進境德國云杉原木中夾帶櫟樹猝死病菌的檢疫鑒定

李雪蓮， 呂 燕 ， 劉 芳， 張慧麗， 段維軍*

1寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 寧波 315012； 2寧波海關(guān)，浙江 寧波 315012；3中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

近年來，國內(nèi)木制品加工產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，我國木材及木制品需求量不斷增加，國內(nèi)本土木材已經(jīng)滿足不了市場的需求，不得不依靠進口來彌補國內(nèi)缺口，我國已成為世界上第二大木材消耗國和第一大木材進口國。我國原木進口具有數(shù)量大、來源多、材種多等特點。據(jù)統(tǒng)計，我國原木進口量從1997年的447.1萬m3增長到2018年的5975萬m3(張嘉然等，2019)。原木來源涉及全球六大洲近百個國家和地區(qū)，包括400余種木材。原木進境口岸122個，陸路和海港口岸均有進口。由于進境原木為粗加工植物產(chǎn)品，攜帶疫情十分復(fù)雜，其中檢疫性有害生物占總截獲次數(shù)的比例高達25.41%(李瑞法等，2015)，口岸原木檢疫工作面臨嚴峻考驗。盡管截獲檢疫性有害生物種類眾多，但以往由進境原木中截獲的疫情主要集中在昆蟲和雜草類，植物病原菌物截獲種類較少，僅有從比利時和荷蘭進境的水曲柳FraxinusmandshuricaRupr.原木中截獲蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌BotryosphaeriastevensiiShoemaker(張露茜等，2015)的報道，亟需引起高度重視。

櫟樹猝死病由多枝疫霉PhytophthoraramorumWerres，De Cock & Man in′t Veld (Rizzoetal.，2002； Werresetal.，2001)引起，是一種未知起源、毀滅性的林木和觀賞植物卵菌病害，一旦入侵立足后幾乎無法根除(Brasieretal.，2004; Brasier & Webber，2010)。多枝疫霉隸屬于假菌界Chromista卵菌門Oomycota霜霉目Peronosporales霜霉科Peronosporaceae疫霉屬Phytophthora。該病菌于1993年在德國和荷蘭有枯萎癥狀的杜鵑花RhododendronsimsiiPlanch.和莢蒾ViburnumdilatatumThunb.上分離獲得，1995年美國加利福尼亞中北部沿海地區(qū)的密花石櫟Lithocarpusdensiflorus和櫟屬Q(mào)uercusspp.植物也有發(fā)現(xiàn)，給當?shù)亟?jīng)濟和森林生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大損失。由其引起的病害危害嚴重，擴散迅速，寄主眾多，且難以控制，短短幾年間在北美、歐洲大面積擴散，引起世界各國科學(xué)家的重視和關(guān)注(Gossetal.，2011； Grünwaldetal.，2008； Ioosetal.，2006； Prosperoetal.，2007； Werres & Kaminski，2005； Werres & Zielke，2003)。目前，該病菌已被古巴、韓國、荷蘭、加拿大、智利等多個國家列為檢疫性有害生物。鑒于其嚴重危害性，我國已將櫟樹猝死病菌列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2007)。

櫟樹猝死病菌能產(chǎn)生多種類型的孢子，在被侵染植物材料和土壤中越冬，近距離傳播主要通過雨水滴濺、風(fēng)和灌溉傳播到植物組織上，遠距離傳播主要通過感病苗木等來自疫區(qū)的貨物進行傳播(李百勝等，2005； 王穎等，2002； Parke & Peterson，2019)。櫟樹猝死病菌可隨植物產(chǎn)品貿(mào)易進行傳播，必須密切防范該檢疫性病菌的傳入。2020年11月，寧波口岸從德國進境的云杉PiceaasperataMast.原木中發(fā)現(xiàn)夾帶有疑似水青岡FaguslongipetiolataSeem.枝條，懷疑其可能攜帶櫟樹猝死病菌，對該枝條進行常規(guī)分離培養(yǎng)，并提取該枝條的DNA進行巢式PCR檢測和DNA序列測定分析研究，檢測是否攜帶有櫟樹猝死病菌，以期為口岸檢疫、疫情防控及后續(xù)相關(guān)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試樣品 供試樣品為自德國進境云杉原木中夾帶的水青岡枝條，陽性對照為櫟樹猝死病菌質(zhì)粒DNA，陰性對照為不攜帶櫟樹猝死病菌的杜鵑葉片DNA，空白對照為無菌水。

1.1.2 試劑材料 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar， PDA)(杭州微生物試劑有限公司)含有氯霉素100 μg·mL-1，用于病菌分離、純化和保存。核酸提取試劑盒為TANBead?Plant DNA Auto Kit(臺灣奈米技術(shù)開發(fā)有限公司)，2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)，100 bp Marker[寶生物工程(大連)有限公司]，其他試劑均為分析純。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品分離 從來自德國的進境云杉夾帶的植物枝條及葉片中挑取有疑似癥狀的植物莖稈或葉片，采用常規(guī)分離方法進行分離。用1%次氯酸鈉表面消毒3 min后，取出于無菌水中漂洗3次，無菌濾紙上吸干水分后，置于PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗培養(yǎng)。待長出菌落后，純化并觀察。

1.2.2 基因組DNA提取 從供試樣品中取有疑似癥狀的植物葉片，置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍，加液氮研磨，根據(jù)Kingfisher mL和TANBead?Plant DNA Auto Kit使用說明，提取3份樣品DNA(編號：13271-1、13271-2、13271-3)。提取的DNA經(jīng)分光光度計檢測濃度后，凍存于-20 ℃冰箱備用。為鑒定寄主植物種類，挑取干凈植物莖稈，剝?nèi)ネ馄?，將植物莖稈切小段后，采用上述方法提取植物DNA。

1.2.3 寄主植物ITS序列擴增和測序 采用引物ITS5a/ITS4進行ITS片段擴增，ITS5a:5′ -CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3′(Stanfordetal.，2000)；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(Whiteetal.，1990)。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 °C 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有明顯的特異性條帶，確認擴增成功后，產(chǎn)物送上海華大基因科技有限公司進行雙向測序。

1.2.4 櫟樹猝死病菌特異性引物PCR擴增和測序 參照SN/T 2080—2008《櫟樹猝死病菌檢疫鑒定方法》(國家認證認可監(jiān)督管理委員會，2008)中的PCR方法，采用特異性引物對所提取樣品基因組DNA(編號：13271-1、13271-2、13271-3)進行巢式PCR，首輪PCR引物對為Phyto1(5′-CATGGCGAGCGCTTGA-3′)和Phyto4(5′-GAAGCCGCCAACACAAG-3′)；第2輪引物對為Phyto2(5′-AAAGCCAAGCCCTGCAC-3′)和Phyto3(5′-GGTGGATGGGGACGTG-3′)。其中，第2輪DNA樣品為稀釋100倍的首輪PCR產(chǎn)物。

用實驗室制備的櫟樹猝死病菌質(zhì)粒DNA作為陽性對照，無菌水作為空白對照，用不攜帶櫟樹猝死病菌的杜鵑葉片DNA作為陰性對照。兩輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均相同，50 μL反應(yīng)體系：25 μL 2×Taq Master Mix，3 μL正向引物(10 μmol·L-1)，3 μL反向引物(10 μmol·L-1)，10 μL 模板DNA，加ddH2O至50 μL；反應(yīng)條件： 94 ℃ 85 s；93 ℃ 35 s，62 ℃ 55 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)，最后72 ℃ 7 min。第2輪PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀分析結(jié)果。產(chǎn)物送上海華大基因科技有限公司進行雙向測序。

1.2.5 PCR產(chǎn)物序列分析 利用NCBI網(wǎng)站( https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的局部相似性基本查詢工具(basic local alignment search tool,BLAST)對測得的序列進行比對分析，確認序列的可靠性。由于3份DNA樣品測得序列完全一致，因此將測序獲得的1條代表性特異性片段序列(13271-1)與GenBank中下載的櫟樹猝死病菌及其近似種的序列用Clustal X軟件聚類分析，利用MEGA 6.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以煙草疫霉菌Phytophthoranicotianae和惡疫霉Phytophthoracactorum序列為外群，進行1000次重抽樣計算系統(tǒng)樹中節(jié)點的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離情況

在25 ℃下，分離物在PDA平板上生長7 d后，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列測定后，檢出青霉屬Penicilliumsp.、曲霉屬Aspergillussp.、粘帚霉屬Gliocladiumsp.和鏈格孢屬Alternariasp.等真菌的分離物，以腐生菌為主。采用PDA平板分離法，未分離獲得櫟樹猝死病菌分離物。

2.2 寄主植物種類鑒定

利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)y得的ITS序列進行比對分析，該寄主植物枝條(圖1)的ITS基因序列與GenBank中的殼斗科Fagaceae水青岡屬Fagussp.基因序列相似性達99%以上。

圖1 德國進境云杉原木及其夾帶的水青岡枝條

2.3 櫟樹猝死病菌特異性引物PCR

用櫟樹猝死病菌引物對phyto1/phyto4和phyto2/phyto3對樣品基因組DNA(編號：13271-1)進行巢式PCR檢測，陰性和空白對照無擴增產(chǎn)物，陽性對照和待測樣品均擴增得到了約為280 bp的特異性DNA片段(圖2)。

圖2 特異性引物phyto2/phyto3 PCR檢測結(jié)果

2.4 序列分析

測定的序列與NCBI中登錄號為AY423276、AY423288、AY423289、MF441634、MF441641和NR147877等櫟樹猝死病菌的ITS序列相似性達99%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3)顯示，供試樣品13271-1序列與P.ramorum的模式菌株CBS 101553序列聚為一支(bootstrap值為82)。

圖3 基于櫟樹猝死病菌及近似種類的rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

寄主植物不同，櫟樹猝死病菌可引起不同癥狀，造成寄主植物樹干潰瘍或葉片枯死等癥狀，進而使寄主植物短時間內(nèi)死亡。其病原菌可隨感病葉片、幼枝、植物苗木和觀賞植物進行傳播擴散，且植物受到侵染后無有效的防治方法(Brasier & Webber，2010)。目前，櫟樹猝死病菌的相關(guān)寄主已超過150余種，包括森林樹木、灌木、草本植物和木本觀賞植物等(Parke & Peterson，2019)，且其寄主名單還在不斷增加(APHIS，2020)，進境原木中櫟樹原木Quercusspp.、楓木原木Acerspp.、花旗松原木Pseudotsugaspp.和山毛櫸原木Fagusspp.等多個樹種均是其自然寄主(國家認證認可監(jiān)督管理委員會，2008)。進境原木攜帶櫟樹猝死病菌風(fēng)險很高，需要高度重視。

在園藝苗圃中，櫟樹猝死病菌的傳播多發(fā)生在相鄰的、接觸的植物或有地表水相連接寄主植物之間，灌溉水是苗圃間病菌傳播的重要來源(Parke & Peterson，2019)。受侵染植物的運輸是櫟樹猝死病菌長距離傳播的主要途徑，這也是該病菌傳入歐洲和北美的原因。自2007年從德國引進的高山杜鵑Rhododendronspp.上首次檢出櫟樹猝死病菌以來(陳小龍等，2007)，該病菌已在上海、寧波、杭州等口岸的意大利、波蘭、荷蘭等歐洲國家進境種苗上多次被截獲(段維軍，2019； 段維軍等，2017)。從目前我國所截獲檢疫性菌物的寄主范圍來看，櫟樹猝死病菌的寄主最多，高達67種植物，且均為進境種苗(段維軍等，2017)。可見，進境苗木中櫟樹猝死病菌的檢測是口岸植物檢疫工作的重點。在進境原木檢疫工作中，盡管我國有大量來自歐洲和美國的原木進口，但對于進境原木中櫟樹猝死病菌的檢測重視程度仍不夠，鮮有截獲報道。同時，由于進境原木搬運掏箱等都較為困難，以往的檢疫工作多關(guān)注昆蟲類有害生物，對菌物類關(guān)注較少。70%～80%的植物病害是由菌物所造成的(謝聯(lián)輝，2006)，進境原木中檢疫性菌物的檢疫鑒定工作亟待加強。

櫟樹猝死病菌是一種十分危險的檢疫性菌物。據(jù)測算，該病菌對美國加利福尼亞州10年間造成的經(jīng)濟損失高達近百億美元(Kovacsetal.，2011)。已有研究表明，櫟樹猝死病菌傳入我國及其在我國定殖的風(fēng)險性極高，傳入風(fēng)險性、定殖風(fēng)險性和潛在的危害嚴重度均較高(陳培昶和池杏珍，2008)；且在我國的適生區(qū)廣闊，屬于極高風(fēng)險的有害生物(方舟等，2016； 劉誠和曹春香，2014； 邵立娜等，2008)。林司曦和葉建仁(2020)研究建議，在進境檢疫中對其可能寄主植物實施嚴格檢疫及2年以上的隔離試種，防止其進入中國。原木類植物產(chǎn)品不同于種苗，沒有隔離程序，其所攜帶有害生物如果沒有經(jīng)過嚴格檢疫很容易擴散傳播，對此需要高度警惕。

本研究通過巢式PCR檢測、DNA序列測定確認了自德國進境原木夾帶水青岡枝葉攜帶櫟樹猝死病菌，但未分離獲得櫟樹猝死病菌菌株，在以往口岸截獲中也同樣沒有成功獲得分離株，表明櫟樹猝死病菌分離較為困難。櫟樹猝死病菌分離需要采用選擇性培養(yǎng)基，且培養(yǎng)溫度為20～22 ℃(國家認證認可監(jiān)督管理委員會，2008)，用PDA進行分離可能是未能成功獲得分離株的原因之一。進境歐洲原木需要跨海運輸耗時近一個月，進境原木中夾帶枝條上的葉片以及枝干均已經(jīng)干枯，這可能是分離獲得菌株以腐生菌為主的原因，也是未能獲得櫟樹猝死病菌分離株的原因之一。在今后口岸檢疫工作中，為提高檢測效率，可以直接取樣制片后在顯微鏡下檢查病菌繁殖結(jié)構(gòu)等是否存在，為后續(xù)檢測工作開展提供指引。

盡管本研究未能獲得分離株，但檢測發(fā)現(xiàn)樣品中有櫟樹猝死病菌，對陽性擴增產(chǎn)物的DNA測序結(jié)果證實了樣品中帶有櫟樹猝死病菌。巢式PCR方法具有非常高的靈敏度，由于操作過程中有一個取PCR產(chǎn)物進行二次擴增的步驟，在PCR管開蓋過程中會形成氣溶膠，非常容易污染，必須仔細操作并設(shè)置陽性、陰性和空白對照，以避免假陽性、假陰性的出現(xiàn)。同時，為確認檢測結(jié)果，建議對擴增產(chǎn)物進行雙向測序，DNA序列是各種基于其序列信息所設(shè)計檢測方法的根本依據(jù)，通過序列測定能夠從源頭確認檢測結(jié)果。現(xiàn)行櫟樹猝死病菌檢疫鑒定標準判定依據(jù)明確指出，如分離菌的形態(tài)特征或PCR產(chǎn)物與鑒定指標吻合，可鑒定為櫟樹猝死病菌(國家認證認可監(jiān)督管理委員會，2008)。因此,可以判定本次截獲病菌為櫟樹猝死病菌。Wongetal.(2020)建立了針對該病菌關(guān)鍵基因的分子診斷分析技術(shù)，通過分析mRNA與gDNA的比率來評估其活力，本次截獲櫟樹猝死病菌活性究竟如何，有待進一步研究。