電針百會、神庭對系統炎癥誘導認知功能障礙的海馬抗炎作用

陳小梅，龐莉娜，王志福

1 福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建福州 350122；2 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建福州350122

膿毒癥相關腦?。╯epsis-associated encephalopathy，SAE）是當機體出現嚴重的全身性感染時，發(fā)生彌漫性腦功能障礙，可出現譫妄、意識不清，甚至是昏迷，是臨床膿毒癥后的一種嚴重的神經后遺癥，SAE 增加了膿毒癥患者的死亡率，高達70%［1］；其可能的機制包括血管損傷和神經炎癥，其中神經炎癥是關鍵的驅動因素，大量的小膠質細胞激活在這一過程扮演核心角色［2-3］。小膠質細胞是中樞神經系統的常駐巨噬細胞，監(jiān)測腦內微環(huán)境并對其變化迅速做出反應［4］。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌外膜的關鍵成分，可引起血漿和海馬炎癥因子增多，小膠質細胞激活發(fā)生神經炎癥反應，已廣泛應用于膿毒癥的相關研究［5-6］。已有研究證實細胞因子，特別是腫瘤壞死因子（TNF-α）在LPS注射后1～3 h內迅速產生，并通過受損的血腦屏障傳遞信號，腦內的TNF-α 增加可激活海馬小膠質細胞調節(jié)神經元功能，引起海馬形態(tài)和功能發(fā)生改變，出現急性認知功能損傷［3，7-11］。

早期治療膿毒癥病人是預防腦損傷及隨后出現的認知功能障礙的關鍵。已有研究證明，電針具有明顯的全身抗炎作用［12-14］，電針百會、神庭減輕神經炎癥及改善認知功能效果明確［15-17］。因此本研究擬探討電針百會、神庭是否通過下調系統炎癥、改善海馬區(qū)神經炎癥，從而減輕內毒素性腦損傷，改善認知功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康清潔級成年C57BL/6 雄性小鼠45 只，體質量18～22 g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，經福建中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。于自然晝夜交替和22～25 ℃室溫下飼養(yǎng)，自由進食水。適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數字表法分為對照組、內毒素性腦損傷組（簡稱模型組）和內毒素性腦損傷＋電針組（簡稱電針組），每組各15只。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷（深圳瑞沃德公司），戊巴比妥鈉（深圳瑞沃德公司），0.5 寸毫針（華佗牌30 號），HANS-200E 穴位神經刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），脂多糖內毒素（貨號：L2630，Sigma公司，美國），4%多聚甲醛，Iba-1 一抗（貨號：ab5076，Abcam），生物素標記物二抗（貨號：ab150129，Abcam），TNF-α ELISA 試劑盒（貨號：MM-0132M2，福州沃森生物有限公司），Iba-1 ELISA 試劑盒（貨號：MM-44902M2，福州沃森生物有限公司），新物體識別實驗裝置及動態(tài)圖像采集分析系統（XR-XX117，福建中醫(yī)藥大學康復產業(yè)研究院），冰凍切片機（Thermo Scientific HM525 NX，福建中醫(yī)藥大學康復產業(yè)研究院）。

1.3 動物模型制備

模型組和電針組腹腔注射LPS（貨號：L2630，Sigma 公司，美國）1 mg/kg，建立內毒素性腦損傷；對照組給予同容量的溶劑。

1.4 干預方法

電針組進行電針刺激，電針的穴位選取百會（頂骨正中，兩耳連線中點）、神庭（前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處）（參考《實驗針灸學》中的定位方法）；將無菌針灸針（直徑0.3 mm，長13 mm，華佗牌針灸針）平刺入穴位1 mm，通過連接HANS-200E 穴位神經刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），給予10 Hz 連續(xù)波，刺激強度為0.5 mA，于造模前15 min及行為學測試前各電針1次。對照組在同等條件下抓取后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療。模型組不干預。

1.5 www（what-where-when）行為學測試

根據行為學參考文獻［18］，分為適應期和測試期，將小鼠置于1 個60 cm×60 cm×40 cm 的屏敝箱中，適應后進行正式測試期，任務分為3 個5 min 階段，每個階段試驗間隔時間為50～55 min。第1 個階段為4個相同的A以三角形呈現的物體；第2個階段為4個相同的B排列成1個正方形；最后測試階段使用新的物體排列方式，將“B”物體（Recent B）仍然在角落處；1 個“A”物體（稱為Stationary A）停留在1個角落，而第2個A 物體（稱為Displaced A）則被放置在另一個角落。視頻由安裝在測試區(qū)域上方的攝像機錄制，采用三點動態(tài)跟蹤法記錄與每個物體接觸的時間。測試階段的位置偏好被計算為“what”“where”“when”，計算公式為：

1.6 免疫組織化學染色

行為學試驗結束后，立即腹腔注射麻醉，先用30 mL 的生理鹽水灌注，再用30 mL 4%的多聚甲醛灌注后取腦；取出后將腦浸泡在4%的多聚甲醛內，4 ℃過夜，再換30%的蔗糖進行脫水，沉底后立即在恒冷凍切片機內進行包埋切片，厚度為10 μm，將切好的組織片貼附在載玻片上；用PBS 洗3 次，每次5 min，擦凈切片組織周圍的水分（保持組織呈濕潤狀態(tài)），滴加封閉液（按試劑盒規(guī)定的濃度配制），置于37 ℃箱1 h；后用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加山羊抗小鼠Iba-1 一抗（1∶200），濕盒4 ℃過夜；次日，用PBS 洗3 次，每次5 min，滴加生物素標記驢抗山羊二抗（1∶200），37 ℃箱1 h；用PBS 洗3 次，每次5 min，擦去組織周圍的水分后，滴含DAPI 的封片劑，蓋上載玻片后，顯影拍片。

1.7 酶聯免疫吸附試驗

LPS 注射后3 h各組采血，并行為學測試后各組取海馬組織勻漿離心，取上清液；用ELISA試劑盒測試血漿TNF-α、海馬Iba-1 和TNF-α 含量變化。操作方法：48 孔酶標孔加樣，每孔加入標準品或待測樣品各100 μL，將反應板充分混勻后置37 ℃40 min；用洗滌液將反應板充分洗滌4～6 次，濾紙印干；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外），將反應板充分混勻后置于37 ℃20 min；用洗滌液將反應板充分洗滌4～6 次，濾紙印干；每孔加酶標抗體工作液100 μL，將反應板置37 ℃10 min，再次洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗處反應15 min；每孔加入100 μL 終止液混勻，30 min內于酶標儀450 μm 波長測吸光值，繪制標準曲線，并根據樣品A值計算相應TNF-α 和Iba-1含量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 23.00 軟件進行統計分析，結果均服從正態(tài)分布，數據用（）表示。采用方差分析進行多組間比較，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針百會、神庭可提高LPS誘導認知功能障礙小鼠的學習記憶能力

LPS 注射后24 h 行為學結果顯示，模型組與對照組比較，“what”“when”和“where”3 種記憶出現顯著下降（P＜0.01）；電針組與模型組比較，“what”和“when”2 種記憶明顯改善（P＜0.01），結果采用單因素方差分析，差異均具有統計學意義。見圖1。

圖1 3組what-where-when行為學測試結果比較（）Figure 1 Comparison of exploring time on what-wherewhen behavior()

2.2 3組小鼠血漿TNF-α水平比較

與對照組比較，模型組小鼠血漿的TNF-α 水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組小鼠血漿的TNF-α 水平明顯下降（P＜0.01），結果采用單因素方差分析，差異均具有統計學意義。見圖2。

圖2 3組小鼠血漿TNF-α水平比較（）Figure 2 Comparison of plasma levels of TNF-α in mice()

2.3 3組海馬TNF-α水平比較

與對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)的TNF-α 水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組小鼠海馬區(qū)的TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05），結果采用單因素方差分析，差異均具有統計學意義。見圖3。

圖3 3組海馬TNF-α水平比較（）Figure 3 Comparison of hippocampal levels of TNF-α in mice()

2.4 3 組海馬區(qū)小膠質細胞活化狀態(tài)及標志物Iba-1的表達比較

免疫熒光200 倍鏡下結果顯示，模型組相較于對照組，海馬區(qū)小膠質細胞活化標志物Iba-1 表達顯著增多，小膠質細胞活化后形態(tài)及數量改變明顯；而電針組與模型組比較，海馬區(qū)小膠質細胞活化數量顯著減少。見圖4。同樣，ELISA結果也顯示，模型組小鼠的海馬區(qū)小膠質細胞活化標志物Iba-1表達顯著增多（P＜0.01），而電針組與模型組比較，海馬區(qū)小膠質細胞活化標志物Iba-1 表達明顯減少（P＜0.05）。見圖5。

圖4 3組海馬區(qū)小膠質細胞活化標志物Iba-1的表達比較（×200）Figure 4 Comparison of expression of Iba-1 in the hippocampal region of three groups(×200)

圖5 3組海馬Iba-1水平比較（）Figure 5 Comparison of hippocampal levels of Iba-1 in mice of three groups()

3 討論

膿毒癥腦病主要是由系統性炎癥引起的神經炎癥，從而造成腦損傷，主要表現為認知功能下降等。海馬屬于邊緣系統的重要組成成分之一，參與高級認知功能，尤其是對學習和記憶能力的儲存［8］，what-where-when 行為學測試是觀察小鼠對新物體的探索能力、位置辨別能力以及時序的記憶力［19］。已有研究顯示，LPS誘導全身炎癥后，腦內小膠質細胞被迅速激活，小膠質細胞是腦內的常駐巨噬細胞，可造成腦內神經元的變性與死亡［20-21］。因此抑制小膠質細胞炎癥反應，減少全身及腦內的炎癥水平是減輕膿毒癥腦病引起認知功能下降的關鍵。有研究證明，電針百會、神庭可控制炎癥水平，改善認知功能［17，22-23］。

本研究結果顯示，LPS注射后3 h，外周血TNF-α水平顯著上升，而電針可明顯降低其炎癥發(fā)展，發(fā)揮全身抗炎作用。LPS注射后24 h，模型組對新物體的探索及時序的記憶明顯受損，電針組可顯著改善記憶功能。免疫熒光及ELISA 結果發(fā)現，海馬區(qū)小膠質細胞活化標志物Iba-1 及TNF-α 表達明顯增多，小膠質細胞異常增生，而電針組相較于模型組Iba-1、TNF-α表達降低，可抑制小膠質細胞異常增生。

因此，電針百會、神庭可以顯著改善膿毒癥腦病小鼠的新物體識別和時序記憶能力，并可減輕全身炎癥水平，減少海馬區(qū)小膠質細胞的活化，改善海馬區(qū)的神經炎癥反應，其作用可能通過抑制海馬區(qū)小膠質細胞活化，降低外周血及海馬區(qū)炎癥因子TNF-α 釋放，從而改善系統性炎癥及其誘導的學習記憶能力下降。