（乙醇和二硝基苯磺酸）來去除前列腺黏膜內(nèi)表面的屏障作用，誘導(dǎo)大鼠無菌性前列腺炎的發(fā)生;2）自發(fā)性CP模型：如Naslund等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Lewis大鼠和Wistar大鼠均可自發(fā)CP，且前者的發(fā)病率高于后者;3）去勢結(jié)合雌激素誘導(dǎo)CP模型：Wilson等[24]和Kamijo等[25]采用大鼠去勢加雌二醇誘導(dǎo)CP發(fā)生;4）自身免疫反應(yīng)誘導(dǎo)CP模型：如Jackson等[26]利用不同鼠種研究探索自身免疫性建模方式在不同群種鼠類上的特異性等。此4種模型分別針對CP不同的發(fā)病原因和發(fā)病機制而設(shè)，在特殊類型的CP模型構(gòu)建中常被使用。由于角叉菜膠誘導(dǎo)的化學(xué)性CP模型造模方法較簡單，建模成本低，成模時間短，僅需7 d，受其他因素的干擾較少，故在實驗中更為常用[27]。

此外值得注意的是，在造模手術(shù)中，應(yīng)嚴格執(zhí)行無菌操作，注意避免臟器牽拉，不要損傷膀胱等重要臟器，縫合前應(yīng)將各臟器歸回原位。手術(shù)用縱切口比橫切口能減少出血量，手術(shù)縫合完畢后，應(yīng)該用聚維酮碘仔細消毒，并將血跡擦干凈，防止大鼠嗅到氣味后，咬斷縫合線。如果手術(shù)中損傷了膀胱等臟器，或出血較多，或血跡未擦干凈等均會增加大鼠感染和死亡的概率，因此，熟練的操作技術(shù)和對細節(jié)的把控對于角叉菜膠致CP模型的成功制備具有重要意義。

CP作為臨床常見疾病，積極開展基礎(chǔ)研究，探尋其發(fā)病機制、尋找有效治療手段具有重要的臨床意義和研究價值。動物模型是開展基礎(chǔ)研究的前提，本研究針對角叉菜膠致大鼠CP模型制備中的關(guān)鍵因素進行了探索，明確了角叉菜膠注射部位、劑量、濃度等對CP模型的影響，并在最優(yōu)因素組合基礎(chǔ)上評價了模型的穩(wěn)定性，同時針對CP大鼠模型制備中的難點問題進行了思考，為CP整體動物水平的研究提供簡便、可靠、易于推廣應(yīng)用的動物模型。在未來的研究中，我們將進一步關(guān)注角叉菜膠致大鼠CP模型的宏觀、微觀指標變化，通過對比臨床CP患者與大鼠CP模型的異同點找到可能的干預(yù)靶標，為CP的發(fā)病機制研究及新藥研發(fā)提供更多實驗室依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

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（2020-08-31收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）