富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能和氧化應(yīng)激的影響及其機制研究*

高潔，常相帝，劉益濤，王雅寧，王海婷，董華

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東濱州 256603）

腎結(jié)石是臨床常見的并發(fā)癥及多發(fā)疾病，其中腎草酸鈣結(jié)石是其常見類型，發(fā)病率較高，可嚴(yán)重影響患者腎功能。目前，微創(chuàng)手術(shù)及體內(nèi)碎石均是治療腎草酸鈣結(jié)石的常用手段，但術(shù)后患者常出現(xiàn)較多并發(fā)癥，且容易復(fù)發(fā)，因此尋找新的治療手段抑制結(jié)石形成及結(jié)石沉積具有重要臨床意義[1]。富馬酸二甲酯是用于多發(fā)性硬化癥疾病的基礎(chǔ)藥物，可激活內(nèi)源性抗氧化和抗炎通路。腎草酸鈣結(jié)石發(fā)病機制復(fù)雜，有研究表明腎臟氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致其病情進展的關(guān)鍵因素之一[2]。馬志強等[3]研究顯示，富馬酸二甲酯可以有效降低腎草酸鈣結(jié)石大鼠草酸鈣晶體含量，并抑制大鼠氧化應(yīng)激損傷。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）通路是活性氧敏感的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其家族成員JNK、p38 與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[4]。解斌等[5]研究顯示，p38 MAPK 通路能夠促進腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起腎結(jié)石。目前，富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能及氧化應(yīng)激的改善作用是否與p38 MAPK通路有關(guān)的報道較少。因此本研究基于p38 MAPK信號通路探討富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能及氧化應(yīng)激的改善作用，以期為臨床治療腎草酸鈣結(jié)石提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

30只SPF級、10周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量190～240 g，平均（209±25）g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0009；實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2019-0006。

1.2 主要材料及儀器

富馬酸二甲酯（規(guī)格5 mg，純度≥98%）購自深圳海思安生物技術(shù)有限公司，核固紅染料購自北京伊塔生物科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase, SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malonaldehyde, MDA）檢測試劑盒購自上海莼試生物技術(shù)有限公司，活性氧（reactive oxygen species, ROS）測定試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒購自上海滬震實業(yè)有限公司，蛋白提取試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司，兔抗鼠p-JNK、JNK、p38、p-p38 及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗購自上海鈺博生物科技有限公司。Optima?XPN 超速離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司，CX31-P 型偏振光光學(xué)顯微鏡購自深圳市博視達光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及腎草酸鈣結(jié)石模型的復(fù)制將大鼠隨機分為對照組、模型組、富馬酸二甲酯組，每組10 只。模型組及富馬酸二甲酯組大鼠均腹腔注射0.25% L-羥脯氨酸2.5 kg/（kg·d），連續(xù)7 d，誘導(dǎo)腎草酸鈣結(jié)石大鼠模型，尿鈣水平升高表明模型復(fù)制成功[6]。富馬酸二甲酯組大鼠腹腔注射富馬酸二甲酯25 mg/（kg·d），連續(xù)28 d；對照組、模型組同時腹腔注射等量生理鹽水。期間觀察大鼠一般情況。

1.3.2 標(biāo)本采集于最后一次腹腔注射給藥前1 d，用代謝籠收集3 組大鼠尿液標(biāo)本，于最后一次腹腔注射給藥后1 h 腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取尾靜脈血2 ml，3 000 r/min 離心10 min 后取上清，置入-80℃冰箱冷凍保存，用于檢測腎功能指標(biāo)。3 組大鼠取血完成后處死并取雙腎，其中左腎保存于-80℃冰箱待測；右腎用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片約6 μm 厚，用于后續(xù)檢測。

1.3.3 腎功能指標(biāo)檢測取3 組大鼠尿液及血液，采用全自動生化分析儀檢測尿液中尿蛋白、尿鈣，以及血液中血肌酐水平，共重復(fù)10次[7]。

1.3.4 HE染色取3 組大鼠右腎組織切片，常規(guī)脫蠟、水化后行HE 染色，偏振光光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織草酸鈣晶體沉積情況。觀察5 個視野中大鼠腎組織腎小管草酸鈣晶體形成情況并拍照，統(tǒng)計每個視野草酸鈣晶體數(shù)量，取平均值，共重復(fù)10 次[8]。

1.3.5 大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平檢測取3 組大鼠部分左腎組織，制備組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min 后取上清，分別采用SOD 活性檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒及ROS 檢測試劑盒檢測血清SOD 活性，MDA、ROS水平，共重復(fù)10次[9]。

1.3.6 Western bloting檢測大鼠腎組織p38 MAPK通路蛋白相對表達量取3 組大鼠剩余左腎組織，制備組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，用RIPA 液冰上裂解，孵育20 min 后3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液測定蛋白總量，取20 μg 上清液與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，進行電泳、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 清洗，加入p-JNK、JNK、p-p38、p38 及β-actin 作為一抗（1∶500），4℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃條件下放置1.5 h 后顯影、定影，計算各蛋白相對表達量，共重復(fù)10 次[10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

模型組和富馬酸二甲酯組大鼠均成功復(fù)制腎草酸鈣結(jié)石模型。對照組大鼠整體狀態(tài)良好，皮毛光亮，行動靈活，飲水飲食及大小便均正常；模型組大鼠精神萎靡，皮毛泛黃，慵懶，飲食飲水變少；富馬酸二甲酯組大鼠上述一般情況較模型組有一定程度的改善。

2.2 各組大鼠腎功能比較

3 組大鼠尿蛋白、尿鈣、血肌酐水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與對照組相比，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠尿蛋白、尿鈣、血肌酐水平升高（P＜0.05）；但富馬酸二甲酯組大鼠尿蛋白、尿鈣、血肌酐水平低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎功能比較 （n=10，±s）

表1 各組大鼠腎功能比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組富馬酸二甲酯組F 值P 值血肌酐/（μmol/ml）10.05±1.56 20.23±3.09①15.79±2.38①②44.286 0.000尿蛋白/（mg/ml）2.06±0.31 12.33±1.90①7.98±1.12①②160.711 0.000尿鈣/（mg/ml）0.31±0.05 3.30±0.50①1.97±0.31①②193.124 0.000

2.3 各組大鼠腎組織草酸鈣晶體含量比較

對照組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見草酸鈣結(jié)晶；模型組大鼠大部分腎小管擴張，可見較多草酸鈣結(jié)晶；富馬酸二甲酯組大鼠部分腎小管擴張，可見草酸鈣結(jié)晶，但較模型組少。見圖1。

模型組、富馬酸二甲酯組大鼠腎組織草酸鈣晶體含量分別為（71.66±10.75）個和（43.51±6.53）個，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=247.172，P=0.000），富馬酸二甲酯組較少。

2.4 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較

3組大鼠SOD活性，MDA、ROS水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠SOD活性降低，MDA、ROS水平升高（P＜0.05）；但富馬酸二甲酯組大鼠SOD 活性高于模型組，MDA、ROS 水平低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組富馬酸二甲酯組F 值P 值ROS/%67.93±10.20 156.06±23.41①95.77±15.30①②68.706 0.000 SOD/（u/mg）1.37±0.21 0.55±0.09①0.93±0.15①②67.631 0.000 MDA/（nmol/mg）2.67±0.40 9.82±1.47①5.67±0.86①②126.360 0.000

2.5 各組大鼠腎組織p38 MAPK 通路蛋白相對表達量比較

3 組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與對照組相比，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；但富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量低于模型組（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 各組大鼠腎組織p38 MAPK信號通路蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠腎組織p38 MAPK信號通路蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組富馬酸二甲酯組F 值P 值p-p38 0.45±0.07 1.23±0.19①0.85±0.13①②78.826 0.000 p-JNK 0.37±0.06 1.05±0.16①0.79±0.12①②81.009 0.000

圖2 各組大鼠腎組織p38 MAPK信號通路蛋白的表達

3 討論

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)常見疾病之一，其中腎草酸鈣結(jié)石發(fā)病率較高，患者可出現(xiàn)腎積水及腎盂腎炎，嚴(yán)重情況下導(dǎo)致腎衰竭，且腎結(jié)石患者會出現(xiàn)劇痛，給身體健康帶來嚴(yán)重危害[11]。近年來，臨床多采用微創(chuàng)手術(shù)、體外碎石等方式治療腎結(jié)石，但術(shù)后易復(fù)發(fā)且具有較多并發(fā)癥[12]。富馬酸二甲酯是治療多發(fā)性硬化癥的新藥，其有保護細胞和抗炎作用[13]。徐震等[14]研究顯示，富馬酸二甲酯可能通過抑制腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，對小鼠腎缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。有報道顯示，富馬酸二甲酯可抑制腎草酸鈣結(jié)石的發(fā)生、發(fā)展[3]。目前，富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結(jié)石治療作用的具體機制尚未明確。

血肌酐升高常表明腎功能受損，而腎功能損傷的關(guān)鍵因素之一是分泌大量尿蛋白[15]。草酸鈣晶體是影響尿結(jié)石的主要原因之一，對腎臟上皮細胞產(chǎn)生毒性作用[16]。本研究結(jié)果表明，富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎功能有一定改善作用。有研究表明，草酸鈣晶體附著的腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷是草酸鈣腎結(jié)石發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一[17]。正常機體中，氧自由基生成-清除處于平衡狀態(tài)，病理狀態(tài)下該平衡被破壞，細胞內(nèi)SOD 活性降低，使ROS 升高，破壞細胞結(jié)構(gòu)，生成大量MDA，檢測細胞外SOD 活性和MDA 水平可以反映細胞氧化應(yīng)激損傷程度[18]。趙明等[19]研究顯示，抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠抑制腎草酸鈣結(jié)石形成進展。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠SOD 活性降低，MDA、ROS 水平升高；但富馬酸二甲酯組大鼠SOD活性高于模型組，MDA、ROS 水平低于模型組，說明富馬酸二甲酯可能通過抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制腎草酸鈣結(jié)石形成進展。

MAPK 通路是一種氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通常由JNK、p38 通路及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶等通路組成[20]。王博涵等[21]研究顯示，抑制p38 MAPK 通路活化可有效抑制腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷，進而抑制黏附性尿石形成。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量升高；但富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量低于模型組，與既往研究結(jié)果一致[20-21]。

綜上所述，富馬酸二甲酯可能通過抑制p38 MAPK 通路活化，抑制腎臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制腎草酸鈣結(jié)石形成，進而保護腎功能。而本研究并未能明確富馬酸二甲酯對p38 MAPK 通路的具體調(diào)控作用，有待后期深入研究。