類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展

吳晶金

【摘 要】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型復(fù)制是研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制及藥物治療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。構(gòu)建一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、與人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理特點(diǎn)相符合的動(dòng)物模型尤為重要。近年來，建立的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，主要包括膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型、佐劑性關(guān)節(jié)炎模型、膠原抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型、降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型、聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型和卵清蛋白誘導(dǎo)的兔類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，但均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)。通過對(duì)近幾年常用的幾種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型進(jìn)行綜述，以期為今后研究更接近人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理特征的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁﹨⒖肌?/p>

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；動(dòng)物模型；發(fā)病機(jī)制；綜述

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫

病[1]。本病以女性多發(fā)，男女患病比例約1∶3。RA控制不佳可致殘，因此研究本病的發(fā)病機(jī)制，探索控制或延緩病情進(jìn)展的治療方法，對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。然而如何復(fù)制出更接近RA的動(dòng)物病理模型一直成為困擾風(fēng)濕免疫專業(yè)學(xué)者的難題，尋找與RA發(fā)病機(jī)制更為接近的動(dòng)物模型對(duì)研究疾病潛在病理、藥物發(fā)現(xiàn)和療效驗(yàn)證具有重要意義[2-3]。近年來，針對(duì)RA動(dòng)物模型的研究方興未艾，除了經(jīng)典的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型及佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）模型以外，又有了膠原抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CAIA）模型、降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（PIA）模型、聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID）模型和卵清蛋白誘導(dǎo)的兔RA（OVA）模型。本文就上述模型最新進(jìn)展做一綜述。

1 常用模型

1.1 CIA模型

1.1.1 CIA模型概述 CIA模型是1977年由Trentham團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的免疫性炎癥關(guān)節(jié)炎模型，以多發(fā)性的四肢末端關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)[4]。CIA發(fā)病是由T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活、炎性因子釋放、Ⅱ型膠原抗體產(chǎn)生等環(huán)節(jié)共同決定的[5]。

1.1.2 CIA模型造模方法[6] 用雙蒸水將冰醋酸稀釋成0.01 mol·L-1，0.2 μm微孔膜過濾除菌，4 ℃保存過夜。用2.5 mL冰醋酸稀釋10 mg牛

Ⅱ型膠原，制成終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 mg·mL-1的溶液。錫箔紙保存避光，4 ℃環(huán)境下完全溶解過夜（該溶液可在-20 ℃環(huán)境下儲(chǔ)存6周）。使用時(shí)根據(jù)動(dòng)物數(shù)量與完全弗氏佐劑按1∶1比例混合，在0 d時(shí)鼠尾根部皮內(nèi)注射，每只DBA/1小鼠給予0.1 mL

乳劑，21 d后加強(qiáng)免疫（與不完全弗氏佐劑等比混合），建立CIA模型。C57BL/6小鼠需使用雞Ⅱ型膠原。

1.1.3 CIA模型特點(diǎn) 在造模30 d后出現(xiàn)炎癥高峰，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)足爪明顯腫脹，可累及前爪，造模時(shí)間與疾病進(jìn)行性加重呈正相關(guān)。優(yōu)勢(shì)是免疫學(xué)過程和關(guān)節(jié)表現(xiàn)與人類具有較高的一致性[7-8]。

1.2 AA模型

1.2.1 AA模型概述 AA又稱弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎模型，是一種使用廣泛的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，可用于預(yù)測(cè)許多藥物對(duì)RA的臨床療效。致病原理主要是基于抗原模擬機(jī)制，位于結(jié)核桿菌上的某個(gè)蛋白分子在結(jié)構(gòu)上與關(guān)節(jié)滑膜上的某個(gè)糖蛋白分子相似，由此形成的抗體誘發(fā)了針對(duì)關(guān)節(jié)的免疫反應(yīng)。

1.2.2 AA模型造模方法[9] 將熱滅活的結(jié)核分枝桿菌混懸于0.1 mL弗氏完全佐劑，以0.1 mL劑量皮下注射6周齡Lewis大鼠。表現(xiàn)為致炎18 h

后出現(xiàn)足腫脹，通常于造模后2～3周內(nèi)達(dá)炎癥高峰，隨后有自愈傾向，繼發(fā)病變一般出現(xiàn)于

10 d左右，20 d左右達(dá)高峰。雖然所有的大鼠發(fā)病過程相似，但它們的炎癥表現(xiàn)不盡相同，這為探索初期炎癥的嚴(yán)重程度和關(guān)節(jié)功能之間的聯(lián)系提供了機(jī)會(huì)。

1.2.3 AA模型特點(diǎn) 早期炎癥反應(yīng)的部位常出現(xiàn)在造模對(duì)側(cè)和前爪，呈進(jìn)行性加重，活動(dòng)不便，耳和尾部出現(xiàn)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量下降，特別是繼發(fā)性自身免疫性腫脹，這些表現(xiàn)與人RA表現(xiàn)相近，提示AA大鼠與RA患者在關(guān)節(jié)腫脹方面具有相似性[10]。AA具有發(fā)病迅速的特點(diǎn)，病程具有自限性，缺乏慢性改變過程，造模43 d后病理改變基本恢復(fù)正常[11]。

1.3 CAIA模型

1.3.1 CAIA模型概述 早在1998年，人們就在運(yùn)用膠原抗體來誘導(dǎo)RA的CAIA模型。此模型適用于BALB/C小鼠、DBA/1小鼠，而C57BL/6小鼠模型反應(yīng)性低。此模型是研究RA發(fā)病機(jī)制和治療藥物篩選的理想模型。

1.3.2 CAIA模型造模方法[12] 8周齡雄性DBA/1小鼠，在0 d時(shí)腹膜腔注射鼠單克隆Ⅱ型膠原抗體（An Arthrogen-CIA? 5-clone cocktail kit），每只1.5 mg·（0.15 mL）-1，3 d后，腹膜腔注射大

腸桿菌脂多糖，每只50 μg·（0.1 mL）-1。炎癥達(dá)峰期在14 d左右，發(fā)病率為83%左右。

1.3.3 CAIA模型特點(diǎn) 關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分通常在第10天達(dá)高峰，CAIA小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，侵蝕滑膜并破壞軟骨。這與RA關(guān)節(jié)病理存在高度一致性[13]。CAIA模型具有發(fā)病率高、發(fā)病迅速、穩(wěn)定性高和可重復(fù)性好的特點(diǎn)，同時(shí)該模型的建立不需要弗氏佐劑的誘導(dǎo)，亦不受MHC分子的限制，各種品系的小鼠均可誘導(dǎo)發(fā)病，所以該模型的應(yīng)用范圍更廣，更適宜于各種干預(yù)性藥物實(shí)驗(yàn)研究[14]。

1.4 PIA模型

1.4.1 PIA模型概述[15] 降植烷（2，6，10，14-四甲基十五烷）是葉綠素分解后的產(chǎn)物，是一種常用的致炎劑，能促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞瘤的發(fā)生，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生狼瘡特異性抗體，表現(xiàn)出明顯的系統(tǒng)性紅斑狼瘡特征。因此推斷降植烷主要通過體液免疫激發(fā)炎癥反應(yīng)。

1.4.2 PIA模型造模方法[17] 6～8周雌性BALB/C

小鼠，分別于0，9，18周腹膜腔注射0.5 mL降植烷，21周時(shí)實(shí)驗(yàn)小鼠表現(xiàn)出明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀，發(fā)病率為73.7%，炎癥達(dá)峰期8～13 d。

1.4.3 PIA模型特點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)滑膜有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，滑膜增生，有血管翳形成，軟骨和骨組織破壞明顯，與人RA病理表現(xiàn)類似[16]。Holmberg等[17]研究發(fā)現(xiàn)，降植烷是一種非免疫原性佐劑，主要通過免疫系統(tǒng)的非特異性刺激引起自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞活化，而非影響T細(xì)胞或B細(xì)胞特異性識(shí)別。降植烷所致急性關(guān)節(jié)炎癥，在短暫的急性炎癥期后隨即進(jìn)入慢性進(jìn)展和反復(fù)發(fā)作階段，表現(xiàn)為一個(gè)較長(zhǎng)的慢性遷延期。因此，在免疫學(xué)特征方面更類似于RA患者，更適于RA病理機(jī)制的研究。

1.5 SCID模型

1.5.1 SCID模型概述 SCID小鼠由于其免疫缺陷的特點(diǎn)，可用于建立人鼠嵌合模型。近年來研究發(fā)現(xiàn)，植入SCID小鼠背部的RA滑膜能維持其特征12周以上，用于研究發(fā)病機(jī)制，特別是用于研究新藥的療效和機(jī)制，并可作為人源化RA模型。

1.5.2 SCID模型造模方法[18] 該模型用到的是4～8周齡天然免疫及適應(yīng)性免疫均缺乏的SCID-NOD小鼠，無菌條件下麻醉小鼠，在其背部正中做一切口，取一大小約0.1～0.2 cm3的人RA滑膜組織植入其皮下，植入物需避開切口。移植后第3，6或12周又可將移植物取出凍存于冰箱，以備后用。個(gè)別學(xué)者在滑膜植入期間，配合使用熒光染料標(biāo)記的人外周血淋巴細(xì)胞鼠尾靜脈輸注，以提高成模率。實(shí)驗(yàn)證明，在第3周和12周時(shí)RA-SCID小鼠血清中可檢測(cè)到人白細(xì)胞介素-6和免疫球蛋白。這些研究表明，RA-SCID具有滑膜炎的特性，與RA病理一致性高。

1.5.3 SCID模型特點(diǎn)[19] RA-SCID小鼠血清中炎癥腫瘤壞死因子-α水平顯著升高，RA組織滑膜增生、軟骨侵蝕和軟骨降解過程與人RA病理非常類似。由于動(dòng)物模型與人的種屬差異是研究中一個(gè)重要影響因素，RA-SCID小鼠作為人源化滑膜侵蝕模型，在探討RA病理機(jī)制特別是軟骨破壞及治療方面可能有明顯優(yōu)勢(shì)。

1.6 OVA模型

1.6.1 OVA模型概述 卵清蛋白誘導(dǎo)模型首次出現(xiàn)在1962年，其可能的發(fā)病機(jī)制在于以抗原的形式刺激關(guān)節(jié)腔出現(xiàn)抗體，持續(xù)形成抗原-抗體-補(bǔ)體（C3）復(fù)合物，募集大量的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，從而引起局部的炎癥反應(yīng)，刺激滑膜產(chǎn)生血管翳，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[20]。

1.6.2 OVA模型造模方法 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg·mL-1的卵清蛋白乳劑于兔肩胛間區(qū)進(jìn)行皮內(nèi)注射，每次選5個(gè)部位，每周1次，連續(xù)3次，進(jìn)行基礎(chǔ)致敏。28 d后在脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)與髕骨下緣連線之中點(diǎn)的髕韌帶兩側(cè)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 mg·mL-1的雞卵清蛋白乳劑雙膝各注射1 mL加強(qiáng)[21]。

1.6.3 OVA模型評(píng)價(jià) 該模型造模4周后即可出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)腫脹、僵硬，活動(dòng)受限，不能負(fù)重，甚至關(guān)節(jié)變形。且模型廉價(jià)易于復(fù)制，模型成功率可高達(dá)100%，適合較大規(guī)模的飼養(yǎng)與造模，同時(shí)本模型血清學(xué)、病理學(xué)改變均接近人RA[22]。

2 展望與討論

RA動(dòng)物模型復(fù)制是研究RA發(fā)病機(jī)制及藥物治療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。成功的RA動(dòng)物模型應(yīng)在病理學(xué)特征上滿足RA病理特點(diǎn)，同時(shí)需具備操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)的特征，且用于造模的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑需易購買[23]。在上述模型中，CIA與AA模型建立較早，是RA的經(jīng)典模型，已較為成熟，與人類病理過程有一定的相似性。但CIA模型缺乏統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，各種大、小鼠成模率高低不同，且

Ⅱ型膠原注射劑量、注射部位、加強(qiáng)免疫方法不盡相同，這使實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性、可操作性大打折扣。AA模型有自愈傾向，依然不能反映RA作為慢性病的臨床特點(diǎn)[24]，存在發(fā)病程度不均一、成模率低等局限性。雖然CAIA模型、PIA模型和SCID模型在一定程度上解決了經(jīng)典模型的不足之處，具有慢性遷延的病程、成模率高、與人RA病理高度吻合的優(yōu)勢(shì)；但其不足之處表現(xiàn)在CAIA模型所需試劑昂貴、不利于購買；PIA模型造模耗時(shí)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)度緩慢，其復(fù)制能否成功取決于動(dòng)物周齡、雌雄比例、屏障環(huán)境等多個(gè)因素；SCID模型所需的人類滑膜組織不容易獲得、操作復(fù)雜；而OVA模型又存在兔源化抗體稀少，后期研究困難的缺陷。所以，探索一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，與人RA病理特點(diǎn)更符合的動(dòng)物模型仍是今后模型研究的方向。

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收稿日期：2016-07-15；修回日期：2016-10-19