枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物對(duì)鯉魚生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、免疫指標(biāo)及抗氧化功能的影響

王紅濤，馮 穎，明美玉，陳之恒，宋婧婧，孫 瑩，肖 智

（通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林通化 134002）

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的病害甚至重大疾病頻發(fā)。由于傳統(tǒng)抗菌藥物具有在動(dòng)物體內(nèi)殘留、引起病原菌的耐藥性等缺點(diǎn)，而水生食品的安全問題也備受關(guān)注?，F(xiàn)如今，中草藥和益生菌作為兩大類新型飼料添加劑，均具有無(wú)毒害、無(wú)藥殘、功能全面等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，已得到廣泛關(guān)注并成為研究熱點(diǎn)。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的優(yōu)勢(shì)益生菌之一，不僅可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生各種消化酶，提高飼料利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高免疫功能，還具有抑制致病菌群的生長(zhǎng)繁殖、維持腸道微生態(tài)平衡等多種功能[3-4]；蒲公英屬菊科多年生草本植物，為藥食同源藥材[5]，其提取物中含有蒲公英醇、多糖類、有機(jī)酸、生物堿及皂苷等多種活性成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、保護(hù)肝臟、降血糖、抗氧化等生物功能[6]。近年來(lái)，已有研究表明，蒲公英及其提取物作為飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于魚[7]、雞[8]及豬[9]等動(dòng)物中，可直接補(bǔ)充物質(zhì)能量，促進(jìn)動(dòng)物食欲、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，還可通過預(yù)防疾病來(lái)確保動(dòng)物健康生長(zhǎng)[7]。

飼料中添加中草藥和益生菌可使兩者發(fā)揮協(xié)同作用優(yōu)勢(shì)。然而，目前關(guān)于將枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物復(fù)配應(yīng)用到魚類飼料中的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探討日糧中添加枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物對(duì)鯉魚生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、免疫指標(biāo)及抗氧化功能的影響，為枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物二者復(fù)合在魚類生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 枯草芽孢桿菌由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司菌種保藏中心提供。在使用之前，采用振蕩器在30℃有氧條件（150 r/min）LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，備用，其中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為2×107CFU/g。

全株蒲公英樣品購(gòu)買于西安圣青生物科技有限公司，參考吳曉麗等[10]方法制備蒲公英提取物，提取物主要組成為總黃酮和多糖，其含量分別為5.51% 和14.91%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取720 條健康無(wú)病、初始體重（31.56±2.31）g 和體長(zhǎng)（16.78±0.96）cm 的鯉魚（吉林省通化市某水產(chǎn)養(yǎng)殖廠），預(yù)試驗(yàn)為14 d，正式試驗(yàn)周期為56 d。飼養(yǎng)于室內(nèi)玻璃水族箱（1 m×0.5 m×0.5 m）中，每個(gè)魚池中放養(yǎng)30 條，隨機(jī)分為4 組，每組6 個(gè)重復(fù)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加2×107CFU/g、100 mg/kg 蒲公英提取物、2×107CFU/g枯草芽孢桿菌+100 mg/kg 蒲公英提取物，添加量參照前人研究結(jié)果[11-12]飼喂，各組間飼養(yǎng)管理無(wú)差異，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)原料經(jīng)粉碎過120 mm 目篩。在冷卻條件下，將枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物復(fù)配與基礎(chǔ)日糧分混合，制成直徑為2.0 mm 的顆粒，存放在4℃冰箱中備用。預(yù)試期為14 d，正試期為56 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 飼養(yǎng)管理 各組飼養(yǎng)管理一致。試驗(yàn)期間，水溫控制在（22.5±2.0）℃，溶解氧為（6.05±0.14）mg/L，pH 為（7.53±0.02），亞硝酸鹽＜0.05 mg/L，每天換去水族箱內(nèi)1/3 水并換洗濾布。日投喂量為每組魚總重的2%，每天2 次（09:00，16:00）向魚提供飼料。自然光周期（約13 h 光照:11 h 黑暗）。

1.4 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將魚禁食24 h，然后再收集樣品，從每組中隨機(jī)取12 條魚，用注射器尾靜脈采血，4℃靜置2 h，待血液凝固析出血清后，用冷凍離心機(jī)4℃、8 000 r/min 離心20 min，分離出血清，用于測(cè)定血清生化指標(biāo)。將魚采血后立即剖開腹部，剝離出肝臟并稱重，用生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，肝臟和生理鹽水按1:9（m/V）的比例冰浴勻漿，用冷凍離心機(jī)4℃、8 000 r/min 離心20 min，取上清液測(cè)定抗氧化指標(biāo)。試驗(yàn)魚用300 mg/L 的甲烷磺酸鹽222（MS-222）安樂死，將所有樣品冷凍在液氮中，并在-80℃下保存直至試驗(yàn)測(cè)定。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.5.1 生產(chǎn)性能 試驗(yàn)初始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將試驗(yàn)魚禁食24 h，統(tǒng)計(jì)每組存活條數(shù)，測(cè)量每組標(biāo)記魚的體重和體長(zhǎng)，記錄投料量和采食量，生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算公式：

增重率（WGR）=（最終均重－初始均重）/初始均重×100%

特定生長(zhǎng)率（SGR）=100%×（ln 最終長(zhǎng)度－ ln初始長(zhǎng)度）/天數(shù)

肥滿度（CF）=最終重量/最終體長(zhǎng) ×100%

存活率（SR）=最終條數(shù)/初始條數(shù)×100%

飼料系數(shù)（FCR）=飼料攝入量/（最終總重量－初始總重量）

1.5.2 血清生化指標(biāo)、免疫指標(biāo) 總蛋白（TP）采用雙縮脲法，白蛋白（ALB）采用溴甲酚綠法，球蛋白（GLB）采用酶聯(lián)免疫法，甘油三酯（TG）、膽固醇（CHO）采用酶終點(diǎn)比色法，血糖（GLU）采用己糖激酶法，肌酐（Cr）采用堿性苦味酸法，堿性磷酸酶（ALP）活性采用AMP 緩沖液法，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT ）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）采用酶連續(xù)測(cè)定法，均使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

免疫球蛋白IgM 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），補(bǔ)體3（C3）和補(bǔ)體4（C4）采用免疫透射比濁法，血清溶菌酶（LSZ）含量采用比濁法，均使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 肝臟抗氧化指標(biāo) 谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定，并嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007 處理及SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚生長(zhǎng)性能的影響 由表2 可知，枯草芽孢桿菌組+蒲公英提取物組WGR 高于其他各組（P＜0.05）；此外，枯草芽孢桿菌組與蒲公英提取物組WGR 之間差異不顯著?？莶菅挎邨U菌+蒲公英提取物組FCR 分別比對(duì)照組、枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組降低39.63%、21.23%、10.35%（P＜0.05）。各組SGR、CF 和SR 之間無(wú)顯著差異，但枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組魚的FBW 高于其他各組（P＜0.05）。

表2 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚生長(zhǎng)性能的影響

2.2 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚血清生化、免疫指標(biāo)的影響 由表3 可知，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及兩者復(fù)合組的TP、GLB 和TG 含量與對(duì)照組均無(wú)顯著差異，各試驗(yàn)組ALB 含量均高于對(duì)照組（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組、枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組GLU 含量低于對(duì)照組（P＜0.05），而枯草芽孢桿菌組GLU 含量略低于基礎(chǔ)日糧組（P＞0.05），枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組、枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組血清中CHO 濃度較對(duì)照組分別降低25.98%、31.52%、38.25%（P＜0.05），蒲公英提取物組、枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物組Cr 含量較對(duì)照組均降低（P＜0.05），各組間鯉魚ALP 活性均無(wú)顯著性差異，3 個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，血清ALT、AST 含量均降低（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組與蒲公英提取物組差異不顯著，且枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組魚的血清ALT 含量最低。

表3 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚血清生化指標(biāo)的影響

由表4 可知，與對(duì)照組相比，3 個(gè)試驗(yàn)組魚的免疫球蛋白IgM 含量、血清LZM 均提高（P＜0.05），C3、C4 活性均增加（P＜0.05），其中枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組各指標(biāo)含量最高。

表4 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚免疫指標(biāo)的影響

2.3 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚肝臟抗氧化功能的影響 由表5 可知，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及兩者復(fù)合組魚肝臟MDA 含量均較對(duì)照組降低（P＜0.05），且GSH-Px、GST、CAT 活性高于對(duì)照組；枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組的T-AOC、SOD 活性高于其他組（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組與蒲公英提取物組間無(wú)顯著性差異。

表5 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚肝臟抗氧化功能的影響

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚生長(zhǎng)性能的影響 本試驗(yàn)結(jié)果表明，鯉魚飼料中添加枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及兩者復(fù)合物 均可提高鯉魚的WGR，使其FCR 降低，從而提高了飼料轉(zhuǎn)化率，而兩者復(fù)合使用效果更顯著，說明飼料中添加枯草芽孢桿菌+蒲公英對(duì)鯉魚的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。趙倩等[13]研究也表明，在鯉魚日糧中添加2%、3% 枯草芽孢桿菌發(fā)酵中藥制劑可顯著提高鯉魚的生長(zhǎng)性能?？莶菅挎邨U菌也是鯉魚腸道內(nèi)重要的益生菌。在鯉魚日糧中添加枯草芽孢桿菌提高了鯉魚腸道菌群豐度，并降低有害菌數(shù)量，從而改善鯉魚腸道健康，提高了腸道的營(yíng)養(yǎng)利用率，進(jìn)而提高了鯉魚的生長(zhǎng)性能[14]。何偉聰?shù)萚15]研究也表明，投喂枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌混合物為2×107CFU/g 時(shí)，軍曹魚幼魚增重率明顯提高，飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照組。研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英提取物能夠促進(jìn)鯽魚生長(zhǎng)，提高鯽魚消化道內(nèi)胃蛋白酶和淀粉酶活性[12]。此外，本研究結(jié)果還表明，枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物對(duì)鯉魚飼料轉(zhuǎn)化率的提高優(yōu)于單獨(dú)添加。

3.2 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚血清生化、免疫指標(biāo)的影響 血清生化指標(biāo)常用來(lái)評(píng)價(jià)魚體健康和營(yíng)養(yǎng)狀況等，血清TP、ALB、GLB、TG、GLU、CHO含量可以反映機(jī)體蛋白質(zhì)、脂類吸收與代謝狀況[16]。血清TP 包括ALB 和GLB，血清ALB 維持血漿膠體滲透壓，GLB 參與機(jī)體特異性免疫，在機(jī)體中具有重要的生理功能[17]。不同濃度的枯草芽孢桿菌發(fā)酵中藥制劑可以提高鯉魚TP 含量[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及兩者復(fù)配組TP 含量與與對(duì)照組無(wú)顯著差異，這一結(jié)論與前人研究結(jié)果不同，這可能是本研究所使用的為枯草芽孢桿菌，而其他研究所使用的為枯草芽孢桿菌中藥制劑，其中含有一些特殊成分，而導(dǎo)致鯉魚血清中TP 含量升高。彭小玉等[12]研究表明，日糧中添加蒲公英提取物可顯著改善鯽魚生長(zhǎng)性能，但對(duì)鯽魚血清TP、TG 含量均無(wú)顯著影響，此研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)論相似。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物、兩者復(fù)合物均使GLU 濃度降低，而蒲公英提取物組和兩者復(fù)合組GLU 濃度下降更顯著，這與蒲公英提取物具有降血糖作用[18]基本一致，推測(cè)蒲公英提取物具有降血糖作用，可能是由于減少了腸道吸收GLU 入血，且枯草芽孢桿菌對(duì)機(jī)體糖類代謝有調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組、枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組鯉魚血清中CHO 濃度均顯著降低，可能是由于蒲公英提取物中含有低聚糖。有研究發(fā)現(xiàn)低聚糖能有效降低CHO 含量[19]。李美菊[7]研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英提取物能使CHO 濃度降低，改善羅非魚血液生化指標(biāo)，與本研究結(jié)果基本一致。Cr為肌酸的代謝產(chǎn)物，主要由腎小球?yàn)V過后排出體外，當(dāng)腎功能發(fā)生明顯障礙時(shí)，肌酐含量上升[20]，本研究結(jié)果表，試驗(yàn)組Cr 含量略低于對(duì)照組，表明枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及二者復(fù)合對(duì)魚體腎功能無(wú)損傷作用。ALP 是一種非特異性表達(dá)的酶，也是機(jī)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)酶[21]。本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及二者復(fù)合組ALP 活性與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，這表明添加枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物以及二者復(fù)配物不會(huì)對(duì)鯉魚機(jī)體健康帶來(lái)不利影響。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在日糧中添加枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及二者復(fù)合均可明顯提高鯉魚LSZ 活性，從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫的功能，與前人研究結(jié)果[11]一致。AST、ALT 是反映肝功能的2 種重要指標(biāo)[22]。本試驗(yàn)研究顯示，在飼料中添加枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物可顯著降低鯉魚AST、ALT。李樹鵬等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，黃芪多糖、益生菌和合生元組21 日齡和42 日齡雛雞的AST 均下降。血清IgM、C3、C4 及LZM 是反映動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物可顯著提高鯉魚血清IgM 含量，表明其可增強(qiáng)鯉魚的免疫功能；各試驗(yàn)組血清C3、C4 含量顯著高于對(duì)照組。程遠(yuǎn)等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，0.09%～0.18% 枯草芽孢桿菌組吉富羅非魚幼魚魚血清C3 含量較對(duì)照組顯著升高。

3.3 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對(duì)鯉魚肝臟抗氧化功能的影響 抗氧化指標(biāo)與動(dòng)物機(jī)體健康程度、體內(nèi)代謝、外界內(nèi)氧自由基代脅迫環(huán)境的變化和免疫能力均具有密切相關(guān)性[3]。T-AOC 可作為抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)；SOD 活性與水生生物的免疫水平密切相關(guān)，對(duì)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能具有重要作用；CAT 可清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷；DMA 是脂質(zhì)過氧化物的主要分解產(chǎn)物，可反映細(xì)胞受損傷程度及脂質(zhì)過氧化程度[26]。由于蒲公英提取物中含有綠原酸，可清除體內(nèi)自由基[9]，而枯草芽孢桿菌作為一種良好的免疫激活劑，可有效增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高抗氧化活性[16]。趙倩等[14]采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵中藥制劑飼喂鯉魚56 d，結(jié)果表明，試驗(yàn)組的T-AOC、SOD、CAT 均不同程度提高，F(xiàn)CR、MDA 含量不同程度降低；沈文英等[27]在飼料中添加枯草芽孢桿菌投喂草魚，其血清T-AOC、SOD 和CAT 活性較對(duì)照組均顯著提高，而試驗(yàn)組血清MDA 含量顯著降低，表明枯草芽孢桿菌對(duì)草魚抗氧化能力均有促進(jìn)作用；本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及兩者復(fù)合組鯉魚血清 T-AOC、SOD、CAT、GST 及GSH-Px 活性較對(duì)照組顯著增加，而MDA 活性顯著下降，表明枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及兩者復(fù)合可誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，飼料中添加枯草芽孢桿菌與蒲公英提取物可發(fā)揮協(xié)同作用，可為魚類生長(zhǎng)性能、免疫功能、抗氧化能力的研究提供理論依據(jù)，推測(cè)蒲公英提取物可能促進(jìn)益生菌的增殖，而益生菌可以促進(jìn)蒲公英提取物的吸收利用。關(guān)于芽孢桿菌與蒲公英提取物復(fù)合使用的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在日糧中添加枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物能明顯促進(jìn)鯉魚WGR、提高FCR 及改善血液生化指標(biāo)、增強(qiáng)抗氧化能力并提高其免疫功能，且枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物復(fù)合使用比單一添加效果更好。由于益生菌與藥食同源植物具有相互協(xié)同作用，不僅可以發(fā)揮益生菌的優(yōu)勢(shì)，又可提高藥食同源植物的吸收率，因此二者復(fù)合作為飼料添加劑具有較好的發(fā)展前景。