基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)探討藥對赤芍-牡丹皮治療銀屑病的作用機制

劉琪琪 王春柳 支文冰 劉洋 李純 周潔 張紅 宗時宇 趙一丁 李曄

摘要 目的：基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)研究赤芍-牡丹皮藥對治療銀屑病的作用機制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫檢索赤芍-牡丹皮的化學成分及其相關(guān)靶點，利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索銀屑病相關(guān)靶點，通過Venny 2.1.0映射得到赤芍-牡丹皮治療銀屑病的交集靶點，利用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.7.1構(gòu)建交集靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI），利用R語言進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析;利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡互作圖。采用AutoDock4.2.1軟件評價主要藥效成分與核心靶點的結(jié)合作用力。結(jié)果：篩選得到赤芍-牡丹皮藥對通過11個活性成分作用于70個交集靶點，通過調(diào)控細胞的氧化刺激反應和生物刺激反應等生物過程以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、輔助性T細胞17（TH17）細胞分化等相關(guān)途徑共同發(fā)揮治療銀屑病作用。分子對接結(jié)果表明，赤芍-牡丹皮中槲皮素（Quercetin）、芍藥苷（Paeoniflorin）、山柰酚（Kaempferol）、芍藥醇（Baicalein）與AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK8、AKT1、JUN、TNF具有較好的結(jié)合能力。結(jié)論：通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)系統(tǒng)地探討赤芍-牡丹皮藥對治療銀屑病的作用機制，為后期的實驗提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 銀屑病;網(wǎng)絡藥理學;分子對接;赤芍-牡丹皮

Abstract Objective：To explore the mechanism of the treatment of psoriasis by Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan by basing on network pharmacology.Methods：In this experiment，the active components and related targets of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan were searched by TCMSP database，and the targets related to psoriasis were searched by DisGeNET database.The intersecting targets of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan in the treatment of Psoriasis were obtained by Venny 2.1.0 mapping，and the interaction network map of intersecting targets was constructed by STRING database and Cytoscape3.7.1.（PPI）; R language was used for gene ontology （GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis.The network interaction diagram was constructed by using Cytoscape3.7.1 software.AutoDock 4.2.1 software was used to evaluate the binding force of the main medicinal ingredients and the core target.Results：In this experiment，11 active components and 70 targets of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan in the treatment of psoriasis were obtained.By regulating the biological processes such as oxidative stimulation and biological stimulation of cells，as well as related pathways such as the mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway，helper T cell 17 （TH17） cell differentiation and other related pathways，they played a role in the treatment of psoriasis.The molecular docking results showed that Quercetin，Paeoniflorin，Kaempferol，Baicalein and AKT1，VEGFA，MAPK1，MAPK8，AKT1，JUN，TNF in the red peony cortex has good binding ability.Conclusion：Through the method of network pharmacology，this experiment systematically discusses the mechanism of Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan in the treatment of psoriasis，which provides a theoretical basis for the later experiment.

Keywords Psoriasis; Network pharmacology; Molecular docking; Paeoniae Rubra Radix-Cortex moutan

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.001

銀屑?。≒soriasis）是一種表皮自穩(wěn)狀態(tài)異常的慢性炎癥性皮膚病。據(jù)調(diào)查，全球發(fā)病率為0.9%～8.5%[1]，我國發(fā)病率為0.5%～4.6%[2]。由于銀屑病發(fā)病特征的不同，又可分為斑塊型銀屑病、膿皰型銀屑病、紅皮病型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病等[3]。銀屑病可引起炎癥反應及心血管疾病等并發(fā)癥，危害患者的身心健康[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為銀屑病與脂質(zhì)代謝、免疫及炎癥反應、細菌感染和精神心理等多種因素相關(guān)，其中機體內(nèi)免疫功能紊亂是目前比較認可的主要發(fā)病機制[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療可引起身體不同程度的不良反應，無法根治。中醫(yī)可根據(jù)患者不同體質(zhì)，對證下藥，達到標本兼治。

赤芍和牡丹皮是用于治療血熱證、血燥證銀屑病代表性藥物。赤芍、牡丹皮均為毛茛科植物[6]。赤芍（Paeoniae Rubra Radix）為毛茛科（Ranunculaceae）植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根，具有清熱活血，化瘀止痛的功效[7]。芍藥最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后《本草綱目》對赤芍、白芍加以區(qū)分，記載“白補而收，赤散而瀉”[8]。牡丹皮（Cortex moutan）為毛茛科植物牡丹（Paeonol saffuruticosa Andr.）的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[9]。牡丹皮最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后漢末期張仲景所著《金匱要略》對牡丹皮的藥用做了更進一步的論述[10]。赤芍-牡丹皮藥對相須使用，協(xié)同增效，為活血化瘀常用藥對，來源于金匱要略中“溫經(jīng)湯”[11]。根據(jù)研究報道，牡丹皮與赤芍均能抑制血小板凝集，二者配伍使用抑制作用增強[12]，可用于治療血瘀型和血熱型銀屑病。

網(wǎng)絡藥理學利用生物信息學拓寬我們對藥物作用的理解，從而促進藥物發(fā)現(xiàn)。我們利用網(wǎng)絡藥理學建立藥物靶點通路和網(wǎng)絡，以預測赤芍-牡丹皮治療銀屑病可能的蛋白質(zhì)靶點以及這些靶點與藥物之間的主要相互作用。網(wǎng)絡藥理學能夠從多種角度闡釋中藥多成分、多靶點、多通路、多疾病的藥理作用機制。分子對接采用公共數(shù)據(jù)庫和公開發(fā)表的已有數(shù)據(jù)，利用AutoDock4.2.0軟件進行半柔性對接，研究蛋白質(zhì)受體和藥物小分子之間結(jié)合能力。目前對赤芍-牡丹皮治療疾病的作用機制少見報道，本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術(shù)從系統(tǒng)和整體的層面來研究“赤芍-牡丹皮”治療銀屑病的藥理機制，為今后研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥化學成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.Nwu.edu.cn/tcmsp.Php）檢索赤芍-牡丹皮的所有化學成分，利用ADME參數(shù)，即口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件篩選活性成分[13]。

1.2 靶點篩選 利用TCMSP的檢索赤芍-牡丹皮化學成分相關(guān)的靶點，并從UniProt數(shù)據(jù)庫中（https：//www.uniprot.org），輸入靶點蛋白名稱限定物種為“Homo sapiens”，將所有蛋白名稱的進行標準化。采用DisGeNET（http：//www.disgenet.org）尋找銀屑病疾病靶點。將赤芍-牡丹皮及銀屑病的靶點導入Venny 2.1.0得到韋恩圖及交集靶點。

1.3 成分靶點蛋白相互作用分析 將赤芍-牡丹皮及銀屑病的交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）[14]中，輸入靶點名稱限定物種為“homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡，導出node1、node2、combined score值導入Cytoscape軟件，利用“Network Analyzer”計算赤芍-牡丹皮靶點PPI網(wǎng)絡的拓撲學參數(shù)。并設(shè)置節(jié)點大小及顏色反映Degree值、Score值，最終得到PPI網(wǎng)絡圖。通過Cytoscape的插件Cytohubba獲取PPI網(wǎng)絡中連接度前10的hub蛋白質(zhì)。

1.4 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將赤芍-牡丹皮藥對及銀屑病的34個交集靶點通過R軟件中ClusterProfiler程序包進GO和KEGG通路富集分析。顯著性閾值設(shè)為P≤0.05，做氣泡圖或條形圖可視化。

1.5 網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 將赤芍-牡丹皮藥對中的化學成分，交際靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中，利用Cytoscape3.7.1軟件中的Merge功能，構(gòu)建中藥-活性成分-靶點（Herb-component-target，H-C-T）網(wǎng)絡圖進行可視化分析，利用根據(jù)網(wǎng)絡中的拓撲學參數(shù)分析，將中心度值（Betweenness Centrality，BC）、親中心度值（Closeness Centrality，CC）、度值（Degree）進行分析，篩選出赤芍-牡丹皮度值較高的藥效成分。將KEGG富集分析的通路及相關(guān)靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中，構(gòu)建靶點-通路（Target-pathway，T-P）相關(guān)作用網(wǎng)絡圖。利用根據(jù)網(wǎng)絡中的拓撲學參數(shù)分析，將BC、CC、Degree進行分析，篩選出赤芍-牡丹皮度值較高相關(guān)靶點。

1.6 分子對接 AutoDock軟件中主要包含AutoGrid和AutoDock 2個程序。其中AutoGrid主要負責格點中相關(guān)能量的計算，而AutoDock則負責構(gòu)象搜索及評價。利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載赤芍-牡丹皮治療銀屑病的相關(guān)靶點PDB格式文件，并利用PyMOL軟件刪除蛋白質(zhì)水分子及多余的配體，利用TCMSP下載赤芍-牡丹皮的有效化合物mol2格式文件。通過AutoDock4.2.0軟件中進行分子對接，在軟件中分別對蛋白質(zhì)及配體進行加氫、加電荷、加Root處理。輔助程序AutoGrid用于生成對接區(qū)，對接區(qū)定義為以配體結(jié)合位點為中心的60×60×60三維網(wǎng)格，網(wǎng)格間距為0.375。通過AutoDock tools計算對接結(jié)合能，探索化合物與靶標之間的結(jié)合相互作用。按照幾何互補、能量互補以及化學環(huán)境互補的原則，進行分子間相互作用的識別，并預測2個分子之間最佳的結(jié)合模式[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤芍-牡丹皮活性成分的篩選 共得到赤芍中有119個成分，牡丹皮中含有55個成分。根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18篩選條件，共得到赤芍的29個活性成分，牡丹皮的11個活性成分。

2.2 赤芍-牡丹皮活性成分及靶點信息 共得到赤芍153個靶點，牡丹皮192個靶點。并從DisGeNET數(shù)據(jù)庫中得出的銀屑病靶點共有817個靶點，通過Venny 2.1.0映射得到TP53、JUN、IL6等70個赤芍-牡丹皮及銀屑病的交集靶點。見圖1。

2.3 交集靶點PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建 該網(wǎng)絡圖共有70個節(jié)點，棱數(shù)290條。其Degree值越大，節(jié)點越大;Combine Score 值越大，顏色越明亮。Degree值越小，節(jié)點越小;Combine Score值越小，顏色越明亮。見圖2。其中較大度值的IL6、MAPK1、MAPK3可能是治療銀屑病的重要靶點，并表明赤芍-牡丹皮藥對治療銀屑病可通過多個靶點共同發(fā)揮療效。本實驗利用Cytoscape插件CytoHubba獲得前10的hub蛋白質(zhì)。見圖3。表明銀屑病可能通過連接度高的TP53、JUN、IL6等靶點發(fā)揮療效，達到治療目的。

2.4 GO功能分析 GO分為分子功能（Molecular Function，MF）、生物過程（Biological Process，BP）、和細胞組分（Cellular Component，CC）3個部分。其中橫坐標表示富集靶點的數(shù)目，P值代表富集靶點的顯著性，P值越小，顏色越紅，反之則偏向藍色。在細胞組分中主要富集到細胞質(zhì)、核轉(zhuǎn)錄因子、血小板、RNA聚合酶等;其分子功能主要富集到細胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性等;其生物過程主要涉及細胞的氧化刺激反應、細胞外刺激反應、生物刺激反應等。重點通路中圓圈代表富集靶點的數(shù)目，重點通路圖中可得出TNF、MAPK1、MAPK3、VEGF，它們不僅作用于其中一條通路，還參與很多不同的途徑，體現(xiàn)了中藥多靶點、多通路的特點。見圖4。

2.5 靶點蛋白KEGG通路分析 共富集在157條生物通路，選取有顯著性差異的20條通路，做氣泡圖進行可視化。見圖5。P值代表富集靶點的顯著性，P值越小，顏色越紅，反之則偏向藍色。圓圈代表富集的靶點數(shù)目，圓圈越大，表示通路富集的靶點越多。體現(xiàn)了中藥同一靶點可參與不同的生物學過程，并且通過改善生物過程達到治療疾病的目的。

2.6 網(wǎng)絡圖構(gòu)建分析 “中藥-活性成分-靶點（H-C-T）”網(wǎng)絡見圖6。根據(jù)靶點可得出所對應的赤芍-牡丹皮藥對的活性成分。見表1。兒茶素、芍藥醇、槲皮素連接度最高。靶點-通路（T-P）網(wǎng)絡見圖7。得出BCL2、IL-6、TNF等靶點作用于TNF信號通路、Th17細胞分化、MAPK信號通路等通路治療銀屑病。活性成分的靶點可作用于不同的生物學通路，體現(xiàn)了中藥成分多成分，多靶點，多通路的特征。

2.7 分子對接結(jié)果 赤芍-牡丹皮藥對與靶點分子對接9個結(jié)果見圖8。由于分子對接過程中的構(gòu)想不同，結(jié)合能會產(chǎn)生許多不同的結(jié)果。赤芍-牡丹皮藥對的分子對接結(jié)果見表2。赤芍-牡丹皮中槲皮素（Quercetin）、芍藥苷（Paeoniflorin）、山柰酚（Kaempferol）、芍藥醇（Baicalein）與AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK8、AKT1、JUN、TNF相關(guān)基因預測出治療銀屑病的最佳結(jié)合模式。

3 討論

銀屑病主要與炎癥反應、免疫反應和細胞增殖有關(guān)。銀屑病患者的特征性組織病理變化為內(nèi)皮細胞增殖，免疫細胞，血管數(shù)量增加，通透性上升，真皮乳狀頭層微血管擴張迂曲[16]。赤芍-牡丹皮配伍有清熱涼血、活血化瘀功效，可抑制銀屑病內(nèi)皮細胞過度增殖[17]，有效的治療銀屑病，提高患者生命質(zhì)量。其中利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到的活性成分中丹皮酚未達到ADME參數(shù)篩選條件，但已被證實與銀屑病密切相關(guān)。韓朔[18]證實芍藥苷可上調(diào)銀屑病模型SOCS1基因表達水平，并對能夠Jak-STAT信號通路下調(diào)血清中炎癥介質(zhì)表達水平，治療銀屑病效果顯著[19-20]。丹皮酚可能通過下調(diào)MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路中細胞因子表達水平，能夠有效地下調(diào)TNF的表達水平，達到抗炎的作用[21]。丹皮酚可抑制脂多糖誘導產(chǎn)生的細胞因子，同時也可誘導血管內(nèi)皮細胞中TNF的釋放，達到保護血管內(nèi)皮細胞的機制[22]。赤芍-牡丹皮配伍中的活性成分能夠通過調(diào)整炎癥介質(zhì)水平能夠有效治療銀屑病。由此推測赤芍-牡丹皮藥對中的代表性活性成分芍藥苷和丹皮酚通過信號轉(zhuǎn)導通路等達到治療銀屑病的目的，體現(xiàn)了赤芍-牡丹皮藥對的多成分、多通路的作用機制。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，赤芍-牡丹皮治療銀屑病的基因在分子功能中主要富集到細胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性等;生物學過程中主要富集到細胞的氧化刺激反應、細胞外刺激反應、生物刺激反應等。其中赤芍-牡丹皮交集靶點中白細胞介素-6（IL-6）有強大的致炎性，能促進機體產(chǎn)生趨化因子，與受體結(jié)合產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)。IL-6與銀屑病表皮細胞過度增殖的病理機制關(guān)系密切，并能誘導多種下游炎癥介質(zhì)形成炎癥級聯(lián)反應[23]。腫瘤壞死因子（TNF）由巨噬細胞分泌，可誘導某些腫瘤細胞系的細胞死亡，誘導細胞分化。TNF在銀屑病中起重要作用，在炎癥反應和免疫疾病中具有核心作用[24]。TNF水平升高可促進炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、IL-8合成[25]。銀屑病的發(fā)生機制與IL-6、TNF、IL-8等炎癥介質(zhì)有密切聯(lián)系。根據(jù)GO富集分析得銀屑病可通過調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達、炎癥介導途徑、激酶傳導途徑等方面發(fā)揮治療銀屑病的作用[26]。赤芍-牡丹皮藥對的主要活性成分通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)通路，細胞的外刺激反應和生物刺激反應等銀屑病發(fā)病機制相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮治療銀屑病的作用。

通過KEGG富集到157條通路，篩選出具有顯著性差異的20條信號通路，其中Th17細胞分化（Th17 Cell Differentiation）通路上的IL-6、TNF、IL-1β靶點在促進皮膚組織炎癥和損傷上是發(fā)揮協(xié)同調(diào)節(jié)作用的[27]。IL-6、TNF、IL-1β是Th17細胞分泌的最重要的前炎癥介質(zhì)，促進局部血管形成，加速表皮細胞增殖，加重局部炎癥反應，導致病程遷延慢性化，通過下調(diào)炎癥介質(zhì)抑制銀屑病表皮內(nèi)皮細胞增殖，達到治療銀屑病的目的。MAPK信號通路接受刺激信號的傳遞，通過酶的級聯(lián)反應把信號傳遞至細胞核內(nèi)及調(diào)控下游因子[28]。銀屑病的發(fā)病機制與角質(zhì)形成細胞、炎癥細胞、物理刺激等病理關(guān)系密切，MAPK信號通路異?？蓪е录毎惓Ｔ鲋撑c分化[29]。MAPK信號通路通過炎癥介質(zhì)的調(diào)控有效地降低銀屑病的炎癥反應[30]。由此推測，赤芍-牡丹皮藥對在治療銀屑病過程中參與Th17細胞分化、MAPK信號通路等信號轉(zhuǎn)導通路達到治療銀屑病的目的。

分子對接證明赤芍-牡丹皮中藥效成分槲皮素、芍藥苷、山柰酚、芍藥醇與AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK8、AKT1、JUN、TNF均小于-5 kcal/mol，具有較好的結(jié)合能力。推測赤芍-牡丹皮的藥效成分可能通過作用于相關(guān)靶點發(fā)揮治療作用。

綜上所述，運用網(wǎng)絡藥理學方法分析赤芍-牡丹皮藥對銀屑病的作用機制，分析篩選得到該藥對中可能的芍藥苷、丹皮酚、槲皮素等11個活性成分，以及IL6、IL-1β、TNF、VEGFA、MAPK8、MAPK3等70個作用靶點。同時，通過GO富集分析得到了赤芍-牡丹皮藥對治療銀屑病涉及的細胞氧化刺激反應和生物刺激反應等生物過程;KEGG富集分析得到赤芍-牡丹皮藥對治療銀屑病涉及的Th17細胞分化、MAPK信號通路和TNF信號通路等27條信號通路及分子對接預測到活性成分與靶點的最佳結(jié)合模式，可以為進一步進行赤芍-牡丹皮配伍治療銀屑病的多重藥理作用機制研究提供參考。

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（2020-08-26收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）