一種國產新型冠狀病毒核酸快速檢測分析儀的性能驗證

劉文明 江濤 吳友琴 湯思曼 中信惠州醫(yī)院檢驗科 （廣東 惠州 516006）

內容提要： 目的：評估國產新型冠狀病毒核酸快速檢測分析儀優(yōu)思達UC0108的性能，是否滿足臨床對SARS-CoV-2快速核酸檢測要求。方法：依據(jù)CNAS-GL039:2019等相關標準和文件，使用國家和廣東省臨檢中心新冠核酸室間質評樣品、第三方廠家質控品等，對杭州優(yōu)思達UC0108新冠核酸快速檢測分析儀（含配套試劑盒、耗材）的方法符合率、檢出限、交叉反應、抗干擾能力和重復性進行性能驗證，驗證結果在廠家聲明的性能指標范圍內或是滿足本實驗室的執(zhí)行標準為驗證通過。結果：通過檢測國家和廣東省臨檢中心室間質評樣品5例陰性和15例陽性，方法符合率均100%。通過對邦德盛新冠核酸標準物質稀釋至廠家聲明的檢測限濃度200copies/mL，重復測定5次，100%檢出靶核酸?？垢蓴_能力挑選人類血液（1%）和利巴韋林進行驗證，重復測定3次，弱陽性樣本仍為弱陽性結果。交叉反應挑選流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌進行驗證，重復檢測3次，均為陰性。重復性驗證通過2人、20d、2批次試劑盒對昆淶生物陰性和弱陽性質控品進行檢測，符合率100%。結論：杭州優(yōu)思達UC0108新冠核酸快速檢測分析儀檢測SARS-CoV-2方法符合率、檢出限、交叉反應、抗干擾能力、重復性等性能指標達到廠家聲明的性能指標，可滿足新冠核酸快速檢測要求。

2019年12月爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）為新發(fā)急性呼吸道傳染病，它是由新型冠狀病毒（SARSCoV-2）感染導致，其傳染性強，對人類健康和經(jīng)濟生活造成重大影響。新冠核酸檢測是新型冠狀病毒肺炎診斷、治療效果、發(fā)生疫情時人群篩查及流行病學調查的重要手段[1]。利用實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸，由于其靈敏度高，特異性強，是現(xiàn)階段檢測新冠病原體的主要手段。但其檢測過程繁瑣，時間過長，技術要求高，難以實現(xiàn)對標本的快速現(xiàn)場檢測。為縮短檢測時間，減少實驗過程中對輔助儀器設備、PCR實驗室建設的要求，因此許多基于核酸等溫擴增技術的SARS-CoV-2快速核酸檢測分析儀相繼誕生，可實現(xiàn)新冠核酸的現(xiàn)場快速篩查[2]。依據(jù)中國合格評定國家認可委員會（CNAS）頒布的CNAS-CL02:2012《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則》及分子診斷領域的應用說明（CNASCL02-A009:2018）要求，開展檢驗項目前需對檢測系統(tǒng)進行性能驗證，是否滿足臨床診療要求，PCR定性檢測項目驗證至少應包括方法符合率、檢出限、抗干擾能力、交叉反應等[3,4]。本研究參照CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[5]，對杭州優(yōu)思達公司生產的UC0108新冠核酸快速檢測分析儀進行性能驗證，結果如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

符合率驗證采用2021年全國新冠核酸室間質評樣本和2021年廣東省新冠核酸室間質評樣本；檢出限驗證采用廣州邦德盛生物科技有限公司新冠核酸標準物質（編號：GBW(E)091132）；重復性驗證采用上海昆淶生物科技有限公司弱陽性2019-nCoV核酸非定值質控品828-B（批號：4EFC3DB）和陰性2019-nCoV核酸非定值質控品827-N（批號：4EDEEB7）。

1.2 儀器與試劑

杭州優(yōu)思達生物技術有限公司生產的核酸擴增檢測分析儀，型號：UC0108；配套優(yōu)思達新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-實時熒光法）。

1.3 方法

1.3.1 檢測系統(tǒng)采用交叉引物恒溫擴增技術（CPA）檢測新型冠狀病毒的ORFlab基因和N基因。接受過上崗培訓和考核的持證工作人員按照儀器和試劑說明書編寫的SOP規(guī)范操作，檢測樣本，檢測程序運行結束后，儀器自動報告陰/陽性。

1.3.2 符合率驗證：通過檢測2021年（第一次和第二次）全國臨檢中心新冠核酸室間質評樣本；2021年（第一次和第二次）廣東省臨檢中心新冠核酸室間質評樣本，進行符合率計算，符合率100%為驗證通過。

1.3.3 檢出限驗證：優(yōu)思達試劑盒說明書聲明的最低檢測限為200 copies/mL。將濃度為2.0×105copies/mL的廣州邦德盛新冠核酸標準物質（編號：GBW(E)091132）用采樣液稀釋為200 copies/mL，重復測定5次，100%檢出靶基因為驗證通過。

1.3.4 重復性驗證：利用上海昆淶生物新冠核酸弱陽性質控品828-B（批號：4EFC3DB）和陰性質控品827-N（批號：4EDEEB7）進行20d、2人、2批次試劑每日質控檢測，弱陽性質控品檢測結果均為陽性、陰性質控品均為陰性為驗證通過。

1.3.5 干擾物質驗證：根據(jù)試劑說明書，通過對加入了內源性干擾物質人類血液（1% V/V）和外源性干擾物質利巴韋林（150μg/mL）上海昆淶生物新冠核酸弱陽性質控品828-B（批號：4EFC3DB），重復測定3次。100%為陽性為通過驗證。

1.3.6 交叉反應驗證：根據(jù)試劑說明書，選擇加入本科室微生物室經(jīng)鑒定后的流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌滅活培養(yǎng)物的樣本采集管中進行檢測，重復測定3次，結果均為陰性為驗證通過。

2.結果

2.1 符合率

全國臨檢中心2021年（第1次和第2次）新冠核酸室間質評樣本檢測結果：樣本編號202111、202112、202113、202114、202121、20222、202123、202125均為陽性；樣本編號202115、202124均為陰性。廣東省臨檢中心2021年（第1次和第2次）新冠核酸室間質評樣本檢測結果：樣本編號20200301、20200302、20200303、20200305、20210201、20210203、20210205結果均為陽性；樣本編號20200304、20210202、20210204結果均為陰性。5例陰性標本全部檢測為陰性，陰性符合率100%；15例陽性樣本全部檢測為陽性，陽性符合率100%；總符合率為100%，驗證通過，結果見表1。廣東省臨檢中心室間質評樣本靶基因檢測結果：樣本編號20200301、20200302、20200303、20200305、20210201、20210203、20210305 ORFlab基因和N基因均為陽性；20200304、20210202、20210204 ORFlab基因和N基因均為陰性，與預期結果一致，符合率100%。結果見表2。

表1. 符合率驗證結果表

表2. 靶基因符合率結果表

2.2 檢出限

對試劑說明書聲明的最低檢測限200 copies/mL樣本經(jīng)5次重復檢測，100%檢測出靶基因。結果見表3。

表3. 檢測限驗證結果表

2.3 抗干擾能力

重復測定3次加入了內源性干擾物質人類血液和外源性干擾物質利巴韋林的昆淶弱陽性質控品，100%陽性，驗證通過。

2.4 交叉反應

重復測定3次加入了流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯氏菌滅活培養(yǎng)物的樣本采集管，結果均為陰性，驗證通過。

2.5 重復性

通過進行20d、2人、2批次試劑對昆淶陰性和弱陽性質控品的檢測，結果陰性質控均為陰性，弱陽性質控結果均為陽性，符合率100%。人員比對、日內日間重復性、試劑批內批間重復性驗證通過。

3.討論

在我國高效的抗疫防控措施下，國內疫情得到有效控制，但由于境外新冠肺炎疫情仍在暴發(fā)流行，我國存在疫情輸入和擴散風險。根據(jù)最新國家新冠肺炎診療方案第8版，確診新冠肺炎金標準仍為新冠病毒核酸檢測。通過篩查感染者并及時進行隔離是防控疫情的關鍵手段，在疫情爆發(fā)初期，快速進行確診和排除是疫情防控的首要任務。逆轉錄實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于其高靈敏度和高特異性，是目前SARS-CoV-2核酸檢測的首選方法。但其檢測過程中步驟過多，經(jīng)核酸提取、變性、退火、延伸等使整個擴增檢驗時間較長，且對操作人員、設備及實驗室環(huán)境等有較高要求[6]，不適合現(xiàn)場快速核酸檢測。核酸恒溫擴增技術無需熱循環(huán)儀，擴增效率高、檢測速度快，適合于新冠核酸的快速檢測。目前主要的恒溫擴增技術有依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）、重組酶聚合酶擴增技術（RPA）、環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）、智能擴增反應（SMAP）、交叉引發(fā)擴增技術（CPA）等[7]。為達到新冠核酸檢測的快捷簡便，基于恒溫擴增方法的儀器進入臨床應用，有向即時檢測

參考文獻（POCT）方向發(fā)展的趨勢，但暫時達不到POCT的要求，行業(yè)里對這類型儀器使用“快速檢測”來表述。杭州優(yōu)思達UC0108即采用交叉引物恒溫擴增技術（CPA）檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）特異性的ORFlab基因和N基因，實現(xiàn)“一管式“的全自動核酸分析即在一個密閉的檢測管內完成裂解結合、清洗、洗脫和擴增反應，最快完成一個標本檢測79min。

在正式用于患者標本檢測前，對儀器分析系統(tǒng)進行性能驗證，確認檢測系統(tǒng)符合臨床應用要求方可用于常規(guī)檢測?；诤怂岷銣財U增技術的核酸快速檢測系統(tǒng)近期在我國大量出現(xiàn)用于臨床，在一定程度上縮短了檢測時間，減少了所需的輔助設備，降低了對實驗室的要求，但其應用時間不長，各個儀器廠家和各種技術原理并不一致，所以對其進行系統(tǒng)詳細的性能驗證和評價至關重要。相關國家標準也要求在正式用于患者標本檢測前，對儀器分析系統(tǒng)進行性能驗證，確認檢測系統(tǒng)符合臨床應用要求方可用于常規(guī)檢測。

現(xiàn)階段基于恒溫擴增技術的新冠核酸快速檢測儀相對于常規(guī)的RT-PCR新冠核酸檢測，樣本檢驗全程所用時間明顯縮短，儀器一般具有小型化、一體化的特點?？勺鰹槌Ｒ?guī)新冠核酸檢測的補充，在特定情形下需盡快獲得檢驗結果、標本較少、實驗室條件有限等，可考慮采用新冠快速檢測，為經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)和基層醫(yī)療機構提供了有力的防疫保障。由于其通量一般較小，也不適合大量人群篩查。由于新冠肺炎疫情突發(fā)，基于恒溫擴增技術的分析系統(tǒng)研發(fā)時間和審批時間較短，臨床應用時間不長，其技術成熟度、儀器穩(wěn)定性、檢測性能還需進一步觀察，也不建議用于疑似患者的確診、確診患者的療效觀察以及高風險人群的檢測。

本研究對杭州優(yōu)思達生物技術有限公司的UC0108新冠核酸快速檢測分析儀的重復性、方法符合率、交叉反應、干擾物質、最低檢測限等性能參數(shù)進行了驗證，結果表明該系統(tǒng)性能良好，能滿足實驗室的新冠核酸的檢測要求。但本研究僅對其中二個試劑批號做了驗證，交叉反應和干擾物質選定的研究對象較少，不能反映檢測系統(tǒng)的整體質量和性能，可進一步收集不同地區(qū)的樣本，多中心實驗室進行驗證，以便實驗室選擇合適的儀器提供參考。