印度血桐與中平樹基因組調(diào)查及SSR分子標(biāo)記分析

李江瑩 陸添權(quán) 楊俊波 田波

摘 要：? 印度血桐與中平樹是大戟科血桐屬植物，該屬植物具有多種藥用價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于民間醫(yī)學(xué)中許多疾病的治療，這兩種植物種子中含有的神經(jīng)酸也引起了研究者的高度關(guān)注。為確定適合印度血桐與中平樹的全基因組測(cè)序研究策略，該研究采用二代高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)的方法首次測(cè)定了印度血桐與中平樹的基因組大小、雜合率、重復(fù)率等基因組信息并初步分析了兩種材料的SSR序列特征。結(jié)果表明：（1）印度血桐與中平樹的基因組大小分別為986.84和946.23 M。（2）印度血桐與中平樹的雜合率分別為0.75%和0.65%，重復(fù)序列比例分別為73.02%和71.5%。（3）通過(guò)對(duì)2種材料基因組序列的SSR特征分析，在印度血桐中共鑒定了4 499 185個(gè)SSR，在中平樹中共鑒定了4 969 098個(gè)SSR。該研究結(jié)果為印度血桐與中平樹SSR分子標(biāo)記的篩選、開(kāi)發(fā)以及全基因組深度測(cè)序提供了理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 印度血桐， 中平樹， 神經(jīng)酸， 基因組調(diào)查， SSR

中圖分類號(hào)：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2021）11-1897-08

Genome survey and analysis of SSR molecular markers on Macaranga indica and M. denticulata

LI Jiangying1，3， LU Tianquan1， YANG Junbo2， TIAN Bo1*

（ 1. Key Laboratory of Tropical Plant Resource and Sustainable Use， Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China; 2. Germplasm Bank of Wild Species， Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650204， China; 3. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 101408， China ）

Abstract：? Macaranga indica and M. denticulata belong to the genus Macaranga Thou.（Euphorbiaceae family）. Plants of this genus are widely used in treatments of many diseases in Chinese folk medicine. The nervonic acid contained in the seeds of these two plants has also attracted great attention of researchers. In order to determine the strategy of the whole genome of M. indica and M. denticulata. In the present study， we first determined the genome sizes， heterozygosities， and repetitive rates of M. indica and M. denticulata through the second generation sequencing technology and bioinformatics methods， and the SSR sequence characteristics of M. indica and M. denticulata were preliminarily analyzed. The results were as follows： （1） The genome sizes of M. indica and M. denticulata were 986.84 and 946.23 M， respectively; （2） Heterozygosities and repetitive rates were 0.75% and 73.02% respectively in M. indica， and 0.65% and 71.5% in M. denticulata; （3） In addition， 4 499 185 and 4 969 098 genomic simple sequence repeat （SSR） markers in M. indica and M. denticulata were generated respectively. The results provide theoretical guidance for deep whole-genome sequencing of the two species and the screening and development of SSR molecular markers of M. indica and M. denticulata.

Key words： Macaranga indica， Macaranga denticulata， nervonic acid， genome survey， simple sequence repeat （SSR）

印度血桐（Macaranga indica）與中平樹（M. denticulata）屬于大戟科鐵莧菜族血桐屬（Macaranga Thou.）植物，二者均為葉盾狀著生的高大喬木，廣泛分布于我國(guó)西南地區(qū)的山谷、次生林或常綠闊葉林中?！吨腥A本草》中記錄了中平樹的主要藥用部位根與樹皮具有退黃、清熱利濕等功效，可用于治療胃脘疼痛、黃疸型肝炎（黃建猷等，2015）。已有相關(guān)研究報(bào)道了從印度血桐中分離出了鞣花酸，異戊烯化黃酮等多種化合物，這些化合物具有如抗氧化作用、抗炎作用等多種生物活性，可發(fā)展為一種新的工業(yè)萃取源（Yang et al.， 2015）。通過(guò)對(duì)印度血桐與中平樹種子中所含脂肪酸的成分測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)印度血桐與中平樹的種子脂肪酸組成成分中，都含有超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸——神經(jīng)酸，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了王性炎等（2006）在多份植物樣品中發(fā)現(xiàn)盾葉木 [注： 新版《中國(guó)植物志》已修訂盾葉木（Macaranga adenantha）與印度血桐（Macaranga indica）為同一個(gè)種]是自然界已發(fā)現(xiàn)的植物中種子油脂中神經(jīng)酸含量較高的木本植物，是目前已發(fā)現(xiàn)物種中較為理想的開(kāi)發(fā)神經(jīng)酸產(chǎn)品的植物資源。神經(jīng)酸是大腦纖維和神經(jīng)細(xì)胞的核心天然成分，與腦部神經(jīng)的生物合成密切相關(guān)，具有多種重要的生物學(xué)功能，如促進(jìn)大腦發(fā)育、改善記憶、延緩大腦衰老（Li et al.， 2019），攝入神經(jīng)酸能預(yù)防和治療老年癡呆癥、腦中風(fēng)后遺癥、腦萎縮、腦癱、健忘失眠及記憶力減退等腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病（田德雨等，2015）?；谝陨显?，神經(jīng)酸的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用引起了國(guó)內(nèi)外專家的高度關(guān)注。因此，為滿足人們對(duì)神經(jīng)酸的需求，利用富含神經(jīng)酸的植物開(kāi)發(fā)神經(jīng)酸產(chǎn)品已成為獲取神經(jīng)酸的主要途徑。

目前，對(duì)印度血桐與中平樹的研究主要集中在常見(jiàn)藥用部位化學(xué)成分的藥理活性及種子脂肪酸成分方面，而關(guān)于印度血桐與中平樹基因組信息的研究未見(jiàn)報(bào)道，這給高效利用印度血桐與中平樹野生資源選育植物新品種帶來(lái)了極大不便，由于印度血桐與中平樹均為木本植物，基因組大小尚不明確，各種因素使得血桐屬植物的分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，因此在對(duì)兩種材料進(jìn)行全基因組深度測(cè)序之前，需要先對(duì)兩種材料進(jìn)行低覆蓋度的基因組調(diào)查，以了解材料基因組的組成特征和模式（Li et al.， 2019）。深入分析DNA中的遺傳信息是一項(xiàng)浩大的工程，其首要任務(wù)就是突破技術(shù)上的重難點(diǎn)（Albach et al.， 2007）。植物全基因組的研究進(jìn)程的迅速發(fā)展得益于新一代測(cè)序技術(shù)日益進(jìn)步（施季森等，2012）。隨著測(cè)序技術(shù)的逐漸成熟及測(cè)序價(jià)格的降低，基因組測(cè)序已被廣泛應(yīng)用到各種具有科研價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值、觀賞價(jià)值的物種中。物種的基因組測(cè)序有助于我們了解各種生物體中生命現(xiàn)象的調(diào)控機(jī)制以及物種的群體進(jìn)化、生長(zhǎng)發(fā)育等生物學(xué)問(wèn)題。目前，可對(duì)物種進(jìn)行基因組大小測(cè)定的方法有流式細(xì)胞術(shù)、Feulgen分光光度法、脈沖場(chǎng)凝膠電泳法以及在技術(shù)不斷進(jìn)步革新的條件下快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)（伍艷芳等，2014）。在大戟科植物中，麻風(fēng)樹、蓖麻、木薯、橡膠樹等（Chan et al.， 2010; Shusei et al.， 2011; Simon et al.， 2012; Zou & Yang， 2019）植物的基因組信息已有報(bào)道，這些已測(cè)物種的基因組可為我們研究大戟科血桐屬植物的基因組信息提供參考。

本研究采用Illumina二代高通量測(cè)序技術(shù)，首次對(duì)印度血桐與中平樹進(jìn)行了基因組調(diào)查，并利用生物信息學(xué)方法估計(jì)了兩種材料的重復(fù)率、雜合率及基于基因組調(diào)研的SSR （simple sequence repeat）特征分析，旨在為印度血桐與中平樹的全基因組的測(cè)序和組裝方案的制定和該屬植物的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)為血桐屬植物的遺傳改良提供支持，也為進(jìn)一步運(yùn)用SSR分子標(biāo)記在對(duì)兩種材料的種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳多樣性等方面的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)材料印度血桐與中平樹均為正常開(kāi)花結(jié)果的野生植株，于2019年7月采自西雙版納傣族自治州景洪市勐龍鎮(zhèn)勐宋村公路邊，帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后放置于-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2 樣品基因組DNA的提取、檢測(cè)與測(cè)序

采用CTAB法提取印度血桐與中平樹葉片基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性;將提取的DNA樣品送至公司進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，參考其他木本植物的基因組大小及大戟科植物的C值范圍，選取1 Gb左右的基因組大小來(lái)評(píng)估印度血桐與中平樹的基因組測(cè)序覆蓋度。

1.3 建庫(kù)信息及數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)

印度血桐與中平樹基因組采用二代測(cè)序技術(shù)，利用WGS （全基因組鳥槍法），分別構(gòu)建插入片段為350 和500 bp的DNA文庫(kù)，再用Illumina HiseqTM2000平臺(tái)進(jìn)行雙末端（Pair-End）測(cè)序，最終得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)（raw reads），取全部原始數(shù)據(jù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行圖像識(shí)別，去污染，去接頭;統(tǒng)計(jì)結(jié)果包括測(cè)序read數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量、測(cè)序錯(cuò)誤率、Q20、Q30、GC含量等。

1.4 基因組大小預(yù)測(cè)和雜合度估計(jì)

將本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)序得到的序列，基于K-mer的分析方法估計(jì)印度血桐與中平樹的基因組大小及雜合率，取K=17進(jìn)行分析。K-mer分布圖用來(lái)判斷基因組的重復(fù)序列多少，如果材料的基因組重復(fù)比例較高，K-mer分布圖右側(cè)將會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。mer深度分布服從泊松分布，根據(jù)曲線獲得K-mer 深度期望值，用于估計(jì)基因組大小（周媛等，2019）。另外，在K-mer的分布曲線中，一般會(huì)出現(xiàn)一個(gè)覆蓋度最高的主峰，若在主峰兩側(cè)出現(xiàn)另一個(gè)小峰，則說(shuō)明該材料的基因組有較高的雜合度;反之，則沒(méi)有。

1.5 樣品污染判斷

在基因組研究中，樣品是否存在污染問(wèn)題至關(guān)重要。若數(shù)據(jù)未被污染，可保證實(shí)驗(yàn)樣品基因組序列的完整性，數(shù)據(jù)真實(shí)有效，結(jié)果可靠;若數(shù)據(jù)被污染，則無(wú)法獲得相關(guān)信息。對(duì)過(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)隨機(jī)抽取10 000條reads（read1和read2各5 000條）數(shù)據(jù)，通過(guò)BLAST軟件比對(duì)NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)（NT庫(kù)），若比對(duì)結(jié)果是同源比對(duì)，則認(rèn)為樣本不存在外源污染;若比對(duì)結(jié)果出現(xiàn)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，說(shuō)明樣品可能存在污染（閆婧，2018）。

1.6 SSR分析

采用微衛(wèi)星識(shí)別工具（microsatellite identi-fication tool， MISA） （http：//pgrc.Ipk-gatersleben.de/misa/）在所有序列中搜索SSR位點(diǎn)，搜索參數(shù)如下：mono-10、di-6、tri-5、Tetra-5、penta-5、hexa-6。其中，復(fù)合序列中兩個(gè)不同SSR之間允許的最大間隔設(shè)置為100 bp （張璟璇等，2019）。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料的DNA提取

采用CTAB法提取印度血桐與中平樹幼嫩葉片的基因組DNA。電泳圖顯示提取的兩種材料基因組DNA質(zhì)量良好（圖1）。其中，印度血桐的DNA濃度為15.42 ng·μL-1，中平樹的DNA濃度為10.46 ng·μL-1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

利用Illumina平臺(tái)對(duì)兩種材料進(jìn)行高通量雙端測(cè)序，經(jīng)過(guò)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)的嚴(yán)格篩選，得到高質(zhì)量的產(chǎn)出數(shù)據(jù)（clean data），以下統(tǒng)計(jì)是印度血桐與中平樹4個(gè)文庫(kù)的產(chǎn)出數(shù)據(jù)（表1）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果包括測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量、錯(cuò)誤率、Q20、Q30、GC含量等。過(guò)濾掉低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，分別得到了53.56和68.07 Gb的印度血桐與中平樹的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。兩種材料堿基質(zhì)量正常，Q20與Q30都大于90%，測(cè)序錯(cuò)誤率都為0.04%，印度血桐的GC含量為33.89%，中平樹的GC含量為33%，結(jié)果表明原始測(cè)序質(zhì)量較好，能保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析的正常進(jìn)行。

2.3 K-mer分析與基因組大小估測(cè)

采用基于K-mer的分析方法對(duì)印度血桐與中平樹的53.56和68.07 Gb的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到印度血桐與中平樹的17-mer分布情況（圖2），橫坐標(biāo)表示K-mer出現(xiàn)的總次數(shù)，縱坐標(biāo)表示K-mer出現(xiàn)的頻率（唐其等，2015），兩種材料主峰之前都出現(xiàn)雜合峰，說(shuō)明它們都有一定的雜合率。兩種材料的17-mer曲線均有嚴(yán)重拖尾，說(shuō)明它們都有很高的重復(fù)序列比例。結(jié)合表2可知，印度血桐與中平樹的測(cè)序深度分別為40X和54X，印度血桐的K-mer總數(shù)為39 725 851 195，中平樹的K-mer總數(shù)為51 594 983 117，根據(jù)公式基因組大?。℅）的估計(jì)算法：G=K-mun/K-depth，其中K-depth表示K-mer的期望測(cè)序深度，K-mun表示K-mer的總數(shù)（閆婧，2018），由此公式可得印度血桐的大小為993.15 M，修正后的基因組大小為986.84 M;中平樹的基因組大小為955.46 M，修正后的基因組大小為946.23 M;印度血桐與中平樹的雜合率分別為0.75%和0.65%，印度血桐與中平樹的重復(fù)率分別為73.02%和73.5%。由測(cè)序結(jié)果可知，印度血桐與中平樹都屬于高重復(fù)微雜合基因組。

2.4 樣品污染評(píng)估——核苷酸比對(duì)結(jié)果

分別從印度血桐與中平樹的350 和500 bp的序列文庫(kù)中隨機(jī)抽取10 000條過(guò)濾后的單端高質(zhì)量reads （read1和read2各5 000條），與NT庫(kù)（NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行BLAST比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果比率最高的前六位物種展示出來(lái)（表3），比對(duì)結(jié)果顯示，在印度血桐與中平樹的兩個(gè)文庫(kù)中，比對(duì)結(jié)果比率最高的物種均為蓖麻，在印度血桐的350和500 bp文庫(kù)中，蓖麻分別占比對(duì)上NT庫(kù)的reads總數(shù)的1.61%和1.9%，而在中平樹的350和500 bp文庫(kù)中，蓖麻分別占比對(duì)上的NT庫(kù)的reads總數(shù)的1.78%和1.65%，根據(jù)分類學(xué)結(jié)果可知，蓖麻屬于大戟科植物，為印度血桐與中平樹的近緣物種。此外，比對(duì)結(jié)果的其他物種均為植物，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物或微生物等異常物種的高比率情況，因此判斷樣品材料無(wú)污染，可用于后續(xù)基因組調(diào)研圖的正常分析。

2.5 印度血桐與中平樹基因組SSR分析

利用微衛(wèi)星識(shí)別工具M(jìn)ISA在印度血桐與中平樹初步組裝的所有序列中進(jìn)行SSR查找，搜索結(jié)果如表4所示，在印度血桐中共搜索到4 499 185個(gè)SSR，在所含有SSR的序列中，445 117條序列包含1個(gè)以上SSR，以復(fù)合形式存在的SSR數(shù)量有492 341個(gè);在中平樹中共搜索到4 969 098個(gè)SSR，在所含有SSR的序列中，458 726條序列包含1個(gè)以上SSR，以復(fù)合形式存在的SSR序列有507 887條。分別對(duì)兩種材料的不同類型的SSR核苷酸數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在印度血桐的SSR核苷酸數(shù)量中，單、雙、三、四、五和六核苷酸重復(fù)模體分別有2 800 292、1 199 707、432 509、48 890、10 498、7 289個(gè)，分別占印度血桐總重復(fù)模體的62.24%、26.66%、9.61%、1.09%、0.23%、0.16%;在中平樹的SSR核苷酸數(shù)量中，單、雙、三、四、五和六核苷酸核苷酸重復(fù)模體分別有3 037 613、1 321 752、522 801、63 973、11 254、11 705個(gè)，分別占中平樹總重復(fù)模體的61.13%、26.60%、10.52%、1.29%、0.23%、0.24%。然后，進(jìn)一步對(duì)印度血桐與中平樹中每種SSR重復(fù)模體按照序列組成進(jìn)行細(xì)分，分別展示出兩種材料中重復(fù)類型的部分?jǐn)?shù)目（表5）。

3 討論與結(jié)論

基因組大小是比較和進(jìn)化基因組學(xué)的基礎(chǔ)，基因組的雜合率和重復(fù)率是決定基因組組裝質(zhì)量的關(guān)鍵，評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的雜合率與重復(fù)率，有助于找到合適的組裝策略（Bi et al.， 2019）。對(duì)印度血桐與中平樹進(jìn)行17-mer分析后發(fā)現(xiàn)，印度血桐與中平樹的預(yù)估基因組大小分別為987和946 M，由測(cè)定結(jié)果來(lái)看，印度血桐與中平樹的基因組大小相近，兩種材料的基因組大小均比大戟科植物木薯的基因組770 M（Simon et al.， 2012）、蓖麻的基因組350 M（Shusei et al.， 2011）、麻瘋樹的基因組410 M（Chan et al.， 2010），比橡膠樹的基因組1.1 G（Zou & Yang， 2019）要稍小一些，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)橛《妊┡c中平樹屬于大戟科血桐屬植物，而木薯、蓖麻、麻風(fēng)樹與橡膠樹分別為大戟科其他屬植物，結(jié)果顯示屬內(nèi)差異較小，而屬間差異較大，這可能是由于種系發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)、染色體數(shù)目不同或者自交親和現(xiàn)象的出現(xiàn)所導(dǎo)致（周佳熠等，2017）。基因組大小的測(cè)定對(duì)了解物種的生長(zhǎng)發(fā)育、起源進(jìn)化等問(wèn)題具有重大意義。印度血桐與中平樹基因組大小測(cè)定的完成，為研究大戟科血桐屬植物基因組大小變化規(guī)律提供了一定的參考依據(jù)。

判斷測(cè)序數(shù)據(jù)的雜合度有利于尋找合適的基因組拼接方法，根據(jù)雜合度大小可將基因組進(jìn)一步分為微雜合基因組（0.5%≤雜合率<0.8%）、高雜合基因組（雜合率≥0.8%） 以及高重復(fù)基因組（重復(fù)序列比例≥50%）（王雪等，2018）。測(cè)序結(jié)果顯示，印度血桐與中平樹的雜合率分別為0.75%和0.65%，重復(fù)率分別為73.03%和71.6%，兩種植物的基因組都有一定的雜合率以及較高的重復(fù)率，印度血桐與中平樹都屬于雌雄異株的植物，這可能是導(dǎo)致二者含有較高雜合率的原因之一， 因此，使用WGS策略對(duì)印度血桐與中平樹的基因組分析有一定的風(fēng)險(xiǎn)和難度，建議后續(xù)的研究采用二代測(cè)序（Illumina）和三代測(cè)序（PacBio）技術(shù)相結(jié)合的策略，對(duì)印度血桐與中平樹基因組進(jìn)行測(cè)序和組裝，此外，利用Hi-C技術(shù)達(dá)到染色體水平的組裝，多種方法互補(bǔ)，以期獲得兩種材料的高質(zhì)量全基因組圖譜。

SSR分子標(biāo)記具有易操作、多態(tài)性高、成本低、數(shù)量豐富等優(yōu)點(diǎn)。本研究基于印度血桐與中平樹基因組調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR分析發(fā)現(xiàn)，印度血桐中平均2 251 bp出現(xiàn)1個(gè)SSR，中平樹中平均2 348 bp出現(xiàn)1個(gè)SSR，含豐富的重復(fù)類型，結(jié)果顯示兩種材料的SSR分子標(biāo)記具有顯著的堿基偏好性，其單核苷酸重復(fù)模體中A/T含量均高于C/G含量;兩種材料中雙核苷酸重復(fù)模體中含量最高均為AT/AT，含量最低為CG/CG，這可能是甲基化的C殘基變?yōu)門，使得兩種核苷酸重復(fù)的差異較大（周佳煜等，2017）。有研究認(rèn)為基因組中低級(jí)重復(fù)單元較多則表示該物種進(jìn)化水平較高，而高級(jí)重復(fù)單元比例高的物種其進(jìn)化時(shí)間短或變異頻率低（于福來(lái)等，2019）。因此，在基因組調(diào)查測(cè)序的基礎(chǔ)上規(guī)?；_(kāi)發(fā)與篩選SSR分子標(biāo)記，為進(jìn)一步運(yùn)用SSR標(biāo)記在物種遺傳圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析以及QTL定位等方面的研究提供參考。

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（責(zé)任編輯 李 莉）