鎘誘導(dǎo)大鼠肝臟氧化損傷模型的建立

高溫婷，王金榮*，唐桂芬，蘇蘭利，喬漢楨，張亞坤，李林儒

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450011）

氧化應(yīng)激是指動(dòng)物機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的高活性分子如活性氧（ROS）和活性氮（RNS），導(dǎo)致細(xì)胞和組織的氧化性損傷[1]。在現(xiàn)代化養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼養(yǎng)環(huán)境、飼喂方式、飼糧構(gòu)成等都會(huì)導(dǎo)致畜禽機(jī)體氧化應(yīng)激。由氧化應(yīng)激引起的氧化損傷可直接導(dǎo)致畜禽機(jī)體免疫力低下、慢性炎癥等疾病，降低生產(chǎn)性能，影響畜產(chǎn)品品質(zhì)[2]。肝臟作為畜禽體內(nèi)的主要代謝器官，且肝細(xì)胞內(nèi)多達(dá)上千個(gè)線(xiàn)粒體，極易受到 ROS 攻擊和產(chǎn)生氧化應(yīng)激[3]。因此，建立肝臟氧化損傷模型對(duì)揭示動(dòng)物氧化應(yīng)激發(fā)生及預(yù)防的機(jī)制具有重要意義，為開(kāi)發(fā)新型抗氧化功能性飼料，預(yù)防肝臟氧化損傷奠定基礎(chǔ)。

鎘是自然界中廣泛存在的有毒重金屬，其半衰期長(zhǎng)，不易降解，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）在1993 年將其列為I 級(jí)致癌物[4]。鎘對(duì)人和動(dòng)物的幾乎所有器官產(chǎn)生毒性，急性或慢性接觸鎘會(huì)導(dǎo)致肝、腎功能衰竭，骨骼壞死、睪丸萎縮等器官病變，甚至引發(fā)癌癥和死亡，其中肝臟是鎘主要的蓄積部位和靶器官[5]。鎘能誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生以及降低抗氧化酶清除自由基的能力，導(dǎo)致組織氧化性損傷[6]。基于此，可以采用鎘損傷方式建立動(dòng)物氧化應(yīng)激模型以用于動(dòng)物抗氧化研究。Nemmiche 等[7]利用2 mg/kg 氯化鎘（CdCl2）溶液皮下注射Wistar 大鼠10 d，發(fā)現(xiàn)肝臟指數(shù)顯著上升，肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性顯著下降，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平顯著上升。Bhattacharjee 等[8]采用3 mg/kg 的CdCl2溶液皮下注射Wistar 大鼠7 d，大鼠心臟組織形態(tài)改變，MDA 含量顯著增加，出現(xiàn)氧化損傷。李曄等[9]用5 mg/kg CdCl2溶液連續(xù)腹腔注射5 d，大鼠體增重和胸腺指數(shù)顯著下降，肝細(xì)胞部分腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。趙英政等[10]利用0.8 mg/kg CdCl2連續(xù)腹腔注射7 d 成功建立SD 大鼠肝臟氧化損傷模型。目前采用CdCl2構(gòu)建動(dòng)物肝臟損傷氧化模型的濃度、給藥時(shí)間及損傷指標(biāo)等方面的研究不盡相同，因此，本研究擬在國(guó)內(nèi)外鎘損傷模型建立研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)腹腔注射不同濃度的CdCl2溶液，構(gòu)建大鼠肝臟氧化損傷模型，為揭示氧化應(yīng)激機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型抗氧化飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白定量（BCA）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所（生產(chǎn)批號(hào)依次為：20191225、20191129、20191128、20191127、20200620、20200618）。

高速冷凍離心機(jī)（ST16R）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；正置倒置一體熒光顯微鏡（RVL-100-G）購(gòu)自美國(guó)Echo 公司；多功能酶標(biāo)儀（Spark10M）購(gòu)自瑞士帝肯公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)用大鼠及日糧均購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。6～8 周齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠20 只，體重160～180 g（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001）。自由采食和飲水，每天12 h 光照，相對(duì)濕度為40%～60%，溫度20～25℃。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將20 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為4 個(gè)處理組，即對(duì)照組（0.9%的生理鹽水）、1、2 和5 mg/kg BW 的CdCl2溶液組，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 只大鼠，單籠飼養(yǎng)。腹腔注射并持續(xù)注射1 周，末次注射后禁食24 h 后脫頸處死。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 體增重和臟器指數(shù) 試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)記錄大鼠初始體重，末次注射24 h 后，稱(chēng)量大鼠終末體重，脫頸處死，剖取肝臟、脾臟、胸腺放入生理鹽水中清洗，用濾紙吸干后稱(chēng)取各臟器重量，計(jì)算臟器指數(shù)。

體增重=終末體重（g）-初始體重（g）

臟器指數(shù)=（臟器重量/體重）×100%

1.4.2 AST、ALT 活性 鼠摘眼球取血，采集好的血液放入無(wú)菌離心管中，使離心管在室溫下呈45°角放置1 h；待血液凝固收縮后，3 500 r/min 離心10 min，取上清待測(cè)。AST、ALT 檢測(cè)均嚴(yán)格按照AST、ALT 的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.3 肝組織氧化損傷指標(biāo) 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g 肝臟組織，按照重量（g）:體積（mL）為1:9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，在冰水浴下勻漿組織，然后3500 r/min 離心15 min，取上清液即10% 勻漿上清液待測(cè)。BCA、MDA 含量和SOD、GSH-Px 及CAT 活性的檢測(cè)均嚴(yán)格按照BCA、MDA、SOD、GSH-Px 和CAT 的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.4 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠右葉肝臟組織，放入10%福爾馬林溶液中浸泡進(jìn)行固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色,封片后于顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 CdCl2對(duì)體增重、臟器指數(shù)的影響 如表1 所示，腹腔注射CdCl2溶液導(dǎo)致大鼠的體增重降低，隨著注射劑量增加大鼠的體增重降低，1、2 和5 mg/kg BW的CdCl2試驗(yàn)組的大鼠體增重比對(duì)照組分別下降7.21%（P＞0.05）、12.23%（P＜0.05）和41.81%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，1、2 和5 mg/kg BW 的CdCl2試驗(yàn)組的肝臟指數(shù)分別提高了0.23%（P＞0.05）、15.98%（P＜0.05）、20.54%（P＜0.05），2 和5 mg/kg CdCl2組的肝臟指數(shù)高于對(duì)照組和1 mg/kg CdCl2組（P＜0.05）。5 mg/kg CdCl2組的胸腺指數(shù)較對(duì)照組下降53.84%（P＜0.05）。1、2、5 mg/kg CdCl2組的脾臟指數(shù)較對(duì)照組分別下降了3.03%、6.06%、9.09%，其中，5 mg/kg CdCl2組低于其余各組（P＜0.05）。

表1 CdCl2 對(duì)體增重、臟器指數(shù)的影響

2.2 CdCl2對(duì)大鼠血清AST、ALT 活性的影響 由表2 可知，腹腔注射CdCl2溶液導(dǎo)致大鼠血清的AST 和ALT 活性升高，1、2、5 mg/kg CdCl2組AST 活性分別較對(duì)照組升高11.84%（P＞0.05）、48.34%（P＜0.05）、82.45%（P＜0.05），且5 mg/kg CdCl2組顯著高于1mg/kg CdCl2組。1、2、5 mg/kg CdCl2組的ALT 活性較對(duì)照組分別升高18.03%（P＞0.05）、45.33%（P＜0.05）、65.23%（P＜0.05），其中2、5 mg/kg CdCl2組顯著高于1 mg/kg CdCl2組。

表2 大鼠血清中AST 和ALT 活性

2.3 CdCl2對(duì)大鼠肝組織MDA 和SOD、GSH-Px、CAT 活性的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，1、2、5 mg/kg CdCl2組MDA 含量分別提高了7.33%（P＞0.05）、17.33%（P＜0.05）、52.00%（P＜0.05），5 mg/kg CdCl2組顯著高于其余各組。1、2、5 mg/kg CdCl2大鼠肝臟SOD 活性較對(duì)照組分別降低了2.38%（P＞0.05）、11.38%（P＜0.05）、15.32%（P＜0.05），其中2 和5mg/kg CdCl2組均顯著低于對(duì)照組和1mg/kg CdCl2組。1、2、5 mg/kg CdCl2組GSHPx 活性較對(duì)照組分別降低了9.15%（P＞0.05）、18.63%（P＜0.05）、28.47%（P＜0.05），5 mg/kg CdCl2組顯著低于其余各組。試驗(yàn)組CAT 活性差異均不顯著。

表3 肝組織MDA 含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性

2.4 肝臟的組織形態(tài)學(xué)觀察 圖1 為肝臟組織的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。對(duì)照組肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊呈放射狀，肝細(xì)胞無(wú)壞死現(xiàn)象（圖1-A）。1 mg/kg CdCl2組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異樣，肝細(xì)胞索排列較整齊（圖1-B）。2 mg/kg CdCl2組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，部分肝細(xì)胞濁腫，細(xì)胞核濃縮或溶解，肝細(xì)胞局部壞死以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-C）。5 mg/kg CdCl2組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞極其嚴(yán)重，細(xì)胞核大量濃縮或溶解，肝細(xì)胞大面積壞死，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-D）。

圖1 大鼠肝臟組織形態(tài)（HE 染色，×200 觀察）

3 討 論

3.1 CdCl2對(duì)體增重、臟器指數(shù)的影響 鎘對(duì)胃腸黏膜和胰腺具有直接的損傷作用，會(huì)造成胃腸黏膜脫落、淺表性壞死和抑制胰腺的分泌功能，影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用，進(jìn)而導(dǎo)致體重下降[11]。徐光翠等[12]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)7 d 對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射1 mg/kg CdCl2，大鼠的體增重明顯低于對(duì)照組。本試驗(yàn)中，腹腔注射1 mg/kg CdCl2的大鼠體增重與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，但注射2 和5 mg/kg CdCl2組的大鼠體增重則顯著低于對(duì)照組和1 mg/kg CdCl2組，這可能是由于鎘對(duì)大鼠的胃腸道造成損傷引起食欲下降，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收受阻所致。

肝臟是機(jī)體的主要解毒器官，胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官。臟器指數(shù)增加說(shuō)明臟器充血、腫大，臟器指數(shù)減小則表明臟器萎縮、壞死等[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，2 和5 mg/kg CdCl2組的肝臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組，這與汪紀(jì)倉(cāng)等[14]的研究結(jié)果一致，分析認(rèn)為可能是由于鎘在肝臟內(nèi)的大量蓄積引起肝臟充血、腫大導(dǎo)致的肝臟指數(shù)增加。免疫器官指數(shù)可反應(yīng)免疫器官的發(fā)育水平和機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，在本研究條件下，胸腺、脾臟指數(shù)和鎘的處理劑量呈負(fù)相關(guān)，在5 mg/kg CdCl2劑量時(shí)與對(duì)照組相比達(dá)到顯著水平，說(shuō)明鎘對(duì)胸腺、脾臟產(chǎn)生了毒性并抑制了免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，且5 mg/kg CdCl2組的免疫功能受損最為嚴(yán)重，劉永琦等[15]也有相似報(bào)道。

3.2 CdCl2對(duì)大鼠血清AST、ALT 活性的影響 AST 和ALT 是檢測(cè)肝功能最敏感的指標(biāo)。正常生理狀態(tài)下，AST 和ALT 主要存在于肝組織的細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜通透性增加，AST 和ALT 釋放到血液中，血液中AST 和ALT 活力就會(huì)增加，血清中AST 和ALT 的活力與肝受損程度呈正相關(guān)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，鎘中毒的小鼠血清中AST、ALT 活力是正常小鼠的2～4 倍，證明了鎘對(duì)肝臟有很強(qiáng)的毒性作用[17]。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組血清中AST 和ALT 活力與對(duì)照組相比不斷升高，其中2 和5 mg/kg CdCl2組呈顯著趨勢(shì)，提示鎘對(duì)大鼠肝臟造成損傷，且損傷程度與鎘劑量呈量效關(guān)系。

3.3 CdCl2對(duì)大鼠肝組織MDA 含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性的影響 MDA 是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其水平一定程度上反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷程度[18]。SOD、GSH-Px、CAT 是胞內(nèi)第一道抗氧化酶防御系統(tǒng)，SOD是一種抗氧化金屬酶，其能夠催化超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)變成H2O2和O2，而H2O2比超氧陰離子具有更強(qiáng)的毒性，隨后H2O2又在CAT 和GSH-Px 的作用下分解為H2O 和O2，因此該系統(tǒng)在清除自由基和緩解細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮著重要作用[19]。傅晗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，給予SD 大鼠灌胃0.8 mg/ml CdCl2溶液20 d，鎘處理組肝組織中MDA 水平顯著高于對(duì)照組，SOD、GSH-Px 和CAT 活性顯著低于對(duì)照組。Fang 等[21]采用5 mg/kg CdCl2溶液對(duì)SD 大鼠連續(xù)灌胃28 d，發(fā)現(xiàn)鎘組大鼠肝組織中MDA 和ROS 水平較對(duì)照組顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px 活性顯著下降。本研究中鎘處理組大鼠肝臟MDA 含量增加，并且在2 和5 mg/kg CdCl2處理組中達(dá)到顯著水平，且5 mg/kg CdCl2組顯著高于2 mg/kg CdCl2組。但SOD、GSH-Px 和CAT 的活性與MDA 的水平呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，隨著鎘處理劑量的增加，SOD、GSH-Px 和CAT 的活性降低，并在2和5 mg/kg CdCl2的處理組中達(dá)到顯著水平。分析認(rèn)為鎘可降低肝臟的抗氧化水平導(dǎo)致氧化損傷，并且鎘誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷具有劑量依賴(lài)性。

3.4 CdCl2對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)的影響 肝組織結(jié)構(gòu)的破壞是肝臟受損最直觀的病理表現(xiàn)，本試驗(yàn)中肝組織HE 染色結(jié)果進(jìn)一步證明了腹腔注射2 和5 mg/kg CdCl2可導(dǎo)致組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞濁腫、沖血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。5 mg/kg CdCl2組肝細(xì)胞普遍濁腫，細(xì)胞核大量壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加重，證明5 mg/kg CdCl2已經(jīng)對(duì)大鼠肝臟造成不可逆損傷，這與本試驗(yàn)中血清AST 和ALT 活力升高的結(jié)果一致，也間接驗(yàn)證了肝臟腫大導(dǎo)致肝臟指數(shù)升高，此外肝臟中MDA 水平的升高和SOD、GSH-Px 活性的下降也預(yù)示了肝臟發(fā)生氧化損傷。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，采用2 mg/kg BW 的CdCl2對(duì)大鼠連續(xù)腹腔注射7 d 顯著降低了大鼠的體增重和肝組織SOD、GSH-Px 活性，肝臟指數(shù)、肝組織MDA 含量和血清中AST、ALT 水平顯著提高，出現(xiàn)肝組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，引發(fā)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，符合肝臟氧化損傷模型的建立標(biāo)準(zhǔn)，表明成功建立了大鼠肝臟氧化損傷模型。