黃連素對(duì)脊髓損傷大鼠BMP-4 mRNA表達(dá)及神經(jīng)元活性的影響

仲 華，華 祥，陳 輝

(1.邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院 骨二科，四川 邛崍 611530；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬大坪醫(yī)院 創(chuàng)傷科 ，重慶 400042)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是臨床中常見(jiàn)的疾病之一，其中，該病的主要發(fā)病原因?yàn)橥饬p傷，例如：車(chē)禍、打擊傷、墜落傷等[1]。近年來(lái)，SCI的發(fā)病率逐年上升，給患者本身帶來(lái)巨大的影響，同時(shí)，給社會(huì)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)是TGF-beita家族中的一員。近年來(lái)的研究表明BMP4與神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)有著密切的關(guān)聯(lián)[3]。研究人員通過(guò)免疫組化法發(fā)現(xiàn)在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、灰質(zhì)的神經(jīng)纖維、多巴胺能神經(jīng)元、去甲腎上腺素能神經(jīng)元中均觀察到BMP4表達(dá)，說(shuō)明BMP4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[4]。黃連素又名小檗堿屬于活性生物堿的一種,是從植物中提取的。研究表明，黃連素有抗菌、抗氧化等諸多的藥理作用，該藥物能夠?qū)εR床常見(jiàn)疾病有一定治療效果。既往研究表明，黃連素可減輕SCI小鼠脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這可能與其抑制線粒體氧化損傷，減少Cyt C釋放，降低凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)[5-6]。近年來(lái)，黃連素在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益被重視，但臨床中尚未見(jiàn)黃連素對(duì)脊髓損傷大鼠體內(nèi)BMP4表達(dá)水平影響的報(bào)道[7-8]。因此，本研究探究黃連素(BBR)對(duì)脊髓損傷大鼠HE病理、BMP-4 mRNA表達(dá)及神經(jīng)元活性的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 在廣東省醫(yī)學(xué)SD大鼠中心購(gòu)買(mǎi)30只雄性SD大鼠，體重224～292 g，鼠齡接近。將所購(gòu)買(mǎi)的大鼠隨機(jī)分為脊髓損傷組(S組)：該組大鼠制作脊髓損傷大鼠模型；健康對(duì)照組(H組)：該組大鼠在脊椎做切口后不做任何處理；黃連素組(B組)：該組大鼠制作脊髓損傷模型后給予黃連素，每組10只。

1.2 模型制備 采用脊髓鉗夾損傷建立模型，大鼠禁食12 h后，使用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，大鼠俯臥位固定于37℃恒溫板上。備皮后消毒鋪單，以T8～10棘突為中心做縱向切口，長(zhǎng)約3 cm。剝離皮下組織，暴露T8～10棘突及兩側(cè)椎板。剪開(kāi)T9～10的棘間韌帶和黃韌帶，咬除T9椎板，暴露T9平面脊髓。使用特制的平頭鑷(尖端為寬5 mm平面，中間有1.2 mm填充物，夾持后留有1.2 mm空隙)從兩邊加持脊髓，夾持時(shí)間為15 s。生理鹽水沖洗止血。造模完成后，維持大鼠正常生命，正常進(jìn)食、飲水，并按摩大鼠腹部，協(xié)助排尿、排便。同時(shí)，給予B組大鼠腹腔注射黃連素治療，每天1次，每次10 mg/kg，持續(xù)治療1周。在此期間，所有大鼠在相同環(huán)境下生活，并保持鼠籠清潔衛(wèi)生。

將3組大鼠分別斷頭處死，完整切取受損脊髓組織，以損傷點(diǎn)為中心切取脊髓1 cm 制成10 %脊髓勻漿，1 600 r/min離心20 min，棄上清液，取脊髓細(xì)胞為材料進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 儀器與試劑 黃連素(寧陜國(guó)圣生物科技公司，中國(guó))；熒光顯微鏡(上海萬(wàn)衡精密儀器公司，中國(guó))；蘇木精(寶雞市辰光生物公司，中國(guó))；DBA(上海晶抗生物工程公司，中國(guó))。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 流式細(xì)胞法 利用Annexin-V-FITC試劑盒對(duì)脊髓細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，選取1×106個(gè)細(xì)胞，震蕩，靜止15 min，將脊髓細(xì)胞以2×103個(gè)數(shù)量置于6孔板，1d后，在細(xì)胞內(nèi)加入少量胰蛋白酶，消化4 h后，用冷藏在-20 ℃的醫(yī)用酒精固定，靜置1 d后，離心，棄去上清液，PBS洗滌多次，每次3～5 min，避光染色，后采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡程度。

1.4.2 Tunel法 將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，使約為70 %～80 %滿(mǎn)。隨后嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL染色。加Vectashield Hard Set 封固涂片樣本，標(biāo)記反應(yīng)，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.4.3 HE染色法 取3組大鼠脊髓細(xì)胞，固定15 min，乙醇溶液脫水，石蠟包埋后切片4 μm，封閉處理應(yīng)用山羊血清進(jìn)行，蘇木精和伊紅染色液復(fù)染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察3組大鼠脊髓細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變情況。

1.4.4 免疫組化法 將脊髓細(xì)胞脫蠟及水化，并進(jìn)行烤片處理，將熱玻片放入二甲苯中處理2次，每次10分鐘，無(wú)水乙醇2次，每次10分鐘，用H2O2阻斷20 min，PBS沖洗3次，將玻片置于0.01M 枸椽酸中修復(fù)液,微波修復(fù)2次,1次5 min，冷卻后，PBS沖洗3次，將非免疫血清滴加于玻片上置37 ℃恒溫箱孵育30 min,抹干切片后,滴加特異性抗體，恒溫箱孵育20 min,在放入冰箱過(guò)夜，滴加標(biāo)記的二抗,恒溫箱孵育,PBS沖洗3次，每張玻片上滴加鏈親和素抗生物素過(guò)氧化物酶溶液，配置DAB液體，滴加到切片上，直到染色滿(mǎn)意后為止，染色后用自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染,脫水烘干后用中性樹(shù)膠封,光鏡下觀察切片染色情況并攝影，觀察BMP-4蛋白表達(dá)情況。

1.4.5 qRT-PCR法 按200 μL氯仿/mL Trigol加入氯仿配置氯仿/Trigol試劑，加入6孔板中振蕩混勻，室溫放置15 min，隨后轉(zhuǎn)入EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清水相至另一離心管內(nèi)，加入吸上清量的0.7～1倍體積的異丙醇，室溫放置10～30 min，12 000 r/min離心10 min,棄上清，RNA沉于管底，按1 mL 75%乙醇/mL Trigol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min,盡量棄上清超凈臺(tái)吹干10～20 min，加10～50 μL DEPC(焦炭酸二乙酯)處理過(guò)的ddH2O溶沉淀，使用one Drop微量分光光度儀測(cè)定濃度。按照RNase free dH2O 4.5μL、5×RT反應(yīng)緩沖液 2 μL、Randam primer 0.5 μL、Oligo dT 0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL、RNA 2 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將cDNA樣品分成3份，每組總cDNA樣本稀釋20倍，取3 μL的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。使用5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證靶基因的擴(kuò)增水平。使用LabWorks 4.0圖像采集和分析軟件進(jìn)行定量和數(shù)據(jù)處理。為獲得可靠的數(shù)據(jù)，每組樣本重復(fù)3次。在本次研究中應(yīng)用2-ΔΔCt法分析、目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)含量變化。本次研究中使用的引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行結(jié)果整理，S、B、H組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況、BMP-4 mRNA的表達(dá)含量、BMP-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況、細(xì)胞病變程度的差異性先采用單因素方差分析，若方差分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再采用LSD-t進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S、B、H組大鼠脊髓中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量比較 結(jié)果顯示，H組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量最少，S組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡最多，S組與B組相比較，S組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著多于B組(P<0.05)，B組與H組相比較，B組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著多于H組(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況(×200)

2.2 S、B、H組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率 結(jié)果顯示，S、B、H組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率為(37.36±5.38)%、(28.09±3.75)%、(28.09±3.75)%。S組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量最多，H組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量最少，B組與S組相比較，B組神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況顯著減少(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較

2.3 S、B、H組大鼠脊髓細(xì)胞病變程度 H組大鼠脊髓細(xì)胞正常，未見(jiàn)明顯變化，無(wú)膠質(zhì)細(xì)胞增生，S組大鼠脊髓細(xì)胞出現(xiàn)明顯異常，灰白質(zhì)內(nèi)有大量出血，有輕度水腫現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)疏松化，胞元壞死數(shù)目大量增加，與S組比較，B組大鼠脊髓水腫減輕，損傷程度有好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，細(xì)胞壞死數(shù)目有減少(見(jiàn)圖3)。

A:H 組;B:S 組;C:B 組。圖3 脊髓細(xì)胞病變程度(×400)

2.4 S、B、H組大鼠脊髓細(xì)胞中BMP-4蛋白陽(yáng)性表達(dá) 由圖可知，S組脊髓細(xì)胞中BMP-4陽(yáng)性數(shù)最多，H組脊髓細(xì)胞中BMP-4陽(yáng)性數(shù)最少，與S組相比較，B組脊髓細(xì)胞中BMP-4陽(yáng)性數(shù)顯著降低(P<0.05)。與B相比較，H組細(xì)胞BMP-4陽(yáng)性數(shù)顯著下降(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

A:H 組;B:S 組;C:B 組。圖4 BMP-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)(×200)

2.5 S、B、H組大鼠脊髓細(xì)胞中BMP-4、BMP-2 mRNA的表達(dá)含量比較 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，S、B、H組脊髓細(xì)胞中BMP-4 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.14、0.67±0.09、0.32±0.07，S、B、H組脊髓細(xì)胞中BMP-2 mRNA表達(dá)量分別為0.37±0.08、0.69±0.10、0.89±0.12，H組脊髓細(xì)胞內(nèi)的BMP-4 mRNA表達(dá)量最低，BMP-2 mRNA表達(dá)量最高，S組脊髓細(xì)胞內(nèi)的BMP-4 mRNA表達(dá)量最高，BMP-2 mRNA表達(dá)量最低，B組與S組相比較，B組大鼠BMP-4 mRNA表達(dá)含量顯著降低，BMP-2 mRNA表達(dá)量顯著上升(P均<0.05)，H組與B組相比較，H組BMP-4 mRNA表達(dá)含量顯著降低，BMP-2 mRNA表達(dá)量顯著上升(P均<0.05，見(jiàn)圖5)。

圖5 BMP-4、BMP-2 mRNA表達(dá)量

3 討論

脊髓損傷為臨床中脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，SCI發(fā)病原因有多種，可能是暴力外傷引起的，如：暴力壓迫、撕裂等，也可能是機(jī)體出現(xiàn)異常變化或疾病而引起的[7-8]。SCI的臨床表現(xiàn)為脊髓震蕩、休克等[9]。脊髓受傷部位不同，所造成的傷害也不近相同，例如：若第一、二脊髓出現(xiàn)損傷，則受傷患者多數(shù)立即死亡，救治希望渺茫[10]。SCI對(duì)機(jī)體造成危害較大，預(yù)后差，因此發(fā)病時(shí)的早期治療在整個(gè)治療過(guò)程中占重要地位，可通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)救護(hù)、急診救治等專(zhuān)業(yè)操作來(lái)為患者提供救治。臨床中，常采用皮質(zhì)類(lèi)固醇、神經(jīng)節(jié)苷脂等藥物治療SCI[8，11]。

黃連素是一種重要的生物堿，是我國(guó)應(yīng)用很久的中藥?？蓮狞S連、黃柏、三顆針等植物中提取[12]。它具有顯著的抑菌作用。黃連素能對(duì)抗病原微生物，對(duì)多種細(xì)菌如結(jié)核桿菌、肺炎球菌等都有抑制作用[13]。黃連素是臨床的常用藥物之一,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，黃連素在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有一定的效果，例如：AD、癲癇及缺血性腦血管病等，猜測(cè)其作用機(jī)制可能與其抗炎、抗氧化的藥理作用有關(guān)[14-15]。黃連素具有顯著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低膽固醇、抑制血管平滑肌增殖、改善胰島素抵抗、抗血小板、抗炎等作用，因而在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面將可能有廣泛、重要的應(yīng)用前景，日益受到重視[16]。本研究結(jié)果表明S組脊髓細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著多于B組，B組脊髓細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著多于H組。與S組比較，B組大鼠脊髓水腫減輕，損傷程度有好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，細(xì)胞壞死數(shù)目有減少。表明黃連素能夠治療脊髓損傷大鼠，改善大鼠脊髓細(xì)胞的病變程度，緩解大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡速率，提高大鼠的神經(jīng)功能。文獻(xiàn)報(bào)道，黃連素可以保護(hù)血腦屏障的完整性,減少炎癥細(xì)胞滲透入腦內(nèi)，也可通過(guò)直接抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少炎癥細(xì)胞因子的分泌，這兩種途徑可能都參與了黃連素治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[18]，在脊髓損傷大鼠體內(nèi)檢測(cè)到神經(jīng)元細(xì)胞增殖的活性顯著降低，由此猜想，脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展可能通過(guò)神經(jīng)元細(xì)胞的活性來(lái)展現(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃連素作用于患病大鼠時(shí)，大鼠體內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞的活性隨之上升，且隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能、神經(jīng)功能等評(píng)分都有顯著上升，表明黃連素對(duì)脊髓損傷大鼠有一定的治療效果[19]。大量研究表明[20]，黃連素能夠抑制脊髓神經(jīng)損傷大鼠的脊髓細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脊髓細(xì)胞增殖，顯著改善脊髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。研究人員[21]給予脊髓損傷大鼠黃連素進(jìn)行治療后，試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素可以上調(diào)大鼠脊髓損傷組織的自噬活性，降低損傷部位細(xì)胞的死亡率，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素是通過(guò)降低Caspase-3的表達(dá)水平進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[22]，黃連素在SCI小鼠脊髓組織的康復(fù)過(guò)程中占重要地位，黃連素能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的速率，促進(jìn)其再生功能，黃連素這一作用機(jī)制可能與其抑制線粒體氧化損傷，降低凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。黃連素與脊髓損傷的關(guān)系為脊髓損傷的診斷和治療發(fā)展提供新的科研方向。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是一類(lèi)TGF-β超家族蛋白，不僅參與胚胎時(shí)期骨組織的發(fā)育，對(duì)成年骨缺損修復(fù)及機(jī)體某些骨疾患的發(fā)生過(guò)程均有重要意義，而且在脂肪、腎臟、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起一定作用[23]。目前已有研究表明，BMPs 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同時(shí)期、不同部位，均起著相當(dāng)重要的作用，且對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用相當(dāng)復(fù)雜。因BMP-2與BMP-4結(jié)構(gòu)相似，屬于同一個(gè)亞型，與相同的受體結(jié)合。在胚胎早期，BMP-2與BMP-4協(xié)同作用促使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)[24-25]，通過(guò)將標(biāo)記的BMP4移植治療大腦中動(dòng)脈閉塞的卒中小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)梗塞面積明顯縮小，說(shuō)明BMP4具有神經(jīng)保護(hù)功能。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與S組相比較，B組大鼠BMP-4 mRNA表達(dá)含量顯著降低，BMP-2 mRNA表達(dá)量顯著上升，與B組相比較，H組BMP-4 mRNA表達(dá)含量顯著降低，BMP-2 mRNA表達(dá)量顯著上升。試驗(yàn)研究結(jié)果表明[26]，在正常大鼠脊髓中BMP4 mRNA的表達(dá)水平與脊髓損傷大鼠脊髓中BMP4 mRNA的表達(dá)水平存在顯著差異，其中，后者BMP4 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，表明BMP4在脊髓損傷的過(guò)程中占重要地位。報(bào)道表明[27-28]，下調(diào)BMP4的表達(dá)能夠促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)樹(shù)突的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，推測(cè)BMP4在脊髓損傷的早期起到了保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[29-30]，成年SD大鼠脊髓損傷原代培養(yǎng)的細(xì)胞中BMP2的表達(dá)水平顯著低于健康大鼠脊髓細(xì)胞中BMP2的表達(dá)水平，同時(shí)在給予相應(yīng)治療后的脊髓損傷大鼠脊髓細(xì)胞中BMP2的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，表明BMP2可刺激反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，同時(shí)在脊髓細(xì)胞的恢復(fù)過(guò)程中起重要作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述結(jié)論相符。本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間、成本等問(wèn)題，對(duì)大鼠的研究?jī)H選取治療后1周這一個(gè)時(shí)間段，在今后的研究中，應(yīng)添加多個(gè)時(shí)間段進(jìn)行對(duì)比研究。

綜上所述，黃連素(BBR)對(duì)脊髓損傷大鼠具有一定治療作用，BBR干預(yù)后能夠顯著減少大鼠脊髓細(xì)胞的凋亡數(shù)量，降低凋亡率，同時(shí)，改善大鼠脊髓細(xì)胞的病理形態(tài)，促進(jìn)康復(fù)，BBR對(duì)脊髓損傷大鼠的作用機(jī)制可能與下調(diào)脊髓細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)的表達(dá)有關(guān)。