非小細(xì)胞肺癌血清外泌體miR-152-5p和AGAP2-AS1水平變化及其預(yù)后評(píng)估價(jià)值*

張旭 魏華華 王偉 石俊青 張藝凡

(1.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院·成都市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科二病區(qū)，四川 成都 610041；2.成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610000)

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居全球首位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌患者中約有80%以上為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，早期 NSCLC患者手術(shù)治療后5年總生存率可達(dá)86%，然而，肺癌早期確診較為困難，大部分NSCLC患者確診時(shí)已為晚期階段，5年生存率甚至低于10%[1-2]。通過支氣管鏡或胸腔穿刺術(shù)活檢等是目前 NSCLC診斷最可靠方法，然而這些操作不適用疾病普查，更不適合連續(xù)監(jiān)測(cè)。因此，探索新的NSCLC診斷標(biāo)志物對(duì)提高患者生存期具有重要價(jià)值。外泌體是細(xì)胞分泌的微小囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。外泌體可在血液、汗液、胸水、腹水、尿液等多種體液中檢測(cè)到，可反映細(xì)胞生理病理狀態(tài)[3]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小分子 RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，外泌體可介導(dǎo) miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在基因調(diào)控、監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移中均具有重要作用[5]。本研究通過分析非小細(xì)胞肺癌血清外泌體miR-152-5p和lncRNA AGAP2-AS1水平，探討其在在NSCLC早期診斷及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，旨在為臨床疾病的診斷與治療提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取成都市第一人民醫(yī)院2014年6月～2016年12月收治的120例NSCLC患者臨床資料(NSCLC組)，另選擇60例同期于本院進(jìn)行健康體檢的人群作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為NSCLC。②影像學(xué)檢測(cè)證實(shí)。③可接受隨訪。④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位或其他腫瘤類型。②合并血液、骨髓、免疫性疾病。③合并心腦血管疾病。④合并嚴(yán)重感染。⑤近3個(gè)月內(nèi)接受過放化療或外科手術(shù)治療。

1.2 方法 NSCLC患者與疾病初次診斷時(shí)，健康體檢者于體檢當(dāng)日采集空腹靜脈血，均于采集24 h內(nèi)予以離心處理，取上層血清，保存于-80℃條件下待檢，注意避免溶血。

1.2.1 血清外泌體的提取與鑒定 溶解冷凍血清，4℃條件下以3000 r/min離心15 min，去除沉淀以及脂質(zhì)層。取500 μL至EP管，加入SBI沉淀劑120 μL，顛倒混勻，于4℃～8℃低溫條件下靜置30 min，13000 r/min高速離心2 min，棄上清，留沉淀，使用200 μL吸頭鋪開沉淀于管壁。

1.2.2 RT-PCR定量檢測(cè)血清外泌體中RNA 往沉淀中加入700 μL QIAZOL Lysis Reagent，攪拌至沉淀溶解，加入100 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫條件下靜置2 min。4℃條件下以12000 r/min離心15 min，調(diào)至室溫。取上層水相350 μL轉(zhuǎn)移至EP管，加入525 μL無水乙醇，混勻，取700 μL 樣品加入RNeasy Mini Spin Column，12000 r/min離心30 s，棄流出液，若液體殘留則重復(fù)離心處理。向柱子中加入700 μL Buffer RWT，12 000 r/min離心30 s，棄流出液。向柱子中加500 μL Buffer RPE，12000 r/min離心30 s，棄流出液，重復(fù)1次，空轉(zhuǎn)1 min，濾膜干燥。將柱子轉(zhuǎn)移至EP管中，加入35 μL RNeasy -free water，12000 r/min離心1 min，RNA洗脫，使用Nano-Drop 2 000檢測(cè)RNA的濃度。按照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過RT-PCR檢測(cè)miR-152-5p和lncRNA AGAP2-AS1相對(duì)表達(dá)量。以U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，U6引物序列為5′-TTATGGGTCCTAGCCTG ACCACTATTGCGGCtGCTGC-3′，miR-152引物序列:5′-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TTCCTCATCAAGTCGGAG -3′。lncRNA AGAP2-AS1引物序列為5′-TAGAGCAAGTGATGACAAC AGGCAGGTAACAATGGAGAA-3′，△Ct= CtAGAP2-AS1-CtU6。采用2-△△Ct法計(jì)算兩者的相對(duì)表達(dá)量，△Ct=CtmiR-152-CtU6。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 NSCLC組包括男性66例，女性54例；年齡41～78歲，平均(65.59±5.40)歲；吸煙史：有57例，無63例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期75例，Ⅲ～Ⅳ期45例；局部浸潤(rùn)程度：T1～T2共78例，T3～T4共42例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無67例，有53例。對(duì)照組包括男性32例，女性28例；年齡40～77歲，平均(65.94±5.97)歲；吸煙史：有27例，無33例。兩組性別、年齡、吸煙史比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)水平比較 NSCLC組患者miR-152-5p表達(dá)水平低于對(duì)照組，lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC組與對(duì)照組miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)水平比較

2.3 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1診斷NSCLC價(jià)值分析 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1聯(lián)合檢測(cè)診斷NSCLC的發(fā)生ROC曲線下面積高于單獨(dú)檢測(cè)ROC曲線下面積(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1診斷NSCLC價(jià)值分析

圖1 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平診斷NSCLC疾病ROC曲線

2.4 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡NSCLC患者miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、局部浸潤(rùn)T3/T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-152-5p表達(dá)低于Ⅰ～Ⅱ期、局部浸潤(rùn)T1～T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期、局部浸潤(rùn)T1～T2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，見表3。

表3 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系分析

2.5 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1在NSCLC病理分期中的應(yīng)用價(jià)值 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1聯(lián)合檢測(cè)判斷NSCLC患者Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期ROC曲線下面積高于單獨(dú)檢測(cè)ROC曲線下面積(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1評(píng)估NSCLC患者Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期價(jià)值分析

圖2 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1評(píng)估NSCLC患者Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期ROC曲線

2.6 NSCLC生存與死亡患者 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)水平比較 隨訪3年，120例NSCLC患者中共有5例失訪，其余115例患者中生存組患者66例，死亡組患者49例，生存組miR-152-5p表達(dá)量高于死亡組，lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)量低于死亡組(P<0.05)，見表5。

表5 生存與死亡組miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)水平比較

2.7 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后價(jià)值分析 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1聯(lián)合檢測(cè)判斷NSCLC預(yù)后ROC曲線下面積為0.849高于單獨(dú)檢測(cè)ROC曲線下面積0.739、0.714(P<0.05)，見表6、圖3。

圖3 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后ROC曲線

表6 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后價(jià)值分析

3 討論

外泌體廣泛存在于多種人體體液，其含有多種生物活性分子如mRNA 、miRNA 、lncRNA 、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等[6-7]。外泌體因能反映來源細(xì)胞病理狀態(tài)，被認(rèn)為是極具潛力的新型診斷標(biāo)志物，被應(yīng)用于多種類型疾病的診斷及治療[7]。miRNA是長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性、短單鏈非編碼RNA 分子，與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等密切相關(guān)，在真核生物基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中具有關(guān)鍵性作用[4,8]。汪毅等[9]研究結(jié)果顯示miR-152在消化系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞與組織中表達(dá)水平下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等重要的生物學(xué)功能，具有抑癌基因作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-152在NSCLC患者血清外泌體中同樣為低表達(dá)狀態(tài)，miR-152 在NSCLC診斷中ROC曲線面積為0.813，診斷效能較高。本研究對(duì)NSCLC臨床病理分期與 miR-152-5p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)miR-152-5p相對(duì)表達(dá)量與患者年齡、性別無關(guān)，與TNM分期、局部浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。以上研究結(jié)果說明血清外泌體中miR-152-5p可能成為NSCLC早期診斷的特異生物標(biāo)志物。鄭清月等[10]研究結(jié)果顯示miR-152通過作用于神經(jīng)蛋白-1 和AD-AM17來抑制NSCLC進(jìn)展，miR-152的表達(dá)和肺腺癌患者生存期正相關(guān)。本研究分析miR-152表達(dá)在患者預(yù)后中的評(píng)估價(jià)值結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.739。

lncRNAs的表達(dá)改變是腫瘤發(fā)生驅(qū)動(dòng)因素之一，其在不同階段均參與基因表達(dá)調(diào)控。作為信號(hào)分子，lncRNAs可和蛋白質(zhì)相互結(jié)合，形成復(fù)合物與啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄過程；lncRNAs可作為引導(dǎo)員，指引蛋白靶向運(yùn)動(dòng)到相應(yīng)啟動(dòng)子位點(diǎn)；此外作為誘餌，lncRNAs可阻止調(diào)控蛋白與啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合[11-12]。越來越多的研究顯示異常lncRNA 表達(dá)在腫瘤發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用[13-15]。AGAP2-AS1是一種反義lncRNA，轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)12q14.1，1567個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。Zheng等[16]研究結(jié)果顯示AGAP2-AS1在人類NSCLC中過表達(dá)。本研究中NSCLC組患者血清外泌體中AGAP2-AS1表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，與上述研究結(jié)果一致。AGAP2-AS1在NSCLC診斷中ROC曲線面積為0.808，提示血清外泌體 AGAP2-AS1診斷 NSCLC 的診斷效能較高。王凱等[17]研究結(jié)果顯示AGAP2-AS1在人腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中高度表達(dá)，其表達(dá)量與患者不良預(yù)后有關(guān)，且沉默AGAP2-AS1可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移，提示AGAP2-AS1可能在腎細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用。本研究中不同臨床病理分期、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)NSCLC患者AGAP2-AS1表達(dá)水平具有明顯差異。Nakken等[18]研究結(jié)果顯示肺癌患者AGAP2-AS1與其臨床病理分期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Su等[19]研究則表明肺癌患者臨床病理為Ⅲ～Ⅳ期的患者miR-152-5p水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，同時(shí)miR-152-5p、AGAP2-AS1二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期腫瘤分期的鑒別價(jià)值高達(dá)0.902，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。Messemaker等[20]研究中分析200例NSCLC患者中AGAP2-AS1高表達(dá)與低表達(dá)患者3年生存率，結(jié)果顯示AGAP2-AS1高表達(dá)患者3年生存率高于低表達(dá)患者。本研究中AGAP2-AS1表達(dá)在患者不良預(yù)后中的評(píng)估價(jià)值，ROC曲線下面積為0.714，miR-152-5p預(yù)后預(yù)測(cè)曲線下面積為0.739，表明NSCLC患者AGAP2-AS1、miR-152-5p水平可反映患者預(yù)后，作為判斷NSCLC生存和預(yù)后指標(biāo)。

4 結(jié)論

NSCLC患者血清外泌體miR-152-5p呈現(xiàn)低表達(dá)，lncRNA AGAP2-AS1呈現(xiàn)高表達(dá)，二者表達(dá)水平與NSCLC臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在患者疾病診斷與預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值。