基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗探討桔梗皂苷D對肝癌細胞遷移侵襲的影響及相關(guān)機制

郭園園，張浩然,2，卓士鉉，楊萬斌，傅鶴群，李雅靜，張正光

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211166）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見消化道惡性腫瘤，死亡率很高。據(jù)報道[1]，全球每年因罹患肝癌而死亡的人數(shù)超過50 萬，其中我國作為肝癌大國，約占總數(shù)的50%。目前臨床上常使用放化療和手術(shù)切除法治療肝癌。由于肝癌發(fā)病具有一定隱匿性，一旦確診即為晚期，僅有20%的患者能夠接受手術(shù)治療[2]。此外，肝癌具有很強的轉(zhuǎn)移侵襲性，手術(shù)愈后不佳，而化學(xué)藥物治療往往存在療效不顯著以及毒副作用強等弊端[3]。因此，尋求一種天然、高效、安全的抗肝癌藥物，尤其是尋找能夠抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的藥物迫在眉睫。桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）作為臨床傳統(tǒng)中藥桔梗的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，具有抗炎、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等多種藥理學(xué)功效[4-7]。已有研究表明[8-11]，PD 能夠有效抑制如膽囊癌細胞、口腔鱗狀細胞癌細胞、子宮內(nèi)膜癌細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞等多種腫瘤細胞的遷移侵襲，而關(guān)于PD 抑制肝癌細胞遷移侵襲的相關(guān)機制尚未完全闡明。人肝母細胞瘤細胞系（human hepatocellular liver carcinoma，HepG2）是目前應(yīng)用最廣泛的人源肝癌細胞系之一，常作為藥物研究的肝癌體外細胞模型。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗方法，初步探究了PD 抑制肝癌HepG2 細胞遷移及侵襲的潛在分子機制，以期為臨床應(yīng)用PD 治療肝癌提供相關(guān)研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、實驗試劑與器材 人肝母細胞瘤（人肝癌）HepG2 細胞株（中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心）；DMEM、新生胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素鏈霉素雙抗（Penicillin-Streptomycin）、胰酶（含0.25%EDTA，酚紅）（美國Gibco 公司）；桔梗皂苷D 藥物粉末（上海源葉生物科技有限公司）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；細胞增殖-毒性檢測（CCK-8）試劑盒（biosharp 公司）；Transwell 小室、Matrigel 基質(zhì)膠（美國Corning-Costar 公司）。

1.1.2 實驗儀器 酶標儀（Bio Tek Instruments Inc.）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories 公司）；超凈臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機、低溫冰箱、電子分析天平、PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）；顯微鏡（Olympus Corporation）；細胞培養(yǎng)箱（上海寶賽生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物及疾病潛在靶標的預(yù)測 通過HERB 數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）查詢PD 可能的匹配靶標，下載并整合相關(guān)靶標信息。通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以“l(fā)iver cancer metastasis”（LCM）為關(guān)鍵詞，檢索肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)靶標信息。通過TBtools 軟件繪制韋恩圖，篩選出PD 與肝癌轉(zhuǎn)移的共同作用靶標。

1.2.2 構(gòu)建疾病-藥物-靶標相關(guān)網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape3.7.1 軟件建立疾病-藥物-靶標相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建并分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 GO 富集分析與KEGG 富集分析 將篩選出的共同作用靶標導(dǎo)入到Rstuio 軟件中，利用“cluster－Profiler”包進行GO 富集分析與KEGG 富集分析。其中GO 富集分析包括3 個部分，分別為生物學(xué)過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）。以P＜0.05 對富集得到的主要BP、CC、MF 及KEGG 信號通路進行篩選并進行可視化分析。

1.2.4 PD 藥液配置 配置濃度為10 μmol/L 的PD母液。使用時，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基和PD 母液配置濃度梯度的溶液[0 μmol/L（對照組）、4、8 μmol/L（PD 給藥組）]，隨后進行相關(guān)實驗。

1.2.5 細胞培養(yǎng)與傳代 使用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基復(fù)蘇HepG2 細胞，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細胞生長至密度為85%左右進行傳代。進行生物學(xué)實驗的HepG2 細胞應(yīng)均處于對數(shù)生長期。

1.2.6 細胞形態(tài)學(xué)觀察 待細胞貼壁生長至65%左右，棄去培養(yǎng)基，用1×PBS 清洗后加入含有不同濃度PD 的DMEM 完全培養(yǎng)基（0、1、2、4、8、16 μmol/L），待培養(yǎng)至24、48 h 時置于顯微鏡下觀察HepG2 細胞生長狀況與細胞形態(tài)。

1.2.7 CCK-8 法篩選合適的PD 給藥濃度 向96 孔板中加入100 μl 的細胞懸液，24 h 后細胞貼壁棄去原培養(yǎng)液，向每孔中加入含不同濃度PD 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，隨后加入CCK-8 液，于37 ℃孵育1 h，使用酶標儀檢測其在450 nm 處的OD 值，實驗至少重復(fù)3 次。

1.2.8 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 將細胞接種于96 孔的細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl 的細胞懸液，待培養(yǎng)至48 h 時棄去原培養(yǎng)液，加入含有CCK8液孵育1 h，使用酶標儀檢測其在450 nm 處的OD值，實驗至少重復(fù)3 次。

1.2.9 傷口愈合實驗 預(yù)處理細胞48 h 后，使用200 μl無菌槍頭在6 孔板中劃出直線，PBS 洗去多余的細胞碎片后，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、36 h 時拍照觀察，實驗至少重復(fù)3 次。

1.2.10 Transwell 遷移和侵襲實驗 在遷移實驗中，向Transwell 上室中加入100 μl 不含有血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，下室加入含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基500 μl，分別于6、12、24 h 取出小室，PBS 洗滌3 次，用棉簽擦去微孔濾膜上室殘留細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS 洗滌后風(fēng)干。將小室置于載玻片上用顯微鏡觀察穿過濾膜的細胞并計數(shù)。每組以5 個視野的細胞進行計數(shù)，實驗至少重復(fù)3 次。侵襲實驗與遷移實驗操作步驟基本相同，區(qū)別在于在小室上室中鋪上了稀釋后的基質(zhì)膠（以無血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋8 倍）。

1.2.11 Western Blot（WB）實驗 將細胞接種至6 孔板中，將細胞預(yù)處理48 h 后，棄去培養(yǎng)液。用PBS 清洗后，于每孔中加入的適量RIPA 裂解液（強），用細胞刮收集細胞裂解液，置于1.5 ml 離心管中，反復(fù)吹打。使用4 ℃高速冷凍離心機，以12 000 g 離心15 min。使用BCA 法測定并統(tǒng)一蛋白濃度。上樣后，通過SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、孵育一抗、孵育二抗、曝光等步驟檢測相關(guān)蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用Image J 對圖像數(shù)據(jù)進行比對分析，使用GraphPad Prism9 進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測PD 及肝癌轉(zhuǎn)移的共同作用靶標 通過HERB 數(shù)據(jù)庫及PharmMapper 數(shù)據(jù)庫查詢PD 可能的匹配靶標（Norm Fit＞0.7），下載并整合相關(guān)靶標信息，共得到PD 可能的靶標共47 個。通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫收集肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)靶標8973 個，見圖1。通過TBtools 軟件繪制韋恩圖，篩選出PD與肝癌轉(zhuǎn)移的共同作用靶標有43 個，分別為CASP3、CASP8、EGFR、ESR1、GATA3、IFNG、IL2、IL4、IL10、MMP9、NOS2、RELA、TNF、IKBKG、CA2、HCK、F2、BCHE、PIM1、CDK2、TTR、CFB、MAPK10、CA1、TREM1、CDK5R1、MAPK8、NR1H2、GSR、AURKA、AR、HSPA8、ANG、ESR2、CDK6、PDPK1、PGR、SRC、NQO1、HSD17B1、AKR1B1、MTAP、SHBG。使用Cytoscape 軟件建立疾病-藥物-靶標相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖1 PD 與肝癌轉(zhuǎn)移共同作用靶標的韋恩圖

圖2 Cytoscape 軟件建立疾病-藥物-靶標相關(guān)網(wǎng)絡(luò)

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將43 個共同作用靶標輸入到STRING 網(wǎng)站，構(gòu)建PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，通過Cytoscape 軟件中CytoHubba 插件的MCC 算法篩選出排名前10 的核心靶標，分別為CASP3、SRC、RELA、TNF、MMP9、EGFR、IL10、IL4、CASP8、MAPK8,見圖3。

圖3 PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心靶標篩選

2.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析顯示，PD抗肝癌轉(zhuǎn)移涉及到1476 個相關(guān)生物學(xué)過程，包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（regulation of inflammatory response，GO:0050727）、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress，GO:0062197）、外部凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway，GO:0097191）、細胞內(nèi)受體信號通路（intracellular receptor signaling pathway，GO:0030522）等；涉及到9 個細胞組分，包括焦點粘附（focal adhesion，GO:0005925）、細胞-底物連接（cell-substrate junction，GO:0030055）、膜筏（membrane raft，GO:0045121）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain，GO:0098857）、膜區(qū)域（membrane region，GO:0098589）等；涉及到76 個分子功能，包括細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding，GO:0005126）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity，GO:0004674）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding，GO:0031625）等，見圖4。KEGG 富集分析顯示，PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移涉及到的相關(guān)信號通路包括白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway，hsa04657）、T 細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway，hsa04660）、C型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway，hsa04625）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway，hsa04668）等，見圖5。

圖4 PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移的GO 富集分析

圖5 PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移的KEGG 富集分析

2.4 PD 對HepG2 細胞形態(tài)的影響 對照組（0 μmol/L）的HepG2 細胞生長狀況良好，而給藥組HepG2 細胞形態(tài)均發(fā)生了不同程度的改變，包括皺縮、細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡、凋亡等現(xiàn)象。隨著PD 濃度的升高，HepG2 細胞形態(tài)變化愈發(fā)顯著，見圖6。

圖6 顯微鏡下不同PD 濃度預(yù)處理24 h 的HepG2 細胞形態(tài)圖

2.5 PD 最適給藥濃度分析 CCK-8 實驗顯示，當(dāng)藥物濃度為0.5～4 μmol/L 時，其在450 nm 處吸光度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而當(dāng)藥物濃度為≥8 μmol/L 時，其在450 nm 處吸光度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即PD 的最適給藥濃度為8 μmol/L，見圖7。

圖7 PD 最適給藥濃度分析

2.6 PD 對HepG2 細胞增殖能力的影響 與對照組相比，當(dāng)PD 的濃度達到4 μmol/L 與8 μmol/L 時，細胞的增殖能力均受到抑制，并呈劑量依賴性降低，見圖8。

圖8 不同PD 給藥濃度處理的HepG2 細胞活性變化圖

2.7 PD 對HepG2 細胞遷移侵襲能力的影響 對照組HepG2 細胞的劃痕愈合率為（70.32±0.49）%；PD給藥組4 μmol/L 的劃痕愈合率為（33.764±2.54）%；8 μmol/L 的劃痕愈合率為（20.25±2.01）%，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖9。為了進一步證實PD 對于HepG2 細胞遷移侵襲能力的抑制作用，Transwell 遷移實驗結(jié)果顯示，PD 給藥后HepG2 細胞遷移能力受到明顯的抑制，結(jié)果與傷口愈合實驗吻合，見圖10；侵襲實驗結(jié)果顯示，PD 給藥后HepG2 細胞的侵襲能力亦受到明顯抑制，結(jié)果與遷移實驗相同，見圖11。

圖9 不同濃度PD 預(yù)處理的HepG2 細胞0、36 h 的劃痕圖（200×）及愈合率定量圖

圖10 Transwell 遷移實驗結(jié)果

圖11 Transwell 侵襲實驗結(jié)果

2.8 E-cadherin 蛋白表達水平分析 WB 實驗顯示，與對照組相比，PD 給藥組E-cadherin 表達量升高，見圖12。

圖12 PD 抑制轉(zhuǎn)移與粘附標志物蛋白E-cadherin 的表達水平

3 討論

肝癌作為一種極常見的消化道惡性腫瘤，具有臨床治愈率低、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良等特點，已成為致死率極高的癌癥之一，對人類生命健康造成了極大威脅[12-14]?，F(xiàn)今多項研究證實[15-18]，中醫(yī)藥在包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的治療中療效確切，具有廣闊的發(fā)展前景。相比西醫(yī)的手術(shù)、放化療等常規(guī)治療方法，中醫(yī)藥療法已有效應(yīng)用于腫瘤治療的各個領(lǐng)域，其中中藥復(fù)方及其單體具有低毒、高效、安全等特點，已在癌癥臨床治療中被廣泛使用，如參芪扶正注射液、消癌平注射液、欖香烯注射液等，在臨床惡性腫瘤的治療中扮演著重要角色，亦可與西醫(yī)常規(guī)抗癌手段相結(jié)合，體現(xiàn)中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤的特色。

傳統(tǒng)中草藥桔梗作為中醫(yī)臨床傳統(tǒng)用藥，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿等功效，常被用于肺部相關(guān)疾病的治療，而桔梗的主要藥效成分之一——PD，其近年來已成為研究熱點。目前，PD 的抗癌作用已在多項研究中得到確證，其生物學(xué)過程涉及抑制腫瘤細胞增殖、抗血管生成、誘導(dǎo)自噬性死亡、促進細胞凋亡等多個方面[19-22]。同時，PD 已經(jīng)被證實能夠有效抑制多種腫瘤細胞的遷移與侵襲行為，但PD 抑制肝癌細胞的遷移侵襲的機制尚未完全闡明。本研究以此為切入點，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗出發(fā)，探究了PD 抑制肝癌細胞遷移侵襲的潛在分子機制，以期為臨床利用PD 治療肝癌提供相關(guān)理論與實驗支撐。本實驗先從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)，初步探討了PD抗肝癌轉(zhuǎn)移可能的分子機制，其中韋恩圖顯示PD與肝癌轉(zhuǎn)移共有14 個共同靶標；GO 富集分析表明，相關(guān)靶標的生物學(xué)過程涉及到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及正性調(diào)控細胞間粘附等關(guān)鍵途徑；KEGG 通路分析顯示，PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移可能與包括白介素-17 信號通路、T 細胞受體信號通路等密切相關(guān)。體外實驗則以人肝母細胞瘤HepG2 細胞株作為研究對象，首先通過對細胞進行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PD給藥組中細胞皺縮變圓、出現(xiàn)空泡，死亡細胞明顯增多；隨后通過CCK-8 實驗、傷口愈合實驗、Transwell實驗進一步確證PD 能夠抑制肝癌HepG2 細胞增殖、遷移及侵襲行為；且WB 實驗結(jié)果顯示，PD 可能是通過上調(diào)細胞粘附的關(guān)鍵標志物E-cadherin 蛋白的表達，正性調(diào)控細胞粘附的生物學(xué)過程，從而抑制肝癌細胞的遷移侵襲能力。

本研究尚存在一定不足，今后將對相關(guān)靶標及信號通路進行進一步驗證，以深入探索PD 抗肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制，同時亦會開展體內(nèi)相關(guān)研究，為將來臨床有效利用PD 治療肝癌轉(zhuǎn)移提供參考。