基于SRAP分子標記構建何首烏核心種質庫

李嘉惠 歐曉華 鄧文靜 羅可可 張宏意 何夢玲 嚴寒靜

摘 要：? 為保護何首烏遺傳種質多樣性，該文運用SRAP分子標記方法探究了44個產地327份何首烏種質的遺傳多樣性和居群結構，采用3種取樣策略及6種比例抽樣模式構建核心種質庫，經t檢驗比較后篩選較優(yōu)的核心種質構建方法和具有代表性的核心種質。結果表明：（1）何首烏種質遺傳多樣性較豐富，其觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon信息指數（I）和Nei’s遺傳多樣性指數（H）分別為1.984 3、1.454 9、0.271 7和0.417 9，另外何首烏種質居群間遺傳分化程度大，基因交流較少，基因差異分化系數（Gst）為0.753 1，基因交流值（Nm）僅有0.163 9。（2）根據樣品間遺傳距離，采用鄰接法對樣品進行聚類，聚類結果顯示327份樣品主要分成四大類，樣品分組結果與地理分布相符，相同采集點樣品可聚在同一類中。（3）居群結構分析結果顯示，當K=16時，其ΔK值最大，說明樣品分成16個類群時最佳，同時大部分何首烏樣品的血統(tǒng)組成較單一（Q>0.600），相同采集點樣品血統(tǒng)組成相似，可大致歸在同一類群中。（4）t檢驗結果顯示，采用居群結構分類-比例取樣和10%抽樣比例構建的種質庫，4個遺傳參數的保留率高，Na、Ne、I和H的保留值分別為99.0%、101.9%、106.4%和105.9%，樣品量較少，且多樣性與原種質庫無明顯差異（P>0.05）。（5）核心種質庫由34份樣品組成，包括9份栽培樣品和25份野生樣品，主要來源于四川、重慶和貴州。該研究構建的核心種質庫能代表原種質庫的遺傳多樣性，可為種質資源的收集和新品種的選育提供參考，所采用的研究方法對其他植物核心種質庫的構建具有一定參考意義。

關鍵詞： 何首烏， 核心種質構建， SRAP， 遺傳多樣性， 居群結構

中圖分類號：? Q948

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）11-1920-11

Construction of core germplasm bank of Fallopia multiflora using SRAP molecular markers

LI Jiahui1， OU Xiaohua1， DENG Wenjing1， LUO Keke1， ZHANG Hongyi1，2， HE Mengling1，2， YAN Hanjing1，2*

（ 1. School of Traditional Chinese Medicine Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Key Laboratory of State

Administration of Traditional Chinese Medicine for Production & Development of Cantons Medicinal Materials， Guangzhou 510006， China）

Abstract：? In order to protect the genetic diversity of Fallopia multiflora， in this study，? SRAP molecular marker method was used to explore the genetic diversity and population structure of 327 F. multiflora samples from 44 habitats. Three sampling strategies and six proportional sampling modes were used to construct the core germplasm bank. After t-Test comparison， the better core germplasm construction method and the representative core germplasm samples were selected. The results were as follows： （1） The genetic diversity of F. multiflora germplasm was abundant， and number of observed alleles （Na）， number of effective alleles （Ne）， Shannon information index （I） and Nei’s genetic diversity index （H） were 1.984 3， 1.454 9， 0.271 7 and 0.417 9， respectively. In addition， the population of F. multiflora germplasm showed a high degree of genetic differentiation， but less gene exchange， with a gene differentiation coefficient （Gst） of 0.753 1 and a gene flow （Nm） of 0.163 9. （2）According to the genetic distance between samples， the Neighbor-Joining method was used to cluster the samples. The results showed that the 327 samples were mainly divided into four categories. The grouping results were consistent with the geographical distribution， and the samples at the same collection point could be clustered into the same category. （3） Population structure analysis showed that?? the biggest ΔK value was obtained when K=16， indicating that the sample should be divided into 16 groups， at the same time， the lineages composition of most F. multiflora samples were relatively simple， and the samples from the same collection point had similar lineages and could be roughly grouped in the same group. （4） The t-test showed that when population structure classification-proportional sampling and 10% sampling proportion were used to construct the germplasm bank， the retention rate of the four genetic parameters was high. The retention rate of Na， Ne， I and H values were 99.0%， 101.9%， 106.4% and 105.9%， respectively， the sample size was small， and the diversity was not significantly different from the original germplasm bank （P>0.05）. （5） The core germplasm bank consisted of 34 samples， including 9 cultivated samples and 25 wild samples， mainly from Sichuan， Chongqing and Guizhou provinces. The core germplasm bank constructed in this experiment can represent the genetic diversity of the original germplasm bank， and the results can provide reference for the collection of germplasm resources and breeding of new varieties. The method used in the experiment has certain reference significance for the construction of other plant core germplasm banks.

Key words： Fallopia multiflora， construction of core germplasm， SRAP

何首烏（Fallopia multiflora）為蓼科多年生草本植物，適應力強，在我國204個縣（市）均有分布（陳亞等，2011）。其喜光耐貧瘠，地下膨大的塊根和地上生長的莖藤（首烏藤）均可入藥，以塊根入藥為主，生用可以截瘧解毒、潤腸通便，炮制后可補益精血、固腎烏須。隨著人們生活水平的提高，具有補益作用的何首烏市場需求量日漸攀升。藥材市場中，野生何首烏是何首烏商品的重要來源。然而，研究人員調查結果顯示，野生何首烏的資源供應量正以每年約15%的速度遞減（劉紅昌等，2013）。何首烏的繁殖方式包括種子繁殖、扦插繁殖、組織培養(yǎng)快速繁殖及壓條繁殖等，其中扦插繁殖操作簡單、成活率高，是目前農戶規(guī)模化種植的常用方式。但是，長期的扦插繁殖會導致品種退化，從而影響何首烏藥材的質量（曾文丹等，2016）。野生資源的枯竭和栽培種質的退化會造成物種遺傳多樣性的減少，降低生存和適應環(huán)境變化能力，同時也會導致優(yōu)良基因丟失，嚴重影響何首烏的可持續(xù)發(fā)展和利用。因此，加強種質研究，進而構建何首烏的核心種質庫，對何首烏資源實施有針對性和高效保護是亟待進行的任務。然而，至今尚無何首烏核心種質構建的相關報道。

SRAP（sequence related amplified polymophism）標記方法由Li & Quiros（2001）于2001年創(chuàng)立，相對其他標記方法，其具備分布普遍、可靠性和重復性高、技術難度低和多態(tài)性高等特點，在植物遺傳基因圖譜、植物遺傳多樣性和親緣關系的分析以及基因轉錄圖譜的構建上均有普遍應用（楊金華，2019）。程遠輝（2007）在研究重慶地區(qū)何首烏遺傳多樣性時，較長時間使用RAPD標記方法進行研究，由于結果顯示擴增條帶少、重復性差，因此最終選擇SRAP標記方法進行研究。可見，SRAP標記方法在何首烏遺傳多樣性研究上的優(yōu)勢。本研究利用前期篩選的13對SRAP引物對44個產地327份何首烏樣品的遺傳多樣性進行研究，采用鄰接法聚類-比例取樣、居群結構分類-比例取樣和最小距離逐步聚類取樣3種取樣策略，以及5%、10%、15%、20%、25%和30%共6種比例抽樣模式，通過t檢驗對上述方法構建的初始種質進行評價，篩選出較好的取樣策略和抽樣比例，從而構建何首烏核心種質庫。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2019年，采集327份何首烏葉片樣品，經廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為蓼科何首烏屬植物何首烏（Fallopia multiflora）。樣品覆蓋我國12個省44個地點，其中218份為栽培居群樣品，109份為野生居群樣品。栽培居群樣品中包含1份棱枝何首烏（Fallopia multiflora var. angulatum），原種來自廣西，栽培于廣東藥科大學藥用植物園，具體信息見表1。

1.2 PCR擴增、產物檢測及數據統(tǒng)計方法

選用植物DNA提取試劑盒（寶生物工程有限公司，產品型號9768）對何首烏葉片的基因組DNA進行提取。利用前期篩選得到的13對引物對327份何首烏基因組DNA進行擴增，引物信息見表2。反應體系的總體積為20 μL，包括10 μL premix（寶生物工程有限公司，產品型號RR902A），正反向引物（引物母液濃度為10 ng·μL-1）各1 μL，DNA模板40 ng，并用ddH20補充體積至20 μL;PCR反應程序為SRAP標記方法的一般程序，即94 ℃預變性4 min;94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共5個循環(huán);94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

使用條帶識別軟件Quantity-One加人工識別的方式統(tǒng)計非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上各泳道的條帶遷移距離，相同位置有條帶則記為1，無則為0，并建立二維數據矩陣。利用NTsyspc、Popgen 32、MEGA 7和Structure 2.3.4軟件對數據進行統(tǒng)計分析，獲得何首烏種質的遺傳多樣性參數、遺傳距離、樣品聚類和居群結構分析結果。在居群結構分析時，假設何首烏居群可以分成K=1～23個，并采用Evanno et al.（2005）的方法計算ΔK值，從而獲得最佳的類群數。

1.3 取樣策略和抽樣方法

設置3種取樣策略，即鄰接法聚類-比例取樣、居群結構分組-比例取樣和最小距離逐步聚類取樣;6個抽樣比例，分別為 5%、10%、15%、20%、25%、30%，嘗試構建何首烏的核心種質，取樣方法的具體步驟如下。

（1）鄰接法聚類-比例取樣：根據原居群樣品間遺傳距離，通過鄰接法聚類對樣品進行分組，以各組的Nei’s基因多樣性指數（H）比值決定各組樣品的取樣數量，當該組抽樣數目大于組內樣品數時，則按H比值把取樣數量分配到其他組。

（2）居群結構分組-比例取樣：通過Structure 2.3.4軟件的居群分析，獲得原居群的最佳分類組數，根據Q值對樣品進行分類，并以各組的Nei’s基因多樣性指數（H）比值決定各組樣品的取樣數量，當組中抽樣數目大于組內樣品數時，則按H比值把取樣數量分配到其他組。

（3）最小距離逐步聚類取樣：根據原群體各樣品的遺傳距離進行聚類分析，在聚類結果中找出遺傳距離最小的一組，在該組中剔除其中一份樣品，另一份樣品保留下來，和其余樣品重新計算遺傳距離并進行聚類分析，循環(huán)上述步驟，直至樣品數量符合抽樣比例。

1.4 核心種質庫檢驗和評價

采用t檢驗比較初始核心種質庫和原種質庫的各項遺傳多樣性參數。

2 結果與分析

2.1 樣品擴增結果

圖1為何首烏樣品基因組DNA經SRAP-PCR擴增、電泳和銀染后得到的聚丙烯酰胺凝膠圖，結果顯示樣品擴增條帶中等豐富，條帶能充分分離且清晰平整，即實驗篩選的SRAP引物和采用的擴增、電泳、銀染體系均適合何首烏的種質研究。

2.2 種質遺傳多樣性、樣品聚類和居群結構分類

何首烏種質遺傳多樣性結果如表3所示，13對引物在栽培和野生居群樣品中的擴增條帶數及多態(tài)位點數豐富，野生居群樣品的4個遺傳多樣性參數均大于栽培居群樣品，說明野生何首烏的遺傳多樣性比栽培居群的大，兩種類型何首烏的居群間基因多樣性均大于居群內多樣性，表明種質多樣性主要來自居群間。整個何首烏種質資源的基因差異分化系數（Gst）為0.753 1（>0.5），表明居群間遺傳分化程度大，但居群間的基因交流較少，基因交流值（Nm）僅有0.163 9（<1.0）。另外，栽培居群間分化程度極高，但基因交流極小，推測是生產過程主要采用營養(yǎng)繁殖，居群間缺少基因交流所致。

通過鄰接法獲得何首烏樣品聚類分組結果（圖2），何首烏樣品主要分成4大分支：第1分支為棱枝何首烏，由于它與其余何首烏樣品均有較大的遺傳距離，因此獨立成支;第2分支包括四川的EMS1～2和貴州的所有野生居群樣品;第3分支為河南鄭州的樣品;第4分支由其余樣品組成。

經Structure 2.3.4統(tǒng)計分析，當K=16時，其ΔK值最大，說明樣品分成16個類群時最佳（圖3），并由此獲得居群結構圖（圖4），根據劉麗華等（2009）的方法，把樣品歸納如表4所示，其中319份樣品的Q≥0.600，說明大部分何首烏種質的遺傳結構簡單，而EMS（1～2）、HLP1、JGB1、DZ1、JGC1及HT（1～2）樣品則血統(tǒng)相對復雜，實驗將這些樣品歸在同一類群中，用于后續(xù)核心種質的構建。

2.3 不同取樣策略和抽樣比例的比較

何首烏樣品在不同取樣策略和抽樣比例下所組成的初始種質庫，其遺傳多樣性參數如表5所示， 隨抽樣比例增大， 不同取樣策略其Na值和多態(tài)位點百分數逐漸增大，而Ne值、H值和I值則先下降后上升，且3個參數的保留率均大于100%，即6個抽樣比例構建的初始種質遺傳多樣性均大于原種質。

經t檢驗比較5%～30%抽樣比例下初始種質庫和原種質庫的4個遺傳參數，結果見表6。鄰接法聚類-比例取樣策略在不同抽樣比例下初始種質庫的H值和I值與原種質庫均存在顯著或極顯著的差異，說明采用該方法構建核心種質，種質庫樣品遺傳多樣性不能反映原種質的真實情況，而居群結構分類-比例取樣和最小距離逐步聚類取樣方法在10%～20%抽樣比例下，4個遺傳參數與原種質庫均無顯著差異，當比例為10%時，兩種方法的4個遺傳參數值均最大，且居群結構分類-比例取樣對原種質遺傳多樣性的保留上更占優(yōu)勢，根據核心種質庫構建的原則：去除冗余，并以最小的資源量代表整個種質資源的遺傳多樣性。因此，選擇居群結構分類-比例取樣在10%比例下構建核心種質庫。

2.4 何首烏核心種質庫構建

采用居群結構分類-比例取樣抽取原種質庫10%的樣品所組成的核心種質庫如表7所示，樣品數量共34份，由9份栽培居群樣品和25份野生居群樣品組成。栽培居群樣品包括與其他樣品存在明顯差異的棱枝何首烏，而野生居群樣品主要分布在四川、重慶和貴州，該地區(qū)樣品數量約占核心種質庫總數的47%。

3 討論與結論

焦賢賢（2018）的研究表明，核心種質的構建可以為植物的保護和利用提供理論指導，并有效地提高種質資源的管理、研究和利用效率。目前，世界各國已創(chuàng)立1 300余個種質資源庫，保存了600多萬份各類種質資源，而我國現存的約有40萬份（李榮榮，2020）。雖然藥用植物種質資源是中藥的源頭，但由于藥用植物的核心種質庫的建立起步較晚，因此在種質庫的構建上一般是沿用農作物的方法（林丹，2018）。

核心種質的構建，實質上是利用收集到的數據，根據一定原則把類似的種質資源進行分組，選取合適的總體取樣規(guī)模，在每組中用合理的取樣比例和取樣方法進行抽樣， 使建立的核心種質不僅能盡量地代表原種質的遺傳多樣性，而且能最大程度地反映原始群體的遺傳結構（王心迪，2016）。核心種質構建一般包括4個步驟，即數據采集及分析、材料分組、樣品抽樣和核心種質檢驗及評價。其中，樣品抽樣包括抽樣方法和抽樣比例的確立，是核心種質構建中的重要環(huán)節(jié)。因此，抽樣策略的選擇對核心種質庫的優(yōu)劣起到關鍵性作用。

在材料分組上，將搜集到的材料先以相似特征為依據將種質分類，再以一定取樣方法選擇不同類群中的種質所形成的樣本，其遺傳差異比選取同種群體的樣本高。分組的標準和方法較多樣，目前使用最多的是聚類分組方法（姜麗媛，2018）。本研究采用SRAR分子標記方法獲得何首烏的聚類分組結果，同時通過居群結構分析獲得樣品的類群分組結果，作為后續(xù)樣品選擇的基礎。

在取樣策略上，主要包括分層取樣法、逐步聚類隨機取樣法、最小距離逐步聚類法、主成分分析法和位點優(yōu)先逐步聚類法。其中，分層取樣法包括4種， 分別為比例法、 對數法、 平方根法和遺傳幾何形狀代表何首烏樣品，空心圖形為栽培居群樣品，實心為野生居群樣品，填充顏色相同代表該野生樣品來自相同的省。

多樣性法（楊孟莉，2016）。本研究獲得的是離散型指標數據，主要通過遺傳參數的統(tǒng)計來分析種質的多樣性，由于物種多樣性在群體中分布是不均勻的，因此在前期的聚類分組和居群結構分組的基礎上，根據每組遺傳多樣性指數的比例來確定組內抽樣的數目， 最終形成了鄰接法聚類-比例取樣和居群結構分類-比例取樣兩種抽樣方法。另外，由于最小逐步聚類方法為核心種質構建的常用方法，因此將其納入何首烏核心種質構建的抽樣策略中。

本研究中，何首烏核心種質庫的構建結果表明，雖然鄰接法聚類分組-比例取樣能使初始種質庫的遺傳參數獲得較高的值，但與原種質庫存在顯著差異（P<0.05）， 筆者認為可能是鄰接法聚類對樣品的分組不夠精細，取樣時較為隨機所致。雖然實驗采用的最小距離逐步聚類方法能較好地構建何首烏的核心種質，但步驟較為繁瑣，而居群結構分類-比例取樣方法目前雖然較為少用，但實驗結果顯示，該方法構建的核心種質庫代表性強且多樣性保留較高，它可以對樣品進行精細的類群劃分，利用多樣性比值確定取樣數量避免了樣品抽取數量分配不均勻的情況，減少了冗余，且操作比最小距離逐步聚類取樣簡便，上述比較提示該方法可以推廣應用于其他物種核心種質庫的構建中。

本研究采用居群結構分類-比例取樣，在10%的抽樣比例下獲得了最佳的核心種質庫，關于抽樣比例，大多數植物資源核心種質的整體取樣比例在5%～30%之間， 目前還沒有研究可以確定統(tǒng)一的比例（吳茵，2017）。因此，需要根據不同植物種質資源的收集程度、遺傳多樣性狀況和遺傳結構等方面的具體特點，設定適合的取樣比例（焦賢賢，2018）。

核心種質的構建并非完美無缺， 盡管在構建中選取了最佳的比例、最佳的抽樣策略、最大限度地對原始種質進行篩選，但仍舊會丟失某些變異類型，并且隨著資源不斷地收集，會出現新的變異類型。因此，為了使物種的多樣性得到長久的保存和有效利用，應該實時對種質庫進行調整（姜麗媛，2018）。本研究中，重慶和四川的野生居群樣品占核心種質的多數， 在聚類和居群結構分析時發(fā)現， 上述兩個產地的野生樣品與其他產地樣品相比，在聚類分組中呈分散分布，說明兩地樣品遺傳多樣性高，提示該地區(qū)何首烏種質遺傳多樣性豐富，今后可以加強兩地何首烏樣本的收集和研究，進而不斷完善核心種質庫。

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（責任編輯 蔣巧媛）