基于唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討慢性胃炎和胃癌脾虛證的分子機制

雷慧珺 曹建中 李亮 謝夢洲 付越 李豐

摘要 中醫(yī)證候研究是中醫(yī)藥學(xué)的研究熱點，基于唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討疾病證候的復(fù)雜性并揭示其科學(xué)內(nèi)涵具有巨大科研潛力?，F(xiàn)分析了慢性胃炎和胃癌脾虛證的聯(lián)系以及疾病的進展過程?；谕僖和饷隗wexoRNA表達譜，運用唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)的學(xué)科優(yōu)勢，在中醫(yī)學(xué)同病異證，異病同證的理論指導(dǎo)下，提出尋找其具有臨床價值的差異表達的分子標志物。進一步推動證候物質(zhì)基礎(chǔ)的定量、定性研究，并從分子機制角度切入促進中醫(yī)腫瘤證候的精準化發(fā)展。

關(guān)鍵詞 唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué);唾液外泌體;中醫(yī)證候;同病異證;異病同證;差異分子標志物;精準化

Abstract The research of traditional Chinese medicine （TCM） syndrome is the key problem of TCM research，and it is of great research potential to explore the complexity of disease syndrome and reveal its scientific connotation based on saliva transcriptomics.This paper analyzes the link between chronic gastritis and gastric cancer spleen deficiency syndrome and the progression of the disease.Based on the exoRNA expression profile of salivary exosomes，using the academic advantages of salivary transcriptomics，and the guidance of the theory of Chinese medicine same disease with different syndrome and different disease with the same syndrome，we propose to find molecular markers with different expression of clinical value.We further promote the quantitative and qualitative research on the material basis of syndrome，and promote the precise development of the tumor certificate of Chinese medicine from the perspective of molecular mechanism.

Keywords Saliva Transcriptomics; Saliva Exosome; Traditional Chinese medicine syndrome; Same disease with different syndrome; Different disease with the same syndrome; Differential molecular markers; Precision

中圖分類號：：R241;R573文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.024

人類基因組計劃（Human Genome Project，HGP）全基因組測序的完成，標志著人類進入了后基因組學(xué)時代，新的以“組學(xué)”為研究標志的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)在生命科學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。證的研究是對疾病發(fā)生發(fā)展過程中某一特定階段疾病本質(zhì)的觀察，是對致病因素與機體的反應(yīng)兩方面具體情況的有機綜合，是正邪抗爭態(tài)勢情況的反映。相關(guān)研究表明，中醫(yī)的證可以和臨床生化指標相同，作為疾病的一類臨床表征，中醫(yī)的證是有物質(zhì)基礎(chǔ)的[1]。證可以通過基因水平上的生物標志物來量化和表征。唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)的系統(tǒng)性、動態(tài)性、復(fù)雜性與中醫(yī)學(xué)的整體觀念、病證結(jié)合模式、辨證論治理論有極大相似性，在揭示中醫(yī)疾病的證候本質(zhì)方面具有巨大潛力?；谕僖和饷隗wexoRNA表達譜，尋找不同病證的差異表達的分子標志物，有助于進一步推動中醫(yī)證候的客觀化研究。

1 慢性胃炎與胃癌的演變進展

慢性胃炎是指多種因素引起的胃黏膜的慢性炎癥或萎縮性病變[2-3]，是臨床常見的慢性消化系統(tǒng)疾病之一。流行病學(xué)研究表明，健康人群慢性胃炎發(fā)病率超過一半，小部分患者最終甚至發(fā)展成為胃癌[2]。目前國際上公認的腸型胃癌的發(fā)生模式為Correa模式[4]，其發(fā)生發(fā)展可能經(jīng)過如下幾個過程：1）正常人（N）;2）慢性淺表性胃炎（CSG）;3）慢性萎縮性胃炎（CAG）;4）CAG伴腸化（Intestinal Metaplusi）和（或）不典型增生（Dysplasia）;5）GC[3]。

胃癌是臨床上常見的起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤之一，不僅起病隱匿，而且進展迅速且存在高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的風(fēng)險，在我國各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位[1-2，4]。在早期胃癌篩查過程中，由于患者缺乏特異性的具體臨床表現(xiàn)，醫(yī)者通常不能通過癥狀、體征進行臨床確診，所以傳統(tǒng)上使用影像學(xué)檢查和臨床生化、病理檢查進行診斷，但效果并不理想。尋找一種預(yù)防疾病傳變，提高患者5年生存率的早期診斷和治療方法是十分必要的。

2 慢性胃炎和胃癌脾虛證的病因病機及其歷史沿革

在中醫(yī)古籍里，有類似“胃癌”這一病名記載，其可歸屬于“胃反”“反胃”“積聚”“噎膈”“伏梁”“胃脘痛”等的范疇[5]。《太平圣惠方·第四十七卷》指出：“夫反胃者，為食物嘔吐，胃不受食，言胃口翻也?！薄督饏T要略·嘔吐噦下利脈證治》曰：“趺陽脈浮而澀，浮則為虛，澀則傷脾，脾傷則不磨，朝食暮吐，暮食朝吐，宿谷不化，名曰胃反。”《靈樞·邪氣臟腑病形》指出：“胃病者，腹月真脹，胃脘當心而痛。上支兩脅，膈咽不通，食飲不下?！蔽赴┑牟∫蜉^為廣泛和復(fù)雜，主要有外邪犯胃、情志失調(diào)、脾胃素虛，熱毒血瘀、痰瘀壅塞等方面[6]。胃癌的形成是一個本虛標實、虛實夾雜日久積聚成塊的過程[7]。氣滯血瘀、肝氣犯胃、痰濕中阻、胃熱傷陰等實證以及脾胃虛寒、胃陰不足、氣血兩虛等虛證為胃癌的常見中醫(yī)證型[8]，胃癌的中醫(yī)證型也因治療方式的干預(yù)存在著一些動態(tài)變化[9]。

陶麗和楊金坤[10]對1 266例胃癌患者臨床分型研究結(jié)果顯示脾虛型排在第一位。許玲等[11]對767例胃癌患者中醫(yī)辨證分型的臨床分析，結(jié)果提示脾胃虛寒在證型比例中占32.9%排在首位。黃美琴等[12]對154例胃癌患者進行證型頻次分析，結(jié)果顯示進展期胃癌脾胃虛損頻次在氣血虧虛、氣滯血瘀、胃熱陰虛、痰濕凝結(jié)、肝胃不和5種證型中最高。脾胃虛弱，受納失司，升降失調(diào)，運化水濕功能失調(diào)，濕痰飲停滯交阻易結(jié)聚成腫塊。根據(jù)中醫(yī)古籍和古近代醫(yī)家的描述，就胃癌而言，其疾病的發(fā)生發(fā)展過程當中，脾胃虧損是所有病機共同擁有的主線[13]。

中醫(yī)學(xué)認為，慢性胃炎可歸屬于“胃痞”“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇[14-15]。《素問·至真要大論》謂“太陽之復(fù)，厥氣上行……心胃生寒，胸膈不利，心痛痞滿”;《素問·太陰陽明論》說：“飲食不節(jié)，起居不時者，陰受之，陰受之則入五臟，入五臟則月真滿閉塞?！薄端貑枴ぴu熱病論》指出“邪之所湊，其氣必虛”，正氣虧虛是慢性胃炎的發(fā)病關(guān)鍵。脾胃氣虛型是慢性胃炎臨床出現(xiàn)頻次最高的中醫(yī)證型[16]。脾胃共有“后天之本”之稱，脾升胃降，是人體氣機升降的樞紐。五臟六腑、四肢百骸皆賴脾胃運化水谷以充養(yǎng)，為人體正氣之大源。脾胃健旺，正氣抗邪外出;脾胃虛弱，正虛邪侵發(fā)病。因此，脾胃虛弱是胃癌發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，存在于整個癌前、癌變過程中，是胃癌病機的關(guān)鍵所在。

3 唾液活檢，是證候研究的一個新的方向，是一種有前景的臨床檢測手段

在諸多可用于醫(yī)學(xué)診斷的體液，唾液由腮腺、頜下腺、舌下腺、無數(shù)小唾液腺分泌的黏液及齦溝液等組成，其組成與血清相似，包括各種核酸、蛋白質(zhì)及各種小分子。作為人體體液的一部分，其成分水平受機體各種病理生理變化的影響。對于廣泛用于醫(yī)學(xué)診斷的血液來說，血液樣本的分析過程煩瑣、費用昂貴，且存在侵入性問題。如HBV、HCV、DNAs和抗體以及病毒抗原不僅存在于感染患者的唾液中，也與血液樣本有關(guān)，但血清學(xué)指標檢測存在著一定的感染風(fēng)險[17]。相比于唯一與所有器官都有接觸的血液來說，唾液有許多優(yōu)點：1）收集要求不高;2）非侵入性操作;3）樣品處理無感染性風(fēng)險;4）樣品儲藏方便;5）操作經(jīng)濟節(jié)約[18]。

隨著生物化學(xué)微量分析技術(shù)的發(fā)展，唾液代替血液作為診斷指標開始嶄露頭角[17]。作為一種無創(chuàng)的口腔和全身性疾病診斷指示物中很豐富的生物液體，它在早期檢測中具有獨特優(yōu)勢[19]。

唾液被認為與中醫(yī)學(xué)概念的脾臟關(guān)系最直接、最密切。在中醫(yī)五臟化液理論中被這樣描述，“脾在液為涎，腎在液為唾”“脾氣通于口”“口為脾之官”，故可認為脾直接且主要影響唾液的分泌。此外，脾胃通過經(jīng)脈相互絡(luò)屬而構(gòu)成表里相合關(guān)系，脾與胃納運相成，升降相因，燥濕相濟，共同完成水谷精微的受納、轉(zhuǎn)運。因此，唾液可以反映脾胃功能是否正常，從而客觀地反映個體當前的健康狀況，其中包含的分子信息可以在微觀層面上反映疾病的證候變化。唾液活檢本身具有血清學(xué)和其他檢測所不能達到的優(yōu)勢，并且有中醫(yī)古籍診斷理論的支持，正成為當前無創(chuàng)檢驗領(lǐng)域最具潛力和應(yīng)用前景的研究熱點，也是中醫(yī)學(xué)證候研究的創(chuàng)新方向。

4 唾液外泌體exoRNA的新興以及唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)在證候研究中的潛力

作為新興的研究熱點“外泌體”這一名詞是Trams等[19]在1981年在研究細胞核酸外切酶活性時發(fā)現(xiàn)并首次提出的;Johnstone等[20]后又補充發(fā)現(xiàn)外泌體是細胞分泌的一種由脂質(zhì)雙層膜包裹的直徑為30～100 nm大小不一的納米級細胞外囊狀小體，幾乎所有的真核細胞均分泌這種磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的細胞囊泡[21]。

外泌體是由多種細胞經(jīng)過“內(nèi)陷-聚集-分選-融合-外排”等一系列過程分泌的[22-23]。從細胞膜內(nèi)陷形成早期核內(nèi)體開始，mRNA和蛋白質(zhì)分子等開始聚集在早期核內(nèi)體中，后成為晚期核內(nèi)體并且在轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合物及其他相關(guān)蛋白質(zhì)的協(xié)同作用下形成多泡體。多泡體與細胞膜融合后，細胞內(nèi)物質(zhì)以囊泡形式即外泌體釋放到細胞外[24-25]。

作為液體活檢“三駕馬車”（外泌體，循環(huán)腫瘤細胞，游離DNA）之一，外泌體攜帶有親本細胞來源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物信息分子，在細胞間通信、細胞遷移、細胞分化、免疫調(diào)節(jié)等信息交流、物質(zhì)交換過程中扮演著不可或缺的角色[26]。其相關(guān)物質(zhì)可通過直接的膜融合作用、內(nèi)吞作用和配體/受體的相互作用轉(zhuǎn)移到靶細胞，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[27]。外泌體中蛋白質(zhì)、核酸（mRNA、microRNA、DNA等）、脂類等內(nèi)容物可以近似真實地反映其源細胞的特征和狀態(tài)[28-29]。外泌體豐富的內(nèi)含物極其廣泛的存在，使外泌體檢測成為一種非常有潛力的無創(chuàng)診斷方法。新近的研究證明唾液的基因轉(zhuǎn)錄組因其不易降解，具有更好的穩(wěn)定性，包含更多的信息[30]。加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）David Wong實驗室（2004）首次報道了唾液中的細胞exoRNA被用于檢測口腔癌[31]，隨后發(fā)現(xiàn)唾液RNA分子可用于乳腺癌[32]、胰腺癌等癌癥的早期診斷[33]。由于唾液中含有大量RNase，唾液中的exRNA期初并沒有受到重視，最近的研究發(fā)現(xiàn)，唾液中的exRNA大多存在于外泌體中并受到保護。加入表面活性劑后RNA會迅速的分解[34]。研究還發(fā)現(xiàn)唾液中大量的miRNA，piRNA都主要存在于唾液外泌體內(nèi)[35]，這為進一步研究唾液外泌體在全身性疾病尤其是腫瘤領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

基于體積小有保護膜這一特點，腫瘤外泌體在腫瘤細胞之間、腫瘤細胞與周圍細胞之間的信息交流、物質(zhì)交換過程中扮演著重要的信使角色與遠端的受體細胞融合，傳遞蛋白質(zhì)、miRNA和免疫抑制分子）。腫瘤外泌體既可誘導(dǎo)血管生成（有助于建立腫瘤微環(huán)境），形成預(yù)轉(zhuǎn)移龕;又可誘導(dǎo)凋亡細胞毒性T細胞引起免疫逃逸，促進腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移[36-37]。并且相比于正常細胞，腫瘤細胞可釋放更多且內(nèi)容物差異明顯的外泌體。在液體活檢研究領(lǐng)域中，研究發(fā)現(xiàn)以外泌體方式分泌的胃癌細胞高表達CD97可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的MAPK信號通路，促進腫瘤細胞的生長和浸潤[38]。胃癌細胞能通過外泌體選擇性地將let-7釋放出細胞，導(dǎo)致胃癌發(fā)生惡性病變[39]。通過檢測腫瘤細胞外泌體中含有的蛋白質(zhì)和核酸分子或許可以提高腫瘤診斷的特異性和靈敏度。體液中的腫瘤外泌體可視為“液體活檢”的重要組成成分[29]，作為生物標志物在消化腫瘤的各項研究中顯示出積極的意義。腫瘤外泌體或許成為一種有潛在價值的胃癌診療標志物。

5 展望

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)、深度測序技術(shù)等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，唾液近十年來在疾病診斷方面取得了很大發(fā)展，但與中醫(yī)證候研究相結(jié)合還處于早期探索階段。完善唾液分子檢測數(shù)據(jù)庫，建立系統(tǒng)的唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)知識格，規(guī)范證候診斷標準，充分發(fā)揮我國巨大的患者資源優(yōu)勢非常重要。從臨床研究和動物實驗兩方面入手，擴大研究樣本量，可以使數(shù)據(jù)更具重復(fù)性和說服力?；谡n題組之前的研究，提出了具體的研究途徑：1）構(gòu)建同病異證、異病同證的動物模型和收集同病異證、異病同證的臨床患者，并提取樣本作為研究對象;2）對每種疾病進行唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，找到差異表達的exoRNA生物標志物，并進行回復(fù)驗證[40];3）獲得具有臨床意義的疾病證候的生物標志物。希望最后的結(jié)果可以推動基礎(chǔ)研究技術(shù)向臨床椅旁檢測技術(shù)發(fā)展，使中醫(yī)證候研究朝著更加規(guī)范、標準、客觀的方向發(fā)展，推動建立精準的中醫(yī)診治模式。

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（2020-11-17收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）