Th22細(xì)胞及血清IL-22水平與狼瘡性腎炎患者疾病活動(dòng)度評(píng)分的相關(guān)性*

杜宇，趙佰橋，張誼雯，張娜，曹微

（連云港市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇連云港 222000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）最常見(jiàn)的受累器官為腎臟，最常見(jiàn)的并發(fā)癥為狼瘡性腎炎（lupus nephritis, LN）[1]。輔助性T 細(xì)胞22（helper T cell 22, Th22）是一種獨(dú)立的淋巴細(xì)胞亞群，可分泌功能性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素22（Interleukin-22, IL-22），當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥感染時(shí)，可促進(jìn)傷口愈合，維持機(jī)體屏障的穩(wěn)定性[2]。LN 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因診斷LN 的金標(biāo)準(zhǔn)為腎活檢，為有創(chuàng)性檢查，故臨床上探索LN 相關(guān)指標(biāo)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度評(píng)分（systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI）的相關(guān)性以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

有研究表明，Th22 及其功能細(xì)胞因子IL-22 在皮膚疾病[3-4]（包括皮炎、銀屑病）、感染類(lèi)疾病[5-6]、腸道炎癥類(lèi)疾?。ò冃越Y(jié)腸炎、Crohn 病等）[7-8]患者中均有表達(dá)。隨著相關(guān)研究的深入，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Th22、IL-22 也影響SLE 和LN 的發(fā)生、發(fā)展，但結(jié)論尚不統(tǒng)一[9-10]。鑒于此，本研究探討LN 患者外周血Th22 細(xì)胞及血清IL-22 水平，及其與SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)性，以期為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月—2020年6月連云港市第一人民醫(yī)院收治的SLE 患者40 例。其中，男性12 例，女性28 例；年齡18～50 周歲。本研究參照2009年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者的病情采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)性評(píng)分（systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI）進(jìn)行測(cè)評(píng)。其中腎活檢發(fā)現(xiàn)切片有＞8 個(gè)腎小球的患者納入LN 組，共20 例，剩余20 例納入SLE 組。另取同期本院健康體檢者10 例為HC 組。其中，女性7 例，男性3 例；年齡20～47 歲。HC 組血常規(guī)、生物化學(xué)檢查、凝血功能均正?；虍惓５珶o(wú)臨床意義，自身抗體均陰性，無(wú)臟器相關(guān)的急性或慢性疾病，無(wú)自身免疫類(lèi)疾病等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器

人IL-22 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）kit、鼠抗人IL-22-PE、鼠抗人CD4-PerCP 購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司，鼠抗人IL-17-Alexa Fluor、鼠抗人γ 干擾素（Interferon-γ,IFN-γ）/異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、淋巴細(xì)胞分離液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)BD公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，低溫高速離心機(jī)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、微型離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heraeus 公司，細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corming Incorporated 公司。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群Th1 和Th22水平。 Th22 的熒光標(biāo)記為IFN- γ -IL-17-IL-22+CD4+。通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)各組血清IL-22水平。

所有研究對(duì)象禁食＞8 h 后第2 天采集外周血2 ml，置于含新鮮肝素鈉抗凝的真空采血管中，3 500 r/min 離心10 min，棄上清。根據(jù)細(xì)胞數(shù)加入對(duì)應(yīng)的固定劑，置于室溫條件下避光孵育，15 min后離心取血清，吸取上層的淋巴細(xì)胞分離液4 ml 置于離心管中，3 500 r/min 離心20 min，可見(jiàn)4 層分離層，用毛細(xì)吸管抽取中間的灰白色層（即淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的聚集層），置于恒溫箱中孵育4 h。將收集的細(xì)胞加入有熒光標(biāo)記的10 μl 抗體CD4 中，輕微震蕩混合后，避光孵育15 min，反應(yīng)體積為100 μl，舍棄上清液后向試管中加入100 μl 破膜試劑和各種抗體1 μl（包括鼠抗人IL-22-PE、鼠抗人IL-17-Alexa Fluor、鼠抗人IFN-γ/FITC），1 d 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 血清IL-22水平檢測(cè)

按照1∶20 比例稀釋血清，分別將100 μl 稀釋后的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加入微孔板中，20℃條件下孵育25 min，丟棄液體，PBS 清洗5 次，每孔加入反應(yīng)底物100 μl，避光條件下室溫孵育20 min，每孔加入終止液50 μl，輕微震蕩混勻后，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 mm 波長(zhǎng)處的OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制出對(duì)應(yīng)的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較

HC 組、LN 組、SLE 組性別構(gòu)成、年齡比較，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LN 組與SLE 組的SLEDAI 評(píng)分、抗Sm 抗體（-）、抗雙鏈脫氧核糖核酸（double-stranded DNA, dsDNA）抗體（-）、抗核抗體（antinuclear antibody,ANA）（-）比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3 組C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、C3、C4、免疫球蛋白比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：LN 組和SLE 組CRP、ESR、免疫球蛋白高于HC 組（P＜0.05），C3 和C4 低于HC 組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料比較 （±s）

表1 3組一般資料比較 （±s）

組別n年齡/（歲，images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）抗Sm抗體（-）/男/女/例3/7 7/13 5/15 0.476 0.788抗dsDNA抗體（-）/ANA（-）/SLEDAI評(píng)分（images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）HC組LN組SLE組F/t/χ2 值P 值10 20 20 33.22±13.54 37.23±10.25 35.23±11.31 0.435 0.650-33±11.26 29±5.34 1.435 0.163例-1 5例-3 5例-1 6 12 0.597 0.633 53 0.621 0.589 17 0.372 0.735組別HC組LN組SLE組F/t/χ2 值P 值CRP/（mg/L，images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）ESR/（mm/h，images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）C3/（u/ml，images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）C4/（u/ml，images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）免疫球蛋白/（×109/L，images/BZ_12_572_2583_593_2633.png±s）7.1±3.2 48.32±30.23 45.82±25.46 10.138 0.000 2.1±1.0 63±30 54±26 20.601 0.000 0.82±0.35 0.26±0.12 0.35±0.17 26.889 0.000 0.32±0.12 0.09±0.03 0.08±0.03 63.527 0.000 4.34±2.14 8.35±4.12 7.34±3.44 4.331 0.019

2.2 3組Th1、Th22及IL-22水平的變化

HC 組、LN 組、SLE 組Th1 比較，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3 組Th22、IL-22 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：LN 組和SLE 組Th22、IL-22 水平高于HC 組（P＜0.05），但LN 組與SLE 組Th22、IL-22 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組Th1、Th22和IL-22水平比較 （±s）

表2 3組Th1、Th22和IL-22水平比較 （±s）

組別HC組LN組SLE組F 值P 值Th1/%10.12±0.45 10.09±0.42 10.07±0.26 0.071 0.932 Th22/%2.68±0.24 6.92±0.45 6.86±0.35 489.004 0.000 IL-22/（pg/ml）40.23±2.93 59.91±2.93 58.51±2.45 192.384 0.000

2.3 LN患者外周血Th22與IL-22的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LN 患者外周血Th22 與IL-22 呈正相關(guān)（r=0.804，P=0.002）。見(jiàn)圖1。

圖1 LN患者外周血Th22與IL-22的相關(guān)性

2.4 LN 患者外周血Th22、IL-22 與SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Th22、IL-22 與SLEDAI 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.342 和0.448，P=0.032 和0.016）。見(jiàn)圖2。

圖2 LN患者外周血Th22、IL-22與SLEDAI評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

SLE 屬于一種自身免疫類(lèi)疾病，可累及身體的各個(gè)臟器，因腎臟血管豐富，易引發(fā)炎癥反應(yīng)，故LN 是SLE 主要的并發(fā)癥[11]。LN 患者久治不愈后導(dǎo)致的進(jìn)行性腎衰竭是致死的重要因素[12]。SLE 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明其可能與環(huán)境因素、性激素等有關(guān)[13]。目前臨床上主要采用激素類(lèi)藥物或免疫抑制類(lèi)藥物治療LN，但都具有一定的毒副作用，故臨床需繼續(xù)探索更有效的治療方案。

有研究表明，LN 患者發(fā)病時(shí)，多種免疫因子和炎癥因子共同激活機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，免疫復(fù)合物累積在腎臟，腎小球系膜呈爆發(fā)性增生，發(fā)生固定細(xì)胞增生，單核巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)等，各種細(xì)胞因子共同參與致病過(guò)程，其中Th 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子作用于B 細(xì)胞，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，損傷自身的器官和組織[14]。早期有研究表明，SLE發(fā)作時(shí)Th1/Th2 處于失衡的狀態(tài)，有“Th1 優(yōu)勢(shì)”或“Th2 優(yōu)勢(shì)”等學(xué)說(shuō)[15]，但目前各報(bào)道結(jié)論尚不完全統(tǒng)一。另有研究表明，SLE 患者若合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，則外周血IL-4 升高[16]；若合并有關(guān)節(jié)炎時(shí)，則IFN-γ 升高[17]，而dsDNA 抗體陽(yáng)性的SLE 患者外周血IL-10 水平也會(huì)升高[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SLE 模型動(dòng)物體內(nèi)在早期是Th1 細(xì)胞因子占據(jù)主導(dǎo)地位，后期則是Th2 細(xì)胞因子主導(dǎo)[15]。隨著研究的深入，逐漸出現(xiàn)獨(dú)立的T 細(xì)胞亞群，具有分泌IL-22 細(xì)胞因子的作用成為T(mén)h22 細(xì)胞。有研究表明，當(dāng)組織發(fā)生感染性炎癥時(shí)，Th-22 可分泌各種趨化因子，促使CD4+T 細(xì)胞聚集，增強(qiáng)抗菌能力，同時(shí)誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞中的免疫細(xì)胞分泌IL-22 等，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫抵抗能力，其中IL-22 的靶器官主要是皮膚和腎臟[19]，且IL-22 和Th22 細(xì)胞因子具有預(yù)測(cè)SLE 亞型的價(jià)值[20]。有報(bào)道稱(chēng)，銀屑病患者Th17、Th2 及Th1 水平均較正常健康人升高[21]，而類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中的單核細(xì)胞中IL-22 和IL-22R1 mRNA 表達(dá)較其他細(xì)胞明顯升高，對(duì)其行免疫組織化學(xué)分析后結(jié)果顯示，IL-22 和IL-22R1 陽(yáng)性細(xì)胞均存在于滑膜細(xì)胞中，但巨噬細(xì)胞中主要是IL-22 陽(yáng)性細(xì)胞[22]。

本研究結(jié)果顯示，LN 組和SLE 組外周血CRP、ESR 及免疫球蛋白水平顯著高于HC 組，而C3 和C4低于HC 組，且3 組Th1 均無(wú)明顯差異。此外，LN組和SLE 組Th22、IL-22 水平顯著高于HC 組，但LN 組與SLE 組Th22、IL-22 水平無(wú)明顯差異。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LN 患者Th22 與IL-22 呈正相關(guān)，且兩項(xiàng)指標(biāo)也與SLEDAI 評(píng)分呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果基本一致[9,15,19]。

綜上所述，Th22、IL-22 參與SLE 和LN 的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)LN 患者Th22 與IL-22 呈正相關(guān)，且兩項(xiàng)指標(biāo)均與SLEDAI 評(píng)分呈正相關(guān)。但本研究樣本量較小，可能影響結(jié)果的外推，有關(guān)LN 在免疫治療方面的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探索，為以后臨床診治提供新的路徑。