火龍果枝條角質(zhì)改善殼聚糖膜性能的研究

莊遠紅, 郭祉婷, 費 鵬

（閩南師范大學生物科學與技術學院,福建漳州363000）

傳統(tǒng)保鮮膜可以減緩食品水分流失，避免外界接觸污染，但難降解、機械性能低、抑菌性能不強.隨著消費者對食品保藏要求的提高以及對環(huán)境保護意識的提升，由天然性可降解的、具有抑菌功能的生物材料制作而成的包裝膜成為學者的熱門研究點.殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，是天然多糖中唯一的堿性氨基多糖，具有較好的生物相容性、成膜性、抑菌性、可降解性等優(yōu)點[1-4].但是單一的殼聚糖膜具有保濕性低、機械性能不佳、抑菌范圍窄、抗氧化作用不高等缺點[5].角質(zhì)是植物地上器官（如莖、葉等）表面的一層脂肪性物質(zhì)，由C16和C18共價形成的聚酯，是植物角質(zhì)層的重要成分，角質(zhì)層是覆蓋于植物表面的一層疏水性結構，可以平衡植物內(nèi)部膨脹壓、防止植物體內(nèi)水分過分散失、抵御生物和非生物脅迫等[6-8].火龍果枝條表層覆蓋較厚的角質(zhì)層，火龍果枝條角質(zhì)是否能夠增強殼聚糖膜相關性能？實驗從火龍果枝條提取角質(zhì)，添加到殼聚糖中混合制膜，研究角質(zhì)添加對殼聚糖膜微觀結構、機械性能、透氣性、透油性、透光性、抑菌性等的影響，以期為改善殼聚糖膜物理、力學、抑菌等性能提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果枝條（采自閩南師范大學植物園）、殼聚糖（脫乙酰度≥95%，黏度50~200 mPa?s，浙江金殼生物化學有限公司）等.

1.2 儀器設備

MultiSkan Go 全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientific 公司）；CT3-10K 質(zhì)構儀（美國Brookfield 公司）；EL20K 臺式pH 計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；NICOLET-iS-10 傅立葉變換衰減全反射紅外光譜儀（ATR-FTIR）（美國賽默飛世爾公司）；Rigaku UltimalV X 射線衍射儀（日本Rigaku 株式會社）；JSM-6010LA掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）等.

1.3 實驗方法

1.3.1 角質(zhì)提取

火龍果枝條去刺，切段，速凍后真空冷凍干燥，粉碎后，按照Cigognini[9]的方法，火龍果枝條粉末以料液比1︰15浸泡至3%NaOH 溶液（pH14）中，121 ℃熱壓處理120 min，冷卻后4 000 r/min離心30 min，上清液用6 mol/L HCI溶液調(diào)節(jié)pH 至5~6以沉淀角質(zhì)，離心15 min，蒸餾水洗滌沉淀2 次，離心，真空冷凍干燥后即為干燥角質(zhì).

1.3.2 膜的制備

根據(jù)鄭科旺等[10]的方法，將1.5 g殼聚糖溶解于90 mL 2.0%乙酸溶液中，將一定質(zhì)量角質(zhì)溶于10 mL 3%NaOH溶液中，兩者混合之后磁力攪拌1.5 h，加入1%甘油后繼續(xù)攪拌30 min，取20 mL至培養(yǎng)皿中流延，45 ℃烘箱干燥5 h，揭膜并置于6%NaOH 溶液中浸泡3 h，取出后用溫水沖洗至中性，最后45 ℃干燥1 h，獲得角質(zhì)與殼聚糖比例分別為0︰15、2︰15、3︰15、4︰15、5︰15、6︰15的角質(zhì)-殼聚糖膜.

1.3.3 微觀形貌、特征基團及結晶性

選擇角質(zhì)與殼聚糖配比為0︰15 和3︰15 的膜，通過掃描電子顯微鏡觀察膜的微觀形貌（加速電壓10 kV）；通過ATR-FTIR 確定膜的特征基團（波數(shù)范圍4 000~500 cm-1，分辨率4 cm-1）；通過X-射線衍射儀確定膜的結晶特性（Cu靶Kα1射線，電壓40 kV，電流40 mA，2θ范圍：5°~80°，步長0.02°/min）.

1.3.4 膜物理性能測定

膜厚度：隨機選取膜上5個點用游標卡尺測量，取平均值.

透光性：將待測樣品切成直徑6 mm 的圓片，置于酶標孔底部，在400~800 nm 下進行波長掃描，選取最適波長再測量吸光度，按下式計算膜的透光率：

其中：T為透光率；A為吸光度.

水蒸氣透過系數(shù)及吸濕性：對GB1037-2000 方法改進，采用擬杯子法：向離心管中放入無水CaCl2粉末，加入量距離管口5 mm 處為止，稱重；將膜剪成20 mm×20 mm 的正方形，稱重并量其厚度，用膜將試管封口，用橡皮筋和棉線綁緊，倒置放于室溫下底部為飽和鹽水的密封干燥器內(nèi)，使膜內(nèi)外兩側(cè)保持一定蒸汽壓差，每24 h取出離心管，同時將膜卸下，稱取滲透后離心管和CaCl2合重、吸濕后膜的質(zhì)量，至恒重，按下式計算水蒸氣透過系數(shù)和吸濕率：

其中：WVP/g?mm?(m2?H?Pa)-1為水蒸氣透過系數(shù)；Δm/g為氯化鈣質(zhì)量增加量；S/m2為膜封口的面積；Δt/h為測定間隔時間；d/mm 為膜的厚度；Δp/Pa 為膜兩側(cè)的水蒸氣壓差；MAR 為吸濕率；m1/g 為膜的初始質(zhì)量；m2/g為吸濕后膜的質(zhì)量.

透油性：將3 mL 調(diào)和油倒入試管中，用膜封口，并用橡皮筋和棉線綁緊，倒置于稱量好的濾紙上，放置5 d后對濾紙進行稱重，按下式計算膜的透油系數(shù)：

其中：P/(g?mm/(m2?d))為透油系數(shù)；Δm/g 為濾紙的增重；d/mm 為膜的厚度；S/m2為封口處膜的面積；t/d 為透油時間.

1.3.5 膜機械性能測定

使用切膜工具，將膜切成4 mm×50 mm 統(tǒng)一大小，測量膜厚度，使用質(zhì)構儀TA-DGF 雙向拉伸夾具進行拉伸測試，觸發(fā)力0.01 N，測試速度為1.00 mm/s，記錄膜斷裂時的長度和拉伸力，反復3 次，計算抗拉強度和斷裂伸長率：

其中：TS/MPa 為膜的抗拉強度；F/N 為軸向拉伸力；W/mm 為膜的寬度；d/mm 為膜的厚度；EAB 為斷裂伸長率；L/mm為膜斷裂時的長度；L0/mm為膜的初始長度.

1.3.6 抗菌性

采用液體培養(yǎng)法測定角質(zhì)添加對測試菌種（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌）的抑菌效果：在無菌條件下將測試菌種分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃以200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使菌種進入穩(wěn)定的對數(shù)生長期，用無菌水稀釋，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h 后測定OD 值達到0.5 即為菌懸液.將膜切割成直徑為6 mm 的小圓片，在無菌工作臺上取1 mL 菌懸液加入9 mL 的肉湯培養(yǎng)基里面，再放入7 片小圓片，于37 ℃以200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測菌懸液OD值.每個菌種3次重復，同時做空白對照.

2 結果與分析

2.1 角質(zhì)對殼聚糖膜微觀形貌、特征基團及結晶特性的影響

2.1.1 X射線衍射分析

圖1 分別為角質(zhì):殼聚糖為0︰15 和3︰15 的復合膜X 射線衍射圖.由圖1 可知，殼聚糖膜（0︰15）有2 個明顯的結晶峰，衍射角分別為5.86°和20.8°.殼聚糖是直鏈型大分子結構，分子排布較為有序，有許多羥基、氨基等物質(zhì)，可以形成氫鍵，部分分子形成結晶區(qū)[11-12].添加角質(zhì)的殼聚糖膜（3︰15）結晶峰分別在2θ等于5.94°、20.16°，殼聚糖結晶峰稍有減弱，這可能是由于角質(zhì)分子摻入到殼聚糖中，阻礙了其分子的重排結晶.

圖1 角質(zhì)-殼聚糖復合膜X射線衍射圖Fig.1 X-ray diffraction pattern of cutin-chitosan composite membrane

2.1.2 紅外光譜分析

由圖2 可知，0︰15 處理的殼聚糖膜中3 247.54 cm-1處較寬的吸收峰為O-H 和N-H 伸縮振動疊加的多重吸收峰，這是因為殼聚糖與乙酸混合制成的膜液使氨基帶正電荷形成了NH3+，膜液中大量的-OH 和H+很容易締合，形成分子內(nèi)和分子間的氫鍵，由于氫鍵作用強弱和鍵長不同，使得吸收峰頻率范圍較大，因此該處吸收峰的峰型較寬[14].2 875.34 cm-1處出現(xiàn)了一個較弱吸收峰，這是C-H 的伸縮振動引起的，1 542.77 cm-1處出現(xiàn)了一個峰型狹窄的峰是羰基C=O 伸縮振動引起的，1 409.71 cm-1處則是N-H 彎曲振動所形成的，1 024.02 cm-1是C-O-C 的對稱伸縮引起的，921.81、646.04 cm-1處的峰則來自于C-H 面彎曲振動.當殼聚糖與角質(zhì)復合時，如圖2 中的3︰15 處理可知，物質(zhì)間的波譜峰型發(fā)生了變化，3 247.54 cm-1處的伸縮振動峰移動到了3 261.04 cm-1，這是由于殼聚糖中的氨基上的H+與角質(zhì)的OH-形成了氫鍵所致[11]；2 875.34 cm-1C-H 伸縮振動峰向高波移動到了2 917.77 cm-1，這是由于角質(zhì)中C-H 鍵的振動吸收；1 542.77 cm-1移動到了1 548.56 cm-1是由于角質(zhì)中的C=C共軛雙鍵的振動吸收.

圖2 角質(zhì)-殼聚糖復合膜紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of cutin-chitosan composite membrane

2.1.3 掃描電鏡分析

從圖3 可以看出，未添加角質(zhì)的殼聚糖膜（0︰15）表面質(zhì)地光滑，但膜面干燥后有凹凸感[13]；而加入角質(zhì)后，角質(zhì)-殼聚糖復合膜（3︰15）表面粗糙、顆粒感明顯，但角質(zhì)分散均勻，角質(zhì)中柔性分子鏈的填充增強了殼聚糖的空間網(wǎng)絡結構[7]，使得復合膜變得更加致密.

圖3 角質(zhì)-殼聚糖復合膜電鏡分析Fig.3 Electron microscopic analysis of cutin-chitosan composite membrane

2.2 角質(zhì)對殼聚糖膜物理性能的影響

2.2.1 膜厚度

由圖4可以看出，隨著角質(zhì)添加量的增加，復合膜的厚度顯著增加，未添加角質(zhì)的殼聚糖膜厚度最小，僅0.072 mm，而6︰15 的角質(zhì)-殼聚糖復合膜厚度可達0.114 mm，表明角質(zhì)的添加對膜厚度影響較大，這可能是因為角質(zhì)作為填充物進入殼聚糖大分子中，兩者通過氫鍵緊密相連，增強了殼聚糖分子鏈的網(wǎng)絡結構[12]，角質(zhì)添加量越大，網(wǎng)絡結構越牢固，膜厚度越大.

圖4 角質(zhì)對殼聚糖膜厚度的影響Fig.4 The effect of cutin on the thickness of chitosan membrane

2.2.2 透光率

從圖5可以看出，角質(zhì)-殼聚糖復合膜吸光值在420、635、660 nm附近處有峰值，由圖6可以看出，隨著角質(zhì)添加量的增加，各波長下復合膜的透光率呈下降趨勢，表明角質(zhì)的添加降低了膜的透光性，這可能是角質(zhì)填充在殼聚糖分子間，引起了透光率的降低，透光性低可以保護光敏性物質(zhì)不因光的照射而分解.

圖5 角質(zhì)-殼聚糖復合膜的波長掃描圖Fig.5 Scanning wavelength of cutin-chitosan composite membrane

圖6 角質(zhì)對殼聚糖膜透光率的影響Fig.6 Effect of cuticle on the transmittance of chitosan film

2.2.3 水蒸氣透過系數(shù)及吸濕性

由圖7 可以看出，角質(zhì)降低了殼聚糖膜的水蒸氣透過系數(shù)，隨著角質(zhì)添加量的提高，復合膜的水蒸氣透過系數(shù)隨之降低，當角質(zhì)與殼聚糖配比為3︰15 時，水蒸氣透過系數(shù)趨于穩(wěn)定.這主要是因為添加角質(zhì)后，角質(zhì)-殼聚糖網(wǎng)絡結構牢固，水蒸氣透過膜空隙的有效路徑延長[11]，并且角質(zhì)具有疏水基團[15]，能阻擋水蒸氣的透過，所以水蒸氣透過系數(shù)隨著角質(zhì)的添加量增加而降低，當角質(zhì)添加達到一定量時，能夠最大限度阻止水蒸氣的進入，此時水蒸氣透過系數(shù)趨于穩(wěn)定.當水蒸氣無法透過復合膜時，將會聚集在膜表面，使膜的吸濕性增強，所以由圖7還可以看出，隨著角質(zhì)添加量的增加，吸濕率顯著增大，并趨于飽和.

圖7 角質(zhì)對殼聚糖膜水蒸氣透過系數(shù)及吸濕率的影響Fig.7 Effect of cutin on water vapor transmission coefficient and moisture absorption rate of chitosan membrane

2.2.4 透油性

由圖8可以看出，隨著角質(zhì)添加量的增加，角質(zhì)-殼聚糖膜的透油系數(shù)顯著降低（p<0.05），這主要是因為兩者間致密的網(wǎng)絡結構也阻擋了油的透過，故隨著角質(zhì)添加量的增加，透油系數(shù)下降.

圖8 角質(zhì)對殼聚糖膜透油系數(shù)的影響Fig.8 The effect of cutin on the oil permeability coefficient of chitosan membrane

2.3 角質(zhì)對殼聚糖膜機械性能的影響

由圖9 可以看出，隨著角質(zhì)添加量的提高，殼聚糖膜的斷裂伸長率和抗拉強度均迅速增大，當角質(zhì)與殼聚糖配比增大到4︰15后，抗拉強度和斷裂伸長率趨于穩(wěn)定.這是由于殼聚糖中的氨基上的H+與角質(zhì)的OH-形成了氫鍵[11]，因此在受到外力作用時，力學性能得到改善.

圖9 角質(zhì)對殼聚糖膜抗拉強度和斷裂伸長率的影響Fig.9 The effect of cutin on the tensile strength and elongation at break of chitosan film

2.4 角質(zhì)對殼聚糖膜抗菌性的影響

從圖10可以看出，角質(zhì)與殼聚糖的配比為0︰15時，即單一的殼聚糖膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用較差，抑制率僅為8%左右，但隨著角質(zhì)添加量的增加，角質(zhì)-殼聚糖膜對3 種菌的抑制率均顯著增大，說明添加角質(zhì)提高了殼聚糖膜的抑菌性能.其中角質(zhì)-殼聚糖膜對金黃色葡萄球菌的抑制效果好于大腸桿菌和白色念珠菌，對大腸桿菌和白色念珠菌的抑制效果差別不大.角質(zhì)對3 種菌的抑制機理還不清楚，但Alcerito等[16]從二葉藤屬葉的表皮蠟質(zhì)中提煉出4種黃酮類抗真菌成分，Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)缺少蠟質(zhì)層的番茄比蠟質(zhì)層含量豐富的番茄葉表著生更多的菌物，這些都說明了角質(zhì)具有抗菌或抑菌功效.

圖10 角質(zhì)對殼聚糖膜抑菌率的影響Fig.10 The effect of cutin on the antibacterial rate of chitosan membrane

3 結論

角質(zhì)的添加增強了殼聚糖與角質(zhì)之間的物理交聯(lián)，增強了殼聚糖膜的空間網(wǎng)絡結構，提高了膜的致密性，明顯改善殼聚糖膜的物理、力學和抑菌性能.角質(zhì)-殼聚糖膜透光率降低，可保護光敏性物質(zhì)的分解；水蒸氣透過系數(shù)降低，吸濕率增大，透油系數(shù)降低，可提高對食品的保鮮效果；抗拉強度和斷裂伸長率增大，機械性能增強；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用增強，抑菌效果提高.