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    牛大力塊根糖積累及其相關(guān)酶活性變化研究

    2021-12-18 12:34:35姚紹嫦黃鼎譚勇顧晉源李良波黃榮韶
    廣西植物 2021年11期
    關(guān)鍵詞:酶活性

    姚紹嫦 黃鼎 譚勇 顧晉源 李良波 黃榮韶

    摘 要:? 為提高牛大力塊根的產(chǎn)量與品質(zhì),該研究以不同發(fā)育時(shí)期(移栽6、12、18、24、30、36個(gè)月)的牛大力塊根為材料,采用紫外分光光度法對(duì)糖類含量及其相關(guān)酶活性進(jìn)行測(cè)定,研究它們?cè)谂4罅K根發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果表明:(1)牛大力塊根的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程可初步劃分為形成期(移栽6~12個(gè)月)、迅速膨大期(移栽12~24個(gè)月)與穩(wěn)定膨大期(移栽24~36個(gè)月)三個(gè)階段。淀粉與蔗糖分別是牛大力塊根中主要的多糖與可溶性糖。在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中,多糖類物質(zhì)的含量逐漸增加,而可溶性糖含量逐漸減少,兩者之間呈顯著負(fù)相關(guān),推測(cè)可溶性糖的分解代謝有利于促進(jìn)多糖類物質(zhì)的積累。(2)蔗糖的分解代謝是蔗糖合酶(SUS)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)與中性轉(zhuǎn)化酶(NI)等多種相關(guān)酶協(xié)同作用的結(jié)果。SUS在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著既催化蔗糖合成,又催化蔗糖分解的雙重調(diào)節(jié)作用,SUS(合成)的活性不斷上升,至移栽36個(gè)月達(dá)到峰值,極顯著高于其他時(shí)期;SUS(分解)的活性從移栽6個(gè)月至24個(gè)月逐漸上升,但在塊根穩(wěn)定膨大期稍有下降;其凈活性為催化蔗糖分解,在移栽12個(gè)月達(dá)到最高。轉(zhuǎn)化酶AI和NI的活性均在塊根發(fā)育過(guò)程中逐漸上升,且AI活性高于NI活性,提示AI可能在蔗糖代謝分解過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用。該研究結(jié)果可為今后深入研究牛大力多糖類成分積累和調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù),并為提高牛大力藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)提供技術(shù)指導(dǎo)。

    關(guān)鍵詞: 牛大力, 塊根發(fā)育, 糖積累, 蔗糖代謝, 酶活性

    中圖分類號(hào):? Q945

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:? A

    文章編號(hào):? 1000-3142(2021)11-1939-10

    Sugar accumulation and sucrose-metabolizing enzyme activities in tuberous roots of Callerya speciosa

    YAO Shaochang1,2, HUANG Ding1,2, TAN Yong1,2, GU Jinyuan1, LI Liangbo1, HUANG Rongshao1*

    ( 1. College of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China; 2. Key Laboratory of Zhuang Yao Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China )

    Abstract:? In order to? improve the yield and quality of Callerya speciosa, the dynamic variation rules of sugar accumulation and sucrose-metabolizing enzyme activities in tuberous roots at six different developmental stages (6, 12, 18, 24, 30, 36 months after transplanting) of C. speciosa were discussed using UV spectrophotometry methods. The results were as follows: (1) The root development can be preliminarily divided into three stages: the initial stage (from 6 to 12 months after transplanting), the rapid thickening stage (from 12 to 24 months after transplanting), and the stable thickening stage (from 24 to 36 months after transplanting). Starch and sugar were the main form of polysaccharides and soluble sugars in tuberous roots, respectively. The content of polysaccharides increased, whereas that of soluble sugars decreased during the tuberous root development. There was significantly negative correlation between polysaccharides and soluble sugars, suggesting that the decomposing of soluble sugars might facilitate to the accumulation of polysaccharides. (2) Several sucrose-metabolizing enzymes, such as sucrose synthase (SUS), sucrose phosphate synthase (SPS), acid invertase (AI) and neutral invertase (NI), played synergistic effects on metabolizing sucrose. SUS played a dual role in both synthesizing and decomposing of sucrose during the tuberous root development of C. speciosa. The activity of SUS (synthesizing) significantly increased along with root growth, peaked at 36 months after transplanting, whereas that of SUS (decomposing) increased from 6 months to 24 months after transplanting but decreased slightly at the stable thickening stage; the total activity of SUS played a role in the decomposing of sucrose and peaked at 12 months after transplanting. The activities of AI and NI increased consistently during the tuberous root development of C. speciosa. Moreover, the activity of AI was much higher than that of NI, indicating that AI might be more important in the decomposing of sucrose. These results provide a theoretical basis for the further study of regulation mechanism of polysaccharides accumulation, and provide technical guidance for the improvement of yield and quality in C. speciosa tuberous roots.

    Key words: Callerya speciosa, tuberous root development, sugar accumulation, sucrose-metabolizing, enzyme activities

    糖類物質(zhì)的積累是藥材產(chǎn)量與品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素,蔗糖代謝是各種蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝、初生與次生代謝等代謝活動(dòng)的橋梁,在整個(gè)生物體的代謝過(guò)程中具有舉足輕重的作用(郝建軍等,2013)。在植物體內(nèi),與蔗糖合成代謝相關(guān)的酶主要有蔗糖合酶(sucrose synthase, SUS)、蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)與蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase, INV),其中SUS(合成)方向與SPS主要負(fù)責(zé)蔗糖的合成,而SUS(分解)方向與INV則是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶。蔗糖合酶能參加將蔗糖分解生成二磷酸尿苷(uridine diphosphate glucose, UDPG)-葡萄糖與果糖的可逆反應(yīng),可為多糖、細(xì)胞壁與淀粉合成提供前體與底物,從而調(diào)控蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑(Stein & Granot, 2019)。蔗糖轉(zhuǎn)化酶也能將蔗糖分解為果糖和葡萄糖,根據(jù)轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)所需的pH不同可分為酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase, AI)與中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase, NI)兩種類型(于安民等,2014)。

    牛大力來(lái)源于豆科雞血藤屬美麗雞血藤(Callerya speciosa),又名美麗崖豆藤、山蓮藕(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì),2010),是《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990 年版)、《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(第一卷)收載的廣西道地藥材與標(biāo)志性壯藥材,也是嶺南地區(qū)著名的藥食兩用植物(姚紹嫦等,2020)。牛大力根氣味甘香、性溫和,藥性甘、平,歸肺、腎經(jīng),具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)之功效,可治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺虛咳嗽等病癥(韋玉燕等,2010;伍月榕等,2020)。牛大力的主要成分是多糖及黃酮類化合物,其中多糖屬于水溶性多糖,主要由鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等組成,以葡萄糖與半乳糖為主(馮夢(mèng)瑩,2015)。牛大力多糖是藥材甘甜味的重要來(lái)源,被認(rèn)為是牛大力藥材品質(zhì)的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo),具有降糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞等作用,并且具有一定的抗氧化能力和清除自由基能力(鄭元升等,2008;羅軒等,2014; Huang et al., 2020)。

    目前,在牛大力人工栽培中出現(xiàn)膨大根(塊根)和不膨大根(纖維根)兩種不同類型的根,研究發(fā)現(xiàn)膨大根的多糖含量約為不膨大根的3倍(朱德華等,2018)。在牛大力塊根膨大的過(guò)程中,牛大力多糖的含量會(huì)隨著其生長(zhǎng)年限的增加而升高(鐘益寧等,2020)。多糖的生物合成已被證明與蔗糖代謝酶活性存在密切的相關(guān)性。楊駿等(2020)通過(guò)對(duì)F 型及H 型鐵皮石斛不同時(shí)期多糖含量與蔗糖代謝酶活性的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)多糖的含量伴隨著蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的升高而積累,而蔗糖合酶與蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性呈顯著正相關(guān)?;羯绞嗵呛恳脖蛔C明與蔗糖轉(zhuǎn)化酶及蔗糖合酶活性相關(guān)(Wei et al., 2007;王博等,2009)。然而,目前對(duì)于牛大力塊根糖類物質(zhì)積累與蔗糖代謝酶活性之間的相關(guān)性未見(jiàn)研究報(bào)道。因此,本研究以道地產(chǎn)區(qū)的牛大力為材料,分析牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中的淀粉、多糖、可溶性糖與蔗糖等含量的動(dòng)態(tài)變化,研究催化蔗糖合成、代謝的相關(guān)酶在塊根糖類物質(zhì)積累中發(fā)揮的作用,并探討它們的相關(guān)性,研究結(jié)果可為今后深入研究牛大力多糖類成分積累調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù),并為提高牛大力藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    牛大力來(lái)源于廣西藥用植物園科研基地,經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院方鼎研究員鑒定為豆科雞血藤屬美麗雞血藤(Callerya speciosa)。將牛大力種子置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)于(26±2)℃條件下進(jìn)行催芽,待種子露白后將種子播種至溫室大棚的沙床中育苗。待幼苗長(zhǎng)至三片真葉時(shí),將幼苗移栽至種植盆中,栽培管理?xiàng)l件一致。移栽后,每隔半年取樣1次,從2017年6月15日至2019年12月15日,共取樣6次,每次隨機(jī)選取10株進(jìn)行取樣。取樣時(shí)先將植株整株挖起,清洗干凈根系,從中選擇有代表性的根,切取中部同一部位長(zhǎng)度為10 cm作為樣品,從樣品中切取長(zhǎng)度為2 cm的根,切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊,將10株植株的樣品充分混合后立即放入液氮中,帶回實(shí)驗(yàn)室,放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?剩下的樣品(8 cm)用于塊根生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。

    1.2 方法

    1.2.1 牛大力的塊根生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 利用排水法測(cè)量牛大力塊根的體積。利用電子天平稱量塊根的鮮重,之后將塊根置于80 ℃恒溫烘箱烘干至恒重后稱量其干重,計(jì)算折干率,計(jì)算公式如下。

    折干率(%)=干重/鮮重×100。

    1.2.2 可溶性糖含量測(cè)定方法 參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》的方法(上海植物生理學(xué)會(huì),1985),稍有修改。采用蒽酮比色法測(cè)定,稱取烘干樣品0.2 g,加入80%乙醇7.0 mL勻漿,轉(zhuǎn)移至10.0 mL離心管中,80 ℃水浴30 min,4 000 r·min-1離心10 min,收集上清液。重復(fù)提取兩次(每次10 min),合并3次上清液至50.0 mL容量瓶,用80%乙醇定容。取上清液1.0 mL于10.0 mL試管中,依次加入蒸餾水1.5 mL與6.5 mL蒽酮試劑,混勻后放置15 min,在620 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí),取20~100 μg葡萄糖用相同方法測(cè)定吸光度,做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)此計(jì)算樣品中的可溶性糖含量。計(jì)算公式如下。

    可溶性糖含量(%)=C×(V/a)/(W×106)×100。

    式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的葡萄糖量(μg);V為樣品提取液體積(mL);a為顯色時(shí)取樣品體積(mL);W為樣品重量(g)。

    1.2.3 淀粉含量測(cè)定方法 參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》的方法(高俊鳳,2006),稍有修改。用蒸餾水將上述的可溶性糖含量測(cè)定提取的殘?jiān)D(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中,沸水浴15 min,冷卻后加入9.2 mol·L-1高氯酸2.0 mL,沸水浴15 min,加蒸餾水4.0 mL,4 000 r·min-1離心10 min,收集上清液。重復(fù)提取殘?jiān)鼉纱危看?0 min),合并3次上清液于50.0 mL容量瓶,用蒸餾水定容。取上清液0.2 mL稀釋10倍后,加入蒽酮試劑5.0 mL,沸水浴10 min,冷卻后在620 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算淀粉含量。計(jì)算公式如下。

    淀粉含量(%)=C×(V/a)×0.9/(W×106)×100。

    式中:0.9為由葡萄糖換算為淀粉的系數(shù);C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的葡萄糖量(μg);V為樣品提取液體積(mL);a為顯色時(shí)取樣品體積(mL);W為樣品重量(g)。

    1.2.4 蔗糖含量測(cè)定方法 參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》的方法(上海植物生理學(xué)會(huì),1985),稍有修改。采用蒽酮比色法進(jìn)行測(cè)定。稱取0.2 g 烘干樣品,研碎,加入80%乙醇溶液6.0 mL,轉(zhuǎn)移到離心管中,置于80 ℃水浴中30 min,振蕩3~5次,冷卻后,4 000 r·min-1離心10 min,收集上清液。重復(fù)提取殘?jiān)鼉纱危看?0 min),合并3次上清液于50 mL容量瓶,用80%乙醇定容。吸取1.0 mL提取液于試管中,加入30% KOH溶液0.1 mL,沸水浴10 min,冷卻至室溫。加入蒽酮試劑5.0 mL,混勻后40 ℃保溫12 min,于620 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。同時(shí),取20~100 μg蔗糖于一系列試管中,加入0.1 mL 30% KOH以相同方法顯色,做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)此計(jì)算樣品中的蔗糖含量。

    蔗糖含量(%)=C×(V/a)/(W×106)×100。

    式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的蔗糖量(μg);V為樣品提取液體積(mL);a為顯色時(shí)取樣品體積(mL);W為樣品重量(g)。

    1.2.5 多糖含量測(cè)定方法 多糖提取與測(cè)定的方法參考朱德華等(2018)的方法,使用苯酚-硫酸法檢測(cè)牛大力多糖的含量。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=12.62x-0.007,r2=0.998(n=5)。于490 nm測(cè)定樣品的吸光度值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出牛大力多糖含量。

    1.2.6 酶活性的測(cè)定方法 參照謝小波等(2013)的方法并進(jìn)行改進(jìn),將牛大力新鮮樣品在液氮中研磨至粉末,準(zhǔn)確稱取0.3 g,加提取緩沖液1.5 mL,渦旋混勻,冰上放置5 min,于4 ℃ 5 000 r·min-1條件下離心15 min,取上清液,即為粗酶液,用于下一步的酶活性測(cè)定。參照于安民等(2014)的方法(紫外分光光度法)測(cè)定與計(jì)算SUS、SPS、AI和NI的酶活性。利用測(cè)定組和對(duì)照組吸光度的差值,并結(jié)合不同濃度下葡萄糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算分解方向的酶活性(包括AI、NI和SUS分解方向)的葡萄糖合成量。利用測(cè)定組和對(duì)照組吸光度的差值,并結(jié)合不同濃度下蔗糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算合成方向的酶活性(包括SPS與SUS合成方向)的蔗糖合成量。根據(jù)各自的葡萄糖合成量或蔗糖合成量來(lái)計(jì)算相應(yīng)的酶活性,酶活性單位為μmol·g-1·h-1 FW。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用Excel 與SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVE),Duncan 法進(jìn)行多重比較。分析結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 牛大力的塊根生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程

    從圖1可以看出,移栽6個(gè)月的牛大力根部尚未出現(xiàn)明顯的膨大現(xiàn)象,而移栽12個(gè)月的牛大力已明顯觀察到根部的膨大。移栽12個(gè)月至24個(gè)月,牛大力塊根的膨大速率較快,體積從3.12 cm3增加到33.52 cm3,顯著高于其他樣品。移栽24個(gè)月至36個(gè)月,牛大力塊根膨大速率開(kāi)始下降,移栽30個(gè)月的塊根體積與36個(gè)月的塊根體積差異不顯著。類似于體積,塊根的鮮重與干重在移栽12個(gè)月至24個(gè)月也呈顯著增加的變化趨勢(shì)。從移栽24個(gè)月開(kāi)始,各樣品的塊根鮮重?zé)o顯著差異,但移栽36個(gè)月的塊根干重顯著高于其他樣品,且該時(shí)期塊根的折干率較高(40.70%)(表1),說(shuō)明從移栽24個(gè)月開(kāi)始,塊根的膨大速率減緩,但積累的干物質(zhì)增加。因此,根據(jù)牛大力塊根的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程,我們可初步劃分為形成期(移栽6~12個(gè)月)、迅速膨大期(移栽12~24個(gè)月)與穩(wěn)定膨大期(移栽24~36個(gè)月)三個(gè)階段。

    2.2 牛大力塊根不同發(fā)育時(shí)期的多糖物質(zhì)含量變化

    由圖2可知,牛大力多糖含量在塊根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)出逐漸上升的變化趨勢(shì),但在塊根穩(wěn)定膨大期的上升速率減緩,直至移栽36個(gè)月其含量達(dá)到最大值(36.57%)。淀粉作為一種主要的多糖物質(zhì),其含量的變化規(guī)律類似于多糖,隨著塊根的生長(zhǎng)發(fā)育而不斷增加。移栽6~18個(gè)月,塊根的淀粉含量較低且變化不大。移栽18個(gè)月后,塊根的淀粉含量迅速增加,極顯著高于形成期(移栽6~12個(gè)月)。移栽36個(gè)月,塊根的淀粉含量達(dá)到最大值(13.99%),極顯著高于移栽30個(gè)月的含量(12.69%)。

    2.3 牛大力塊根不同發(fā)育時(shí)期的可溶性糖含量變化

    可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖與果糖等,在牛大力塊根發(fā)育的過(guò)程中可溶性糖含量呈下降的變化趨勢(shì)(圖3:A)。移栽6個(gè)月,牛大力處于塊根形成期,此時(shí)的可溶性糖含量最高,達(dá)到23.45%,極顯著高于其他樣品。隨著塊根膨大進(jìn)程,根中合成積累的可溶性糖出現(xiàn)迅速下降,特別是從移栽6個(gè)月至12個(gè)月。移栽36個(gè)月,塊根的可溶性糖含量最低,僅為2.66%。由圖3:B可知,蔗糖含量在移栽6個(gè)月最高,達(dá)到7.06%。隨著塊根的發(fā)育進(jìn)程,其變化規(guī)律總體上呈下降的趨勢(shì),直至移栽36個(gè)月,含量降至1.19%。通過(guò)比較可溶性糖含量與蔗糖的含量,我們發(fā)現(xiàn)在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中蔗糖在可溶性糖中占據(jù)的比例為30.05%~54.26%。因此,我們認(rèn)為蔗糖可能是牛大力塊根最主要的可溶性糖。

    2.4 牛大力塊根不同發(fā)育時(shí)期的相關(guān)酶活性變化

    2.4.1 SPS和SUS(合成)酶的活性變化 通過(guò)對(duì)牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中的SPS和SUS(合成)方向的活性進(jìn)行測(cè)定(圖4),我們發(fā)現(xiàn)從移栽6個(gè)月至24個(gè)月,牛大力塊根的SPS酶活性呈上升的變化趨勢(shì),在移栽30個(gè)月出現(xiàn)稍微下降,之后又開(kāi)始升高,直至移栽36個(gè)月達(dá)到最大值(58.99 μmol·g-1·h-1FW),極顯著高于其他樣品。而SUS(合成)方向的活性則不斷增加,在移栽36個(gè)月達(dá)到最大值(113.26 μmol·g-1·h-1 FW),極顯著高于除移栽30 個(gè)月之外的所有樣品。SUS與SPS均為參與蔗糖合成的關(guān)鍵酶,而SUS(合成)方向的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SPS的酶活性,提示SUS可能在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮更重要的催化蔗糖合成作用。

    2.4.2 蔗糖分解代謝酶活性的變化 參與蔗糖分解代謝相關(guān)的酶主要包括SUS、AI與NI三種,從圖5可以看出,在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中,轉(zhuǎn)化酶AI和NI的活性均逐漸上升,且均在移栽36個(gè)月達(dá)到最高,分別為154.66 μmol·g-1·h-1 FW與90.82 μmol·g-1·h-1 FW,極顯著高于移栽30個(gè)月之前的所有樣品。通過(guò)比較NI與AI酶活性的含量及變化規(guī)律,我們發(fā)現(xiàn)AI的活性高于NI,推測(cè)AI可能在蔗糖代謝分解過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用,是一種主要的轉(zhuǎn)化酶。類似于轉(zhuǎn)化酶的活性,SUS(分解)方向的酶活性從移栽6個(gè)月至24個(gè)月也逐漸上升,但在塊根穩(wěn)定膨大期稍有下降,峰值出現(xiàn)在移栽24個(gè)月(150.89 μmol·g-1·h-1 FW)。在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中,SUS發(fā)揮著雙重的調(diào)控作用,一方面SUS(合成)方向參與催化蔗糖合成,另一方面SUS(分解)方向參與蔗糖分解代謝。因此,我們通過(guò)SUS凈活性來(lái)綜合評(píng)價(jià)SUS的調(diào)控作用,SUS凈活性=SUS(分解)方向-SUS(合成)方向。由圖5:D可知,SUS的凈活性為正值,說(shuō)明其綜合調(diào)控作用為催化蔗糖分解。隨著塊根發(fā)育進(jìn)程,SUS凈活性總體上呈上升后下降的變化趨勢(shì),在移栽12個(gè)月達(dá)到最大值(67.97 μmol·g-1·h-1 FW),在塊根形成期、迅速膨大期與穩(wěn)定膨大期這三個(gè)發(fā)育階段之間存在極顯著差異。

    2.5 牛大力塊根不同發(fā)育時(shí)期糖類物質(zhì)含量與相關(guān)酶活性的相關(guān)性

    從表2可以看出,牛大力不同發(fā)育時(shí)期的多糖含量與蔗糖含量、可溶性糖含量呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明了多糖的積累可能是在可溶性糖分解代謝的基礎(chǔ)上完成的。多糖含量與蔗糖合成及代謝相關(guān)的酶活性呈顯著或極顯著正相關(guān),說(shuō)明多糖類物質(zhì)的積累受蔗糖合成及代謝相關(guān)的酶影響,酶活性越大,多糖的積累量越多。作為一種主要的多糖物質(zhì),淀粉含量與蔗糖合成及代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性類似于多糖含量,進(jìn)一步驗(yàn)證了它們之間的相關(guān)性關(guān)系。可溶性糖含量與SPS、SUS(合成方向)、AI和NI活性等蔗糖合成及代謝相關(guān)酶活性呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中蔗糖代謝相關(guān)酶主要用于分解代謝蔗糖等可溶性糖,通過(guò)這些糖類物質(zhì)的分解代謝從而促進(jìn)多糖類物質(zhì)的合成積累。

    3 討論與結(jié)論

    塊根是一個(gè)重要的“庫(kù)”器官,在生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程中需要積累大量的光合產(chǎn)物,光合產(chǎn)物從“源”到“庫(kù)”的主要運(yùn)輸物質(zhì)是蔗糖,蔗糖既是光合作用早期形成的光合產(chǎn)物,又是葉片光合產(chǎn)物向各器官運(yùn)輸?shù)闹饕问剑谥参锾谴x中具有舉足輕重的作用(Abid et al., 2009)。光合產(chǎn)物的形成、運(yùn)輸與分配直接影響到藥用植物塊根藥材產(chǎn)量的高低與品質(zhì)的優(yōu)劣。本研究闡明塊根糖運(yùn)輸、代謝與積累機(jī)制,并通過(guò)人工調(diào)控增加“源”端的裝載能力和“庫(kù)”端的卸載能力,將有利于更多的光合產(chǎn)物合成并積累到“庫(kù)”器官中,對(duì)提高中藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要的意義。

    塊根中主要的可溶性糖是蔗糖。在發(fā)育前期, 蔗糖能較快地從葉片被輸送至塊根而參與同化物的積累。在甘薯塊根發(fā)育前期,蔗糖含量較高,而在發(fā)育后期,蔗糖含量下降同時(shí)淀粉積累較快(沈淞海等,1994)。我們也發(fā)現(xiàn)蔗糖是牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中主要的可溶性糖,蔗糖含量與可溶性糖含量均在牛大力塊根發(fā)育前期較高,隨著塊根的發(fā)育進(jìn)程,它們的含量逐漸下降,而淀粉含量與多糖含量則不斷上升。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果表明,多糖類與可溶性糖含量之間呈顯著負(fù)相關(guān),說(shuō)明可溶性糖的分解代謝有利于促進(jìn)多糖類物質(zhì)的積累。

    已有研究表明,貯藏器官的物質(zhì)積累是幾種蔗糖代謝酶協(xié)同發(fā)揮作用的結(jié)果,蔗糖經(jīng)過(guò)一系列酶的代謝過(guò)程后,最終被轉(zhuǎn)化為其他糖形式而被植物利用與積累(Nguyen-quoc & Foyer, 2001;于安民等,2014)。李丹等(2009)發(fā)現(xiàn)在甜菜塊根蔗糖合成中SUS合成方向大于SPS活性;于安民等(2014)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)春砂仁果實(shí)發(fā)育過(guò)程中SUS(合成)活性與SUS(分解)活性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SPS活性,推測(cè)SUS是催化陽(yáng)春砂仁果實(shí)中蔗糖合成與分解的關(guān)鍵酶;鄭國(guó)琦等(2008)發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞果實(shí)發(fā)育過(guò)程中SUS呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì),而SPS 的活性明顯低于SUS活性。本研究結(jié)果表明,在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中,SUS(合成)活性隨著塊根發(fā)育進(jìn)程而不斷上升,SUS(分解)活性在塊根形成期與迅速膨大期也不斷升高,并且SUS(合成)活性與SUS(分解)活性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SPS活性,這與前人研究結(jié)果基本一致。因此,我們推測(cè)SUS是催化牛大力塊根中蔗糖合成與分解的關(guān)鍵酶,在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著既催化蔗糖合成,又催化蔗糖分解的雙重調(diào)節(jié)作用。類似于李丹等(2009)的研究結(jié)果,SPS與SUS(分解)在牛大力塊根形成期與迅速膨大期呈現(xiàn)出相似的活性變化規(guī)律,說(shuō)明SPS活性受光合產(chǎn)物積累量的反饋調(diào)節(jié),使得SPS的合成產(chǎn)物得到適時(shí)分解代謝,從而維持SPS的高活性。通過(guò)對(duì)牛大力塊根糖類物質(zhì)含量、蔗糖合成與代謝酶之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)SPS、SUS(分解)活性與多糖含量呈極顯著正相關(guān),但與可溶性糖含量呈顯著負(fù)相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了SPS與SUS(分解)協(xié)同促進(jìn)蔗糖代謝與多糖類物質(zhì)的積累。蔗糖轉(zhuǎn)化酶可分為AI與NI兩種不同類型,已被證明能將蔗糖分解為果糖和葡萄糖。在牛大力塊根形成期AI 與NI的活性均較低,在塊根穩(wěn)定膨大期它們的活性提高了2~4倍,可見(jiàn)此時(shí)AI與NI的活性均非常高,確保了蔗糖的分解代謝。通過(guò)比較NI與AI的活性,我們發(fā)現(xiàn)AI處于更高的水平,因此我們推測(cè)AI可能在蔗糖代謝分解過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用,是一種主要的轉(zhuǎn)化酶。此外,本研究通過(guò)分析牛大力塊根中的SUS凈活性,認(rèn)為牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中蔗糖分解方向酶活性高于蔗糖合成方向酶活性,其中對(duì)蔗糖分解起關(guān)鍵作用的是SUS,SUS凈活性為催化蔗糖分解,其活性變化與蔗糖含量的變化趨勢(shì)一致,均為不斷下降,在移栽36個(gè)月的塊根中活性達(dá)到最低。SUS的活性決定了儲(chǔ)存“庫(kù)”器官的強(qiáng)度,通過(guò)調(diào)節(jié)“源”“庫(kù)”關(guān)系,在塊根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。于安民等(2014)對(duì)陽(yáng)春砂的研究表明,果皮和種子團(tuán)中 SUS 的凈活性為催化蔗糖合成,且逐漸上升,有利于蔗糖的迅速積累。不同于陽(yáng)春砂果實(shí)成熟,牛大力塊根發(fā)育SUS主要起分解蔗糖的作用,以達(dá)到為多糖類物質(zhì)積累提供前體物質(zhì)的目的。因此,我們可以利用分子生物學(xué)的方法,對(duì)牛大力中的SUS進(jìn)行過(guò)表達(dá)基因調(diào)控,以達(dá)到增強(qiáng)“庫(kù)”強(qiáng),提高產(chǎn)量與品質(zhì)的目的。然而,對(duì)于牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中SUS活性與可溶性糖、多糖類物質(zhì)的積累之間的相關(guān)基因及其表達(dá)網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步深入研究。

    高濃度的蔗糖可為糖向脂肪、蛋白、次生代謝物等的轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)(姜志娜等,2012)。在藥用植物丹參中,蔗糖代謝產(chǎn)生的同化物主要用于丹酚酸類物質(zhì)的積累(王春麗等,2012)。本研究發(fā)現(xiàn)牛大力多糖含量在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中逐漸升高,且多糖積累與可溶性糖含量呈顯著負(fù)相關(guān),與蔗糖代謝相關(guān)的酶活性呈顯著或極顯著正相關(guān),因此我們認(rèn)為牛大力塊根發(fā)育過(guò)程的蔗糖分解代謝可為多糖的積累提供前體物質(zhì)與底物,這與前人在枸杞(鄭國(guó)琦等,2008)、鐵皮石斛(楊駿等,2020)上的研究結(jié)果一致。淀粉屬于一種多糖類物質(zhì),淀粉含量也是決定牛大力塊根品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。已有研究表明,蔗糖分解代謝酶能促進(jìn)塊根淀粉的合成,特別是SUS,比如高淀粉含量的甘薯塊根中具有更高的SUS活性(呂長(zhǎng)文等,2011;占雷雷等,2019)。淀粉含量在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中逐漸增加,表明SUS的高活性可促進(jìn)其塊根中淀粉的合成與積累。這些均可為進(jìn)一步深入研究牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中SUS活性與蔗糖及次生代謝產(chǎn)物含量之間的關(guān)系提供思路。

    綜上所述,在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中,多糖類物質(zhì)含量逐漸增加,而可溶性糖含量則逐漸減少,多糖與可溶性糖含量之間呈顯著負(fù)相關(guān),說(shuō)明可溶性糖的分解代謝有利于促進(jìn)多糖類物質(zhì)的積累。蔗糖的分解代謝是蔗糖合酶(SUS)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)與中性轉(zhuǎn)化酶(NI)等多種相關(guān)酶協(xié)同作用的結(jié)果,SUS在牛大力塊根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著既催化蔗糖合成,又催化蔗糖分解的雙重調(diào)節(jié)作用,其凈活性為催化蔗糖分解,在塊根形成期達(dá)到最高。轉(zhuǎn)化酶AI和NI的活性均在塊根發(fā)育過(guò)程中逐漸增強(qiáng),且AI活性高于NI活性,推測(cè)AI可能在蔗糖代謝分解過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用。本研究結(jié)果可為今后深入研究牛大力多糖類成分積累調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù),并為提高牛大力藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)提供技術(shù)指導(dǎo)。

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    (責(zé)任編輯 何永艷)

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