ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素協(xié)同抑菌效應的研究

魏奇 鐘鑫榮 龔鎂青 張承康 張維瑞 陳美霞 劉盛榮

摘 要：ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素屬于天然的食品防腐劑。該研究以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，探究ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素及其復配溶液的抑菌作用。結果表明：ε-聚賴氨酸（45μg/mL）和乳酸鏈球菌素（312.5μg/mL）復配溶液對大腸桿菌的抑制作用最佳;ε-聚賴氨酸（5μg/mL）和乳酸鏈球菌素（250μg/mL）復配溶液對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。Checkerboard分析法表明，乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸抑菌作用具有疊加效應。研究結果可以為ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素在食品防腐中的應用提供理論依據(jù)。

關鍵詞：ε-聚賴氨酸;乳酸鏈球菌素;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌;抑菌作用

中圖分類號 TS201.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）21-00038-05

Abstract： ε-polylysine and nisin were the natural food preservatives. In this study， Escherichia coli and Staphylococcus aureus were used to evaluate the antibacterial activities of ε-polylysine and nisin. Results showed that the combination of nisin （312.5μg/mL） and ε-polylysine （45μg/mL） could inhibit the growth of Escherichia coli. The combination of nisin （250μg/mL） and ε-polylysine （5μg/mL） could inhibit the growth of Staphylococcus aureus. The Checkerboard method showed that the combination of nisin and ε-polylysine had stronger antibacterial activities than nisin or ε-polylysine. This study could provide beneficial effects on the production of food preservatives.

Key words： ε-polylysine; Nisin; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; Antibacterial activity

食品在生產、貯存過程中會出現(xiàn)腐敗變質的現(xiàn)象。為了防止食品腐敗，食品工業(yè)生產上主要是采用防腐效果好的化學防腐劑如苯甲酸、山梨酸等抑制食品中微生物的生長。雖然這些常用的化學防腐劑已經按照國家要求控制在一定的范圍內，但仍無法避免化學防腐劑殘留物對人體產生的潛在毒副作用，甚至致畸致癌等風險[1]。天然食品防腐劑對人體安全無害且具有抑菌和延長食品保質期的作用。因此，天然無毒副作用的食品防腐劑越來越引起廣大消費者的青睞[2-4]。

ε-聚賴氨酸是由許多的賴氨酸組成的天然防腐抑菌劑。聚賴氨酸具有廣譜抗菌的作用，能夠被生物降解，具有巨大的商業(yè)潛力[5]。ε-聚賴氨酸在人體中能夠直接降解成賴氨酸，對人體無毒無害，是一種天然的生物防腐劑[6，7]。研究表明，ε-聚賴氨酸能夠使菌體細胞膜的結構發(fā)生變化，破壞細菌的正常生理代謝系統(tǒng)，從而起到殺死細菌的作用[8]。ε-聚賴氨酸能夠作用于酶或者功能蛋白，影響蛋白質的合成和正常生理代謝，最終破壞細胞的功能，導致細胞死亡[9]。乳酸鏈球菌素是由乳酸乳球菌和乳鏈球菌所產生的多肽物質，是一種對健康無害的天然食品防腐劑。乳酸鏈球菌素對大多數(shù)的革蘭氏陽性細菌生長和繁殖（金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等）具有抑制作用，尤其對產生孢子的革蘭氏陽性細菌的抑制效果顯著。乳酸鏈球菌素進入機體內后，能夠被水解，不會引起機體腸道菌群的紊亂，也不會產生抗藥性，對食品的色、香、味、口感等無不良影響[10-14]。因此，乳酸鏈球菌素是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑，可應用于乳制品、罐頭、肉制品和飲料等食品行業(yè)。乳酸鏈球菌素的抑菌作用主要使細菌的細胞膜產生孔洞，抑制革蘭氏陽性菌細菌細胞壁合成，細胞膜的通透性發(fā)生改變，細胞外的水分子流入細胞內部，細胞內部的小分子物質流出，最終導致細菌死亡[15-18]。目前，乳酸鏈球菌素已廣泛應用于乳制品和肉制品等方面，達到抑制芽孢桿菌孢子生長，防止食品腐敗，延長食品保質期，減少化學防腐劑使用量的效果。因此，乳酸鏈球菌素作為天然高效的保鮮劑，可以保證食品質量并且延長食品的貯藏期。

復合保鮮方法是利用不同保鮮技術的協(xié)同效果，降低防腐劑添加劑量的使用量，具有良好的應用前景。天然食品防腐劑的復配應用，有助于提高防腐劑的保鮮效果，增加抑菌譜，減少用量而降低成本[19]。本試驗以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法和微量稀釋法來測定乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸及其復配溶液的最低抑菌濃度，應用Checkerboard分析法，探究乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸協(xié)同效應，旨在了解ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素及其復配溶液的抑菌作用，為ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素在食品工業(yè)上的科學復配應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli），均為寧德師范學院微生物室提供。

1.1.2 試劑 ε-聚賴氨酸，乳酸鏈球菌素，食品級，浙江新銀象生物工程有限公司;營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備 DHP-9272A DHP-9272A，上海飛越實驗儀器有限公司;SW-CJ-2D凈化工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司;YXQ-SG46-280S全自動高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司;DHG-9070A鼓風干燥箱，上海飛越實驗儀器有限公司;THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學儀器有限公司;YP802N電子天平，上海精密科學儀器有限公司;YC-300L數(shù)控低溫保存箱，中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶劑配制 2mg/mL ε-聚賴氨酸溶液制備：取0.2g ε-聚賴氨酸，用去離子水溶解，定容至100mL。2mg/mL乳酸鏈球菌素溶液制備：取0.2g乳酸鏈球菌素，用冰醋酸（2%）水溶液溶解，定容至100mL。

1.3.2 培養(yǎng)基配制 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制：稱取營養(yǎng)瓊脂干粉（33g）加入1L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15min）。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：稱取營養(yǎng)肉湯干粉（18g）加入1L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15min）。

1.3.3 菌液制備 在超凈工作臺中，分別取上述少量活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，接種至30mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于恒溫搖床中培養(yǎng)24h（150r/min，35℃）。

1.3.4 菌種活化 在試驗的前1d，用無菌接菌環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的大腸桿菌（金黃色葡萄球菌），裝于含10mL營養(yǎng)肉湯的無菌離心管中，置于37℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)20h，使大腸桿菌（金黃色葡萄球菌）恢復生長。

1.3.5 瓊脂擴散法 將活化后的菌懸液離心（2500r/min，15min），傾去廢液，加入10mL無菌生理鹽水混勻，再離心10min，用5mL無菌生理鹽水溶解沉淀。將菌懸液在裝有無菌生理鹽水的試管中連續(xù)梯度稀釋，104 CFU/mL的菌懸液備用。吸取1mL制備好的菌懸液于無菌的培養(yǎng)皿中，將瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)基20mL，搖勻，凝固后用7mm打孔器打6個孔。分別加入乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸溶液和復配溶液，以無菌水為空白對照。在37℃的生化培養(yǎng)箱20h后觀察，并記錄抑菌圈大小。

1.3.6 最小抑菌濃度的測定 96孔板中加入100μL ε-聚賴氨酸溶液（或乳酸鏈球菌素溶液）和100μL菌濃度為106 CFU/mL的大腸桿菌（或金黃色葡萄球菌）。24h后測定最小抑菌濃度。表1為ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素溶液的濃度。

1.3.7 Checkerboard測試 乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液的濃度如表2所示。

1.3.8 Checkerboard法計算FICI值 采用Checkerboard法獲得FICI值，從而評估乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸相互抑菌作用[20，21]。FICI計算公式如下：

FICI=乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液MIC/乳酸鏈球菌素MIC+乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液MIC/ε-聚賴氨酸MIC。

協(xié)同作用（0.5≤FICI）;疊加作用（0.52）。

2 結果與分析

2.1 乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸的抑菌活性 乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑測量結果如表3所示。由表3可知，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑隨著乳酸鏈球菌菌素濃度的增加而增加，而乳酸鏈球菌素對大腸桿菌無明顯的抑制作用。ε-聚賴氨酸大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著濃度的增加而增加，ε-聚賴氨酸濃度越高抑菌效果越好。

乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑測量結果如表4所示。由表4可知，ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素復配溶液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑大于相同濃度下單獨使用ε-聚賴氨酸或乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑。由此可知，ε-聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素的復配溶液可以增強抑菌效果，復配溶液可以發(fā)揮各自的優(yōu)點，并且彌補乳酸鏈球菌素無法抑制革蘭氏陰性菌的弱點，從而擴展復配溶液的抑菌譜、增強其抑菌作用。

2.2 ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素的最小抑菌濃度 由表5可知，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為25μg/mL;ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為50μg/mL。乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為250μg/mL;乳酸鏈球菌素對大腸桿菌沒有呈現(xiàn)出抑制作用。由此可知，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度小于乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度。

2.3 乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌的影響 采用Checkerboard方法評價乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸的復配溶液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌效果，并根據(jù)FICI指數(shù)探究乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸之間的相互作用的類型。由表6可知，當ε-聚賴氨酸濃度相同時，乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加而增強。當時間為24、48和72h時，ε-聚賴氨酸（5μg/mL）和乳酸鏈球菌素（250μg/mL）復配溶液可以有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，F(xiàn)ICI指數(shù)為1.2（0.005/0.025+0.25/0.25=1.2，1

2.4 乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌的影響 由表7可知，當時間為24h，30μg/mL的ε-聚賴氨酸和250μg/mL的乳酸鏈球菌素復配溶液能夠抑制大腸桿菌的生長，F(xiàn)ICI值為0.6，提示乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌均具有疊加抑菌的作用（0.5

3 討論

乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸是天然食品防腐抑菌劑，具有較好的抑菌和延長食品貯藏期的作用。ε-聚賴氨酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑菌活性其抑菌譜較廣。乳酸鏈球菌素抑菌譜較窄，對大腸桿菌無明顯的抑制作用。兩者的復配溶液，對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，且增強了對大腸桿菌的抑菌效果[22-24]。因此，開發(fā)乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸復合保鮮劑對于提高食品品質和延長食品貯藏期具有十分重要的意義。

利用瓊脂擴散法研究ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素單獨和復配使用的抑菌效果，研究結果表明，添加的抑菌劑濃度越高，其抑菌效果越好;ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素復配溶液的抑菌效果優(yōu)于單獨使用這2種抑菌劑。ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為25μg/mL;ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為50μg/mL。乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為250μg/mL;乳酸鏈球菌素對大腸桿菌未呈現(xiàn)出抑制作用。ε-聚賴氨酸和乳酸鏈球菌素復配溶液對大腸桿菌具有協(xié)同抑菌的作用，該研究結果與劉梅等[25]的研究結果相一致。通過研究乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸的復配溶液的抑菌效果，不僅減少了防腐劑使用量，而且拓寬了乳酸鏈球菌素的抑菌譜，研究結果為二者在天然食品防腐劑中的配合應用提供了理論參考。

參考文獻

[1]董欣旖，趙英俠.食品防腐劑在食品中應用現(xiàn)狀分析[J].中國食品添加劑，2020，31（11）：139-143.

[2]PANDEY A K，GONZALEA M L C，SILVA A S，et al. Essential oils from the genus Thymus as antimicrobial food preservatives：Progress in their use as nanoemulsions-a new paradigm[J]. Trends in Food Science and Technology，2021，111：426-441.

[3]呂永平，賈敬敏，董井云.防腐劑對符離集燒雞保鮮效果的研究[J].安徽農學通報，2019，25（1）：78-79.

[4]呂奎營，趙秋香，趙媛媛，等.天然食品防腐劑及其在食品中的應用研究[J].中國調味品，2020，45（4）：86-188.

[5]CHANG Y H，MCLANDSBOROUGH L，MCLEMENTSc D J. Interaction of cationic antimicrobial （?-polylysine） with food-grade biopolymers：Dextran，chitosan，carrageenan，alginate，and pectin[J]. Food Research International，2014，64：396-401.

[6]楊萍萍，郭思琪，侯溫甫，等.ε-聚賴氨酸/聚乙烯醇復合膜的抑菌活性及其對生鮮鴨肉的保鮮作用[J].現(xiàn)代食品科技，2020，35（3）：113-119.

[7]BHATTACHARYA S，DINESHKUMAR R，DHANARAJAN G et al. Improvement of ε-polylysine production by marine bacterium Bacillus licheniformis using artificial neural network modeling and particle swarm optimization technique[J]. Biochemical Engineering Journal，2017，126：8-15.

[8]齊子琦，秦子晉，黃永震，等.生物防腐劑ε-聚賴氨酸的研究進展[J].食品工業(yè)，2019，40（10）：296-300.

[9]柳芬芳，李迎秋.ε-聚賴氨酸抗菌特性及應用研究進展[J].中國調味品，2021，46（4）：183-186.

[10]劉錦紅.天然食品防腐劑乳酸鏈球菌素在乳制品中的應用研究[J].輕工科技，2021，37（7）：8-9.

[12]NYHAN L，DES F，HILL C，et al. Investigation of combinations of rationally selected bioengineered nisin derivatives for their ability to inhibit Listeria in broth and model food systems[J]. Food microbiology，2021，99：103835.

[13]羅林根，朱明揚，黃謙，等.乳酸鏈球菌素及其在食品中的應用研究進展[J].浙江農業(yè)科學，2020，61（5）：1003-1005.

[14]REINERS J，LAGEDROSTE M，GOTTSTEIN J，et al. Insights in the antimicrobial potential of the natural nisin variant nisin H[J]. Frontiers in microbiology，2020，11：1-12.

[15]YANG Y，LIU H D，WU M，et al. Bio-based antimicrobial packaging from sugarcane bagasse nanocellulose/nisin hybrid films[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2020，161（15）：627-635

[16]El-KAZZAZ S S，El-KHIER N T A. Effect of the lantibiotic nisin on inhibitory and bactericidal activities of antibiotics used against vancomycin-resistant enterococci[J]. Journal of Global Antimicrobial Resistance，2020，22：263-269.

[17]付咪，俞佳麗，郭亮，等.乳酸鏈球菌素脂質體在不同pH值條件下的穩(wěn)定性及其抑菌效果[J].食品科學，2019，40（21）：7-13.

[18]王佳宇，胡文忠，管玉格，等.乳酸鏈球菌素抑菌機理及在食品保鮮中的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2021，42（3）：346-350.

[19]YOON J H，JEONG D Y，LEE S B，et al. Control of Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157：H7 in enoki mushrooms （Flammulina velutipes） by combined treatments with organic acids，nisin，and ultrasound[J]. Food Control，2021，129，103835.

[20]FRATINI F，MANCINI S，TURCHI B，et al. A novel interpretation of the fractional inhibitory concentration index：The case Origanum vulgare L. and Leptospermum scoparium J. R. et G. Forst essential oils against Staphylococcus aureus strains[J]. Microbiological Research，2017，195：11-17.

[21]HODA S，GUPTA L，AGARWAL H，et al. Inhibition of Aspergillus fumigatus biofilm and cytotoxicity study of natural compound Cis-9-hexadecenal，Journal of Pure Applied Microbiology，2019，13（2）：1207-1216.

[22]邱天.迷迭香酸、Nisin、聚賴氨酸聯(lián)合抑菌效果及其涂膜保鮮效果的研究[J].現(xiàn)代食品，2020，21：77-81.

[23]郭全友，劉玲，李保國，等.Nisin、ε-聚賴氨酸、pH值對蝦源枯草芽孢桿菌生長/非生長界面模型構建與評價[J].食品科學，2020，41（22）：140-147.

[24]周俊英，郭清蓮，樂英棒，等.ε-多聚賴氨酸與乳鏈菌肽對抑制金黃色葡萄球菌生物膜生長的研究[J].臨床血液學雜志，2018，31（6）：439-442.

[25]劉梅.Nisin與ε-聚賴氨酸協(xié)同對腐敗菌的抑制效果及在雞胸肉中的應用[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學，2016：16-17.

（責編：張宏民）