MTT比色法檢測苦瓜MAP30蛋白對5637細(xì)胞增殖、MALAT1、HOTAIR及UCA1的影響

楊海霞 張鵬 陸倫 鄧秀英 陳艷梅

(遂寧市中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 遂寧 629000)

在細(xì)胞活性與生長的檢測中，噻唑藍(lán)(MTT)比色法的應(yīng)用頻率相對較高，檢測原理主要體現(xiàn)在活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜并沉積于細(xì)胞[1]，而在正常狀況下，死細(xì)胞是無這項功能的。膀胱癌多發(fā)生于膀胱黏膜上，是目前臨床醫(yī)學(xué)中相對常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一[2]，治療方法包括手術(shù)切除、放療、化療等。近年來的相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，作為一種植物蛋白，MAP30(Momoridica anti-HIV protein of 30KD，MAP30)主要從苦瓜種子中提取，實驗證實其有多種生物學(xué)活性，可參與抗病毒、抗腫瘤、抗菌等[3]，但由于MAP30屬大分子藥物，能有效進(jìn)入細(xì)胞的幾率較低，而提高其進(jìn)入細(xì)胞的效率對抗腫瘤應(yīng)用無疑具有十分突出的作用。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中均扮演著重要的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)[4]，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis related transcription factor 1，MALAT1)、lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(Long-chain non coding RNA Hox transcription antisense RNA,HOTAIR)及膀胱尿路上皮癌相關(guān)1(Urothelial carcinomaassociated 1，UCA1)在膀胱癌中均呈高表達(dá)，這提示上述三種物質(zhì)可能是包括膀胱癌在內(nèi)的惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物之一?？喙螹AP30蛋白，對人體中的多種腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用，并可促進(jìn)其凋亡[5]，但與膀胱癌相關(guān)的研究卻相對較少。因此，本文將在MTT法檢測苦瓜MAP30蛋白的基礎(chǔ)上探討苦瓜MAP30蛋白與膀胱癌5637細(xì)胞增殖的關(guān)系及對MALAT1、HOTAIR及UCA1表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細(xì)胞系：膀胱癌5637細(xì)胞系(實驗樣表)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，而苦瓜則購自本院就近區(qū)域的蔬菜批發(fā)市場(均屬新鮮稚嫩苦瓜)，約500 g。實驗菌株：pET-28質(zhì)粒載體、DH5α克隆菌株及BL21(DE3)表達(dá)菌株均為本院自存。試劑：改良型RPMI Medium1640培養(yǎng)基(Gibico公司)，RIPA裂解液(碧云天公司)、DNA凝膠回收試劑盒(捷瑞生物工程有限公司)、質(zhì)粒小量制備試劑盒(捷瑞生物工程有限公司)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Genebase公司)、4%多聚甲醛(上海世澤生物科技有限公司)、MTT(上海世澤生物科技有限公司)。實驗儀器：熒光酶標(biāo)儀(賽默飛公司)、80-2B臺式及TGL-16C離心機(上海離心機研究所)、ECP3000電泳儀(北京六一儀器廠)、超低溫冰箱(日本三洋公司)、BB5060 CO2培養(yǎng)箱(賽默飛公司)、PCR儀(賽默飛公司)、微孔濾膜(0.22 μm，Bio-Rad公司)、流式細(xì)胞儀(Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜MAP30基因的克隆、表達(dá)及純化 克隆：在成功構(gòu)建并保存重組質(zhì)粒EGFP-pET28a及EGFP-HBD-pET28b質(zhì)粒的基礎(chǔ)上將其轉(zhuǎn)化成大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21菌株后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)(溫度：37℃，培養(yǎng)時間：60 min)，然后構(gòu)建MAP30重組表達(dá)載體(帶有信號肽的載體：MAP30s-pET28a、MAP30s-HBD-pET28a)，然后以苦瓜果肉基因組DNA為模板進(jìn)行苦瓜MAP30擴增物序列(表1)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴增處理并電泳(瓊脂糖凝膠電泳儀)后進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，然后將其連接于pMD-19T simple載體上，接著再次進(jìn)行菌落PCR驗證，并在4℃條件下連接過夜。采用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將擴增片段克隆至pET-28質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴增，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切體系進(jìn)行鑒定。融合蛋白表達(dá)：將上述構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒表達(dá)型感受態(tài)細(xì)胞(DE3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理并提取其單菌落接種(卡那霉素：50 μg/mL)于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)(溫度：37℃，培養(yǎng)時間：16 h)后加入異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside，IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心(離心速率：3000 r/min，離心時間：0.5 h)處理，收集上清及包涵體后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，最后進(jìn)行純化。純化：用超純水清洗介質(zhì)后進(jìn)行平衡Ni-NTA層析柱處理，并使其pH穩(wěn)定，待上樣完成后用緩沖液A清洗柱體以去除雜蛋白并確保獲取無雜質(zhì)的目的蛋白；然后用超純水清洗介質(zhì)至中性后加入20%乙醇保存，4℃保存，接著收集蛋白樣品后置于透析液中透析4次，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并用無菌PCR管分裝和置于超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 苦瓜MAP30擴增引物序列

1.2.2 5637細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的膀胱癌5637細(xì)胞取出并快速水浴(42℃)而使其解凍，接著將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入10 mL無菌離心管中離心(離心速率：1000 r/min，離心時間：6 min)處理后去上清并預(yù)熱處理后轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d至細(xì)胞貼壁。加入含小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液復(fù)蘇培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后用胰蛋白酶消化，吸管反復(fù)吹打至形成單個細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代培養(yǎng)或置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MAP30蛋白對5637細(xì)胞增殖影響的檢測 按MTT實驗檢測相關(guān)步驟操作，將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化懸液后置入96孔板中并進(jìn)行過夜(溫度37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱)，培養(yǎng)至貼壁。37℃孵育24 h后去培養(yǎng)箱并加入細(xì)胞培養(yǎng)液(MTT溶液20 mL和180 mL無血清)，鋪板使細(xì)胞調(diào)密度至2×103/孔，再次孵育(CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，時間4 h)處理后棄孔內(nèi)培養(yǎng)基并加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解150 μL(甲瓚)后置于搖床上振蕩10 min，最后讀取其OD490吸光值。抑制率計算公式：細(xì)胞生長抑制率=(1-處理組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.2.4 MAP30蛋白對5637細(xì)胞凋亡的影響檢測 將5637細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)，接著加入不同濃度(0、100、200、400 μg/mL)的MAP30蛋白溶液，以上4種濃度的MAP30溶液各重復(fù)5孔，培養(yǎng)時間分別24、48 h。上述實驗重復(fù)3次。按凋亡檢測試劑盒說明書要求檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 MAP30蛋白對lncRNA表達(dá)的影響檢測 培養(yǎng)5637細(xì)胞(24、48 h)并提取(TRIzol試劑)其總RNA。接著將總DNA合成cDNA(Reagents試劑盒逆轉(zhuǎn)錄)并檢測(檢測方法：RT-PCR)lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1相對表達(dá)(RQ)值，RQ=2-△Ct，△Ct=Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)參。引物序列見表2。

表2 RT-PCR檢測時所用引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，不同濃度的MAP30蛋白與5637細(xì)胞增殖的抑制與凋亡效能等計數(shù)資料用2檢驗。苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA表達(dá)等計量資料用t檢驗，以表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的MAP30蛋白與膀胱癌5637細(xì)胞的抑制與凋亡效能比較 抑制率：膀胱癌5637細(xì)胞增殖時所產(chǎn)生的抑制率越高時，MAP30蛋白的濃度也越高，且時間越長，即MAP30蛋白濃度與膀胱癌5637細(xì)胞增殖呈正比(P<0.05)。凋亡率：膀胱癌5637細(xì)胞凋亡隨MAP30濃度遞增而逐漸上升，且MAP30濃度(培養(yǎng)48h)為400μg/mL時，膀胱癌5637細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高，MAP30濃度與膀胱癌5637細(xì)胞凋亡呈正比(P<0.05)，見圖1～3。

圖1 不同濃度MAP30蛋白對5637細(xì)胞凋亡相關(guān)流式圖

圖2 不同濃度的MAP30蛋白與膀胱癌5637細(xì)胞的抑制效能

圖3 不同濃度的MAP30蛋白與膀胱癌5637細(xì)胞凋亡的影響

2.2 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA表達(dá)的相關(guān)性 膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達(dá)水平隨苦瓜MAP30蛋白濃度的遞增而逐漸降低，檢測時間為48 h且苦瓜MAP30蛋白濃度為400 μg/mL時上述三項指標(biāo)的表達(dá)水平均顯著低于檢測24、48 h時的其他苦瓜MAP30蛋白濃度(P<0.05)，見圖4～6。

圖4 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA MALAT-1表達(dá)的影響

圖5 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA HOTAIR表達(dá)的影響

圖6 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA UCA1表達(dá)的影響

3 討論

近年來的研究表明，以微小RNA(Micro RNA，miR)為典型的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNAs)在各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中具有重要作用[6]。有研究表明，膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后均與miR-1、miR-499和miR-208的針對性調(diào)控相關(guān)[7]。苦瓜MAP30蛋白是常見的真核基因之一，生物活性良好，作為一種Ⅰ型核糖體失活蛋白，不僅抗病毒、抗菌、抗腫瘤活性較強，且在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也有較好的特異性，且對未感染的正常二倍體細(xì)胞也幾乎無毒性，耐藥性極低[8-11]。研究認(rèn)為，MAP30蛋白對肝癌、骨髓癌、乳腺癌等惡性腫瘤及黑色素癌、大腸癌、食管癌等的腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡均有較好的抑制和誘導(dǎo)作用[12-13]，但MAP30蛋白與膀胱癌是否存在相關(guān)性的研究數(shù)據(jù)卻鮮有報道。

相關(guān)研究證實，腫瘤細(xì)胞的凋亡顯然受lncRNA的調(diào)控[14-15]，MALAT-1表達(dá)與腫瘤嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可能通過增加HMGB1蛋白表達(dá)，促進(jìn)凋亡基因自噬，從而抑制細(xì)胞凋亡[16]。HOTAIR可增加自噬在機體損傷中的機制，而MiR-20b-5p又可通過靶向ATG7抑制細(xì)胞自噬，而HOTAIR又可將MiR-20b-5p調(diào)控為內(nèi)源性海綿，這又無疑提升了ATG7的表達(dá)水平[17]。UCA1作為一種新型的調(diào)控因子，在各種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要作用，其水平表達(dá)與病理分級、臨床分期和復(fù)發(fā)關(guān)系等密切相關(guān)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，UCA1mRNA表達(dá)在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常膀胱組織[20]，提示，下調(diào)UCA1對促進(jìn)膀胱癌組織中的腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制5637細(xì)胞的增殖均有極大幫助。

本研究結(jié)果表明，苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞增殖的抑制和凋亡誘導(dǎo)方面均有較好的效果。提示膀胱癌5637細(xì)胞的增殖與凋亡同樣受苦瓜MAP30蛋白的調(diào)控。其機制可能如下：①作為一種常見的核糖體失活蛋白，苦瓜MAP30蛋白可通過抑制膀胱癌患者的腫瘤細(xì)胞中的核糖體活性而起到抑制細(xì)胞蛋白合成之目的，最終對腫瘤的生長、惡化及細(xì)胞凋亡其抑制與誘導(dǎo)。②苦瓜MAP30蛋白的抗癌作用可通過上調(diào)機體中的黏附分子CD34表達(dá)，繼而改變腫瘤細(xì)胞的粘附性。③苦瓜MAP30蛋白具有抗病毒和抗菌作用。④苦瓜MAP30蛋白可對ERK1、AKT活化進(jìn)行抑制，從而促進(jìn)NF-kB通路活性被抑制，這同樣有利于膀胱癌腫瘤細(xì)胞的凋亡。除此之外，近年來的研究也證實，苦瓜MAP30蛋白在惡性腫瘤中的機制還包括降低線粒體膜電位而促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，影響突變型p53基因表達(dá)及上調(diào)凋亡前期蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等[21]，但這些機制仍需進(jìn)一步研究提供佐證。

本研究表明，膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達(dá)水平隨苦瓜MAP30蛋白濃度的遞增而逐漸降低，檢測48 h且苦瓜MAP30蛋白濃度為400 μg/mL時，膀胱癌5637細(xì)胞lncRNA 中的MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達(dá)水平均顯著低于檢測24、48 h時的其他苦瓜MAP30蛋白濃度(P<0.05)，提示上述三項指標(biāo)均受苦瓜MAP30蛋白的調(diào)控。同時隨著MAP30蛋白作用濃度提高，5637細(xì)胞MALAT-1、HOTAIR和UCA1等的lncRNA表達(dá)均隨著苦瓜MAP30蛋白濃度的增高而逐漸下降，提示MAP30可能通過抑制MALAT-1、HOTAIR和UCA1的增殖和誘導(dǎo)其凋亡。

4 結(jié)論

苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細(xì)胞增殖的抑制和凋亡誘導(dǎo)方面有較好的效果，且可下調(diào)MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達(dá)水平。