鐵死亡在哮喘氣道炎癥中的作用及針刺干預(yù)研究進(jìn)展

湯蔚峰，滕方舟，宗雨婷，宋京蓉，秦靜靜，董競(jìng)成,2，魏穎,2

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200040；2. 復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海200040

支氣管哮喘（哮喘）是一種常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一。根據(jù)2015年全球疾病負(fù)擔(dān)研究結(jié)果顯示，全球哮喘患者高達(dá)3.58 億[1]，成人哮喘患病率約為10%[2]，隨著城市化、工業(yè)化等現(xiàn)代文明的發(fā)展，近年來(lái)哮喘平均患病率呈上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2025年可達(dá)4 億。兒童和青年人具有較高的哮喘發(fā)病率，是哮喘發(fā)病的主要人群，而老年人哮喘的發(fā)病率與青年人相似，且致死率更高，這可能與老年人存在基礎(chǔ)疾病有關(guān)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療哮喘能較好改善患者的哮喘癥狀，但在個(gè)體和人群中，哮喘治療反應(yīng)存在很大差異，部分患者的治療反應(yīng)較差[4]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)哮喘的認(rèn)識(shí)是以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)的，在治療哮喘方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)[5]，針灸在防治哮喘方面有很好的療效[6]，其具有簡(jiǎn)便、安全有效、無(wú)不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，在中醫(yī)臨床上有廣泛的應(yīng)用。鐵死亡（ferroptosis）是新近發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的非凋亡形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，其特征是脂質(zhì)過(guò)氧化物鐵依賴(lài)性地積累，引發(fā)質(zhì)膜破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其在形態(tài)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)上均不同于凋亡、壞死和自噬[7-10]。目前關(guān)于哮喘中鐵死亡的研究較少，本課題組發(fā)現(xiàn)在塵螨誘導(dǎo)的哮喘模型中，肺組織中發(fā)生了鐵死亡[11]；Wu 等[12]發(fā)現(xiàn)鐵死亡誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，進(jìn)而改善哮喘癥狀；而B(niǎo)ibi 等[13]用鐵死亡誘導(dǎo)劑滴鼻，發(fā)現(xiàn)可以改善小鼠的哮喘癥狀。關(guān)于哮喘鐵死亡的機(jī)制尚不清楚，但鐵死亡的發(fā)現(xiàn)為哮喘發(fā)病機(jī)制研究提供了新的方向，也為針刺治療哮喘的作用機(jī)制研究提供了新的思路。本文重點(diǎn)對(duì)氣道炎癥在哮喘中的作用、鐵死亡的概念和調(diào)控、鐵死亡在哮喘氣道炎癥中的作用以及針灸對(duì)哮喘炎癥中細(xì)胞鐵死亡的調(diào)控作用進(jìn)行梳理和介紹，以期為哮喘發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路和方向。

1 氣道炎癥是哮喘病理改變的核心環(huán)節(jié)

哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽等癥狀，同時(shí)伴有氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR）和可變的氣流受限等氣道功能障礙[14]。氣道炎癥是哮喘病理改變的核心環(huán)節(jié)，是哮喘病理過(guò)程的基本病理改變和反復(fù)發(fā)作的主要病理機(jī)制之一。氣道的炎癥反應(yīng)是以氣道上皮細(xì)胞為代表的結(jié)構(gòu)細(xì)胞與T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞相互作用的結(jié)果，這些細(xì)胞分泌多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，并相互作用，構(gòu)成復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與哮喘的氣道炎癥反應(yīng)[15]。因此，控制哮喘氣道炎癥是治療哮喘的關(guān)鍵。

氣道上皮細(xì)胞在哮喘氣道炎癥中起主導(dǎo)作用。氣道上皮細(xì)胞是呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是保護(hù)人體免于病原體侵犯的第一道屏障，在哮喘氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[16]。氣道上皮細(xì)胞不僅具有屏障防御功能，還能在應(yīng)激狀態(tài)下分泌炎性介質(zhì)并和炎性細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞相互作用，從而發(fā)揮免疫功能。氣道上皮細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子激活免疫細(xì)胞和招募炎性細(xì)胞。其中，最重要的是胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白介素-25（interleukin25，IL-25）、IL-33、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF）和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）[17-20]。TSLP 和IL-25 可以激活樹(shù)突狀細(xì)胞，啟動(dòng)Th2 型細(xì)胞應(yīng)答[17]。IL-33 能與巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的ST2 受體結(jié)合，促進(jìn)這些細(xì)胞釋放大量的趨化因子和Th2 型細(xì)胞因子[18]。GM-CSF 可刺激造血干細(xì)胞向粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分化，支持EOS 存活[19]。Eotaxin 可以將Th2 細(xì)胞、EOS、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞招募到炎性反應(yīng)部位發(fā)揮效應(yīng)，進(jìn)一步惡化哮喘炎癥[20]。

2 鐵死亡及其在哮喘中的作用

2.1 鐵死亡的概念和發(fā)生機(jī)制 鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的非凋亡形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，其特征是脂質(zhì)過(guò)氧化物鐵依賴(lài)性地積累至致死水平，在形態(tài)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)上均不同于凋亡、壞死和自噬[7-10]。鐵死亡在電鏡下主要表現(xiàn)為線粒體外膜破壞、線粒體脊消失和膜密度增高，沒(méi)有細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)的染色體濃縮、細(xì)胞壞死時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞器腫脹以及細(xì)胞自噬時(shí)出現(xiàn)的雙層膜囊泡形成[7-10]。2012年Dixon 等[21]在Cell 發(fā)表文章，正式將這種細(xì)胞死亡方式定義為“鐵死亡”。鐵死亡的最終執(zhí)行者是脂質(zhì)過(guò)氧化物，當(dāng)過(guò)量的脂質(zhì)過(guò)氧化物累積會(huì)引起質(zhì)膜損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡[22]。因此，脂質(zhì)過(guò)氧化/抗氧化失衡是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵。

2.2 ACSL4-LPCAT3-15LO 通路促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞鐵死亡 ?；o酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）-溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholineacyltransferase3，LPCAT3）-15酯氧合酶（15-Lipoxygenases，15-LO）通路（ACSL4-LPCAT3-15LO 通路）是介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化和正向調(diào)控鐵死亡的重要通路，其表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)磷脂過(guò)氧化物的積累，導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡[23]。ACSL4 是鐵死亡通路上的一個(gè)關(guān)鍵基因，參與細(xì)胞膜中游離多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）-磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）的生物合成和重塑，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[24-25]。敲除胚胎成纖維細(xì)胞中的ACSL4，細(xì)胞對(duì)鐵死亡抗性增加[25]，敲除膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的ACSL4，膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡被抑制[24]。LPCAT3 是脂質(zhì)合成途徑中的重要一環(huán)，其高表達(dá)會(huì)上調(diào)質(zhì)膜中不飽和脂肪酸含量，提高細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，敲低LPCAT3 表達(dá)能夠降低細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性[26]。15-LO是催化不飽和脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶之一，其主要有15-LO1和15-LO2 2 種亞型，目前15-LO1 被證實(shí)在肺組織中有表達(dá)分布更廣泛[27]。在脂質(zhì)合成過(guò)程中，上游限速酶ACSL4將乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）與花生四烯酸（arachidonic acid，AA）結(jié)合，形成長(zhǎng)鏈多不飽和脂酰CoA（AA-CoA）。隨后在LPCAT3 作用下，AA-CoA 與PE 反應(yīng)，形成PEAA，進(jìn)入脂質(zhì)氧化途徑。PE-AA 在15-LO 作用下，形成磷脂過(guò)氧化物。磷脂過(guò)氧化物的積累一方面會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)輔酶Q10 (Coenzyme Q10，CoQ10) 和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，另一方面會(huì)提高細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。以上研究提示ACSL4-15LO 是形成磷脂過(guò)氧化物、促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和正向調(diào)控鐵死亡的重要通路。見(jiàn)圖1。

2.3 SLC7A11-GSH-GPX4 通路抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞鐵死亡 胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)輕鏈亞基SLC7A11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）-GSH-谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）通路（SLC7A11-GSH-GPX4）通路，介導(dǎo)了抗氧化反應(yīng)，具有拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抑制鐵死亡的關(guān)鍵作用[28-31]。胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（cystine/glutamate transporter, System Xc-）、GSH 和GPX4 在脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中起抗氧化作用。System Xc-從細(xì)胞外攝取胱氨酸，并將細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，攝入細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸被還原為半胱氨酸，參與GSH 合成和下游脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，System Xc-的活性與催化亞基SLC7A11的表達(dá)呈正相關(guān)[28]。抑制System Xc-導(dǎo)致的氨基酸代謝失衡會(huì)引發(fā)鐵死亡[28，32]。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，抑制System Xc-減少胱氨酸攝取能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[33]。System Xc-在鐵死亡中起著非常重要的作用，而SLC7A11 是調(diào)控“鐵超載介導(dǎo)鐵死亡”的關(guān)鍵蛋白之一。GSH 作為GPX4 的底物參與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，是影響鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵因素[29]。GSH 缺失可導(dǎo)致GPX4 失活和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物增加，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡[30]。GPX4 是一類(lèi)含有硒代半胱氨酸的還原酶，通過(guò)消耗GSH 將脂肪酸、磷脂和膽固醇等復(fù)合脂質(zhì)中的過(guò)氧化物還原為穩(wěn)定的羥基脂質(zhì)，從而抑制細(xì)胞膜的鏈?zhǔn)窖趸痆31]。GPX4 占據(jù)了鐵死亡的核心位置，是清除過(guò)氧化脂質(zhì)的重要途徑，其表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化脂質(zhì)的還原具有重要影響。在細(xì)胞中胱氨酸/半胱氨酸供應(yīng)充足的情況下，抑制GPX4 能夠引起PUFA 氧化和脂肪酸自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致鐵死亡[34]。在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GPX4 能增加鐵死亡抗性，敲低GPX4 能夠促進(jìn)鐵死亡[35]。香煙煙霧誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病小鼠發(fā)生鐵死亡，GPX4+/小鼠表現(xiàn)出更明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化水平和氣道上皮細(xì)胞鐵死亡[36]。可見(jiàn)，SLC7A11-GSH-GPX4 通路具有拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抑制鐵死亡的作用。綜上所述，ACSL4-LPCAT3-15LO 與SLC7A11-GSH-GPX4 通路，分別介導(dǎo)了脂質(zhì)的過(guò)氧化與抗氧化反應(yīng)，兩者的相互制約維持著脂質(zhì)氧化的平衡，并共同參與對(duì)鐵死亡的調(diào)控過(guò)程（圖1）。

2.4 氣道上皮細(xì)胞鐵死亡促進(jìn)哮喘炎癥反應(yīng) 15-LO 通常以游離PUFA 為底物，催化磷脂過(guò)氧化物產(chǎn)生，在IL-4/IL-13驅(qū)動(dòng)的Ⅱ型炎癥反應(yīng)中，15-LO 能與磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1（phosphatidylethanolamine-binding protein 1，PEBP1）結(jié)合，促進(jìn)哮喘患者氣道上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[27]。穩(wěn)定期和重癥哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞中，均可以檢測(cè)到15-LO表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)，15-LO1 能夠調(diào)控IL-13 誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞粘蛋白表達(dá)[38]，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。GPX4 能夠分解15-LO催化游離PUFA 產(chǎn)生的氧化PE，減少磷脂過(guò)氧化物堆積，抑制鐵死亡發(fā)生[27]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 通過(guò)誘導(dǎo)活性氧依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞鐵死亡[39]。以上研究提示，氣道上皮細(xì)胞的鐵死亡參與哮喘的炎癥反應(yīng)，其在哮喘病理進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

3 針刺對(duì)哮喘炎癥中細(xì)胞鐵死亡的調(diào)控

哮喘屬于中醫(yī)的哮病范疇，祖國(guó)醫(yī)學(xué)早在內(nèi)經(jīng)中就有“喘鳴”的記載，如《素問(wèn). 陰陽(yáng)別論篇》中提到“起則熏肺，使人喘鳴”。明代張景岳《景岳全書(shū). 喘促》說(shuō)“喘有夙根，遇寒即發(fā)、或遇勞即發(fā)者，亦名哮喘”。哮病反復(fù)發(fā)作，難以治愈，乃是由于“內(nèi)有壅塞之氣，外有非時(shí)之感，膈有膠固之痰，三者相合，閉拒氣道，搏擊有聲，發(fā)為哮病”。臨床和系列實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了針刺治療哮喘的有效性[40-43]。臨床研究結(jié)果表明，針刺治療對(duì)于提高哮喘的控制水平，改善患者生活質(zhì)量具有重要作用。系列實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示針灸治療哮喘的作用主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)免疫和抑制炎癥方面。鐵死亡在哮喘炎癥中的作用以及針刺對(duì)哮喘鐵死亡的調(diào)控作用的相關(guān)研究尚處于起步階段。本課題組運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)研究了針刺治療哮喘的相關(guān)作用機(jī)理[44]，結(jié)果顯示，哮喘的病理過(guò)程與鐵死亡密切相關(guān)，針刺治療哮喘能夠調(diào)控鐵死亡的相關(guān)環(huán)節(jié)，有效延緩哮喘氣道炎癥和病情進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，除了典型的氣道炎癥相關(guān)變化外，還發(fā)生了鐵死亡相關(guān)改變，表現(xiàn)為丙二醛（malonaldehyde,MDA）明顯升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和GSH 明顯降低。給予針刺治療后，氣道炎癥明顯緩解，MDA 表達(dá)明顯下調(diào)，SOD 和GSH 明顯上調(diào)。此外，針刺治療哮喘還能夠調(diào)控鐵死亡通路中SLC3A2 和谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase, GCL) 表達(dá)，因此認(rèn)為針刺治療哮喘的效應(yīng)與調(diào)控鐵死亡相關(guān)。但是，針刺治療哮喘究竟如何調(diào)控鐵死亡，還需要進(jìn)一步深入的研究。

4 展望

哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，針灸治療哮喘具有良好的療效，但是針灸抗哮喘效應(yīng)的具體作用機(jī)理尚未完全闡明，限制了針刺療法在哮喘臨床治療中的廣泛應(yīng)用。鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡方式，其在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注。同時(shí)，針刺通過(guò)調(diào)控鐵死亡信號(hào)發(fā)揮抗哮喘作用也被初步證實(shí)，這為闡明針刺治療哮喘的療效機(jī)理提供了新的思路。然而，目前相關(guān)研究仍處于起步階段，針刺調(diào)控哮喘發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)的鐵死亡事件具體涉及哪些細(xì)胞，以及與哮喘病理變化存在何種關(guān)系，仍是需要深入研究的方向。另外，針刺調(diào)控了哪些細(xì)胞的鐵死亡而發(fā)揮抗哮喘療效，也是值得關(guān)注的重點(diǎn)。

注：Glutamate：谷氨酸；Cystine：胱氨酸；Cysteine：半胱氨酸；ACSL4：酰基輔酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4）；LPCAT3：溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3）；15-LO1： 15 酯氧合酶1（15-Lipoxygenases-1）；GSH：谷胱甘肽（glutathione）; GPX4：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4）；Lipid Peroxides：脂質(zhì)過(guò)氧化；Ferroptosis：鐵死亡；CoA：乙酰輔酶A（coenzyme A）；AA：花生四烯酸（arachidonic acid）；PE：磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine）