雉雞肌纖維和肉質(zhì)性狀及其與ATIC、AMPD1和CAPN1 基因表達(dá)相關(guān)性分析

吳 瓊，李 焰*，袁紅艷，沈欣悅，楊勝優(yōu)

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364012；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 201499）

我國(guó)是世界上養(yǎng)殖雉雞最早的國(guó)家，人工養(yǎng)殖歷史久遠(yuǎn)，根據(jù)史書記載，4 000 年前甲骨文中就有“雉”字記載。明朝李時(shí)珍的《本草綱目》將雉雞列為“原禽類”，對(duì)雉雞的藥用價(jià)值做過(guò)記述[1-2]。新中國(guó)成立后雉雞養(yǎng)殖業(yè)開始發(fā)展，20 世紀(jì)80 年代末期我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了中國(guó)環(huán)頸雉（美國(guó)七彩雉雞）、白羽雉雞和黑化雉雞（孔雀藍(lán)雉雞）等，同時(shí)成功馴化了河北亞種雉雞，在此基礎(chǔ)上培育了左家雉雞，并開始了大規(guī)模的人工繁殖。2019 年培育出我國(guó)首個(gè)國(guó)審雉雞新品種“申鴻七彩雉雞”。目前，上海、廣州等地區(qū)已形成雉雞規(guī)?；?、集約化生產(chǎn)，養(yǎng)殖種類主要為中國(guó)環(huán)頸雉、黑化雉雞和申鴻七彩雉雞，部分品種為天峨六畫山雞、蒙古雉雞、綠雉雞和白羽雉雞[3]。

肌苷酸（Inosinemonphosphate，IMP）是一種在核糖核酸中發(fā)現(xiàn)的核苷酸，在畜禽及魚肉中含量較高，所以IMP 含量可以用來(lái)評(píng)定肉質(zhì)風(fēng)味[4]。次黃嘌呤核苷酸環(huán)水解酶基因（ATIC）和腺苷一磷酸脫氨酶基因（AMPD）表達(dá)與IMP 含量密切相關(guān)[4-5]。鈣蛋白酶（CAPNs）是細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，鈣蛋白酶1（CAPN1）是此家族的重要成員之一[6]。Felicio 等[7]研究證明，雞CAPN基因與肌纖維組成和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)。盡管ATIC、AMPD和CAPN1基因在嫩度調(diào)控及肉風(fēng)味改善中發(fā)揮著重要作用，但國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于ATIC、AMPD和CAPN1基因表達(dá)與雉雞肌肉性狀相關(guān)性的研究，為此，本研究旨在對(duì)中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞、黑化雉雞、申鴻七彩雉雞和綠雉雞的肌纖維特性和肉質(zhì)性狀與ATIC、AMPD1和CAPN1基因相關(guān)性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步研究ATIC、AMPD1和CAPN1基因功能和選育雉雞新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 分別選取相同出雛時(shí)間、同一飼料和飼養(yǎng)環(huán)境下的中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞、綠雉雞、申鴻七彩雉雞和黑化雉雞母雞100 只，每個(gè)品種各20 只，育雛期后進(jìn)行籠養(yǎng)，飼養(yǎng)至成齡（18 周齡）進(jìn)行屠宰，屠宰方式為舌下放血。每個(gè)品種選擇5 只雞，在無(wú)菌條件下分別采集左側(cè)胸肌組織，采樣后立即投入液氮中，并盡快轉(zhuǎn)移至-80℃保存，用于基因表達(dá)的分析；每個(gè)品種均取右側(cè)相同部位的新鮮胸?。? cm×1 cm×0.5 cm）放入10% 的福爾馬林溶液中，用于石蠟切片的制作，剩余胸肌用于肌肉品質(zhì)性狀測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌纖維特性測(cè)定 使用OLYMPUS 熒光顯微鏡的測(cè)微尺在400 倍視野下進(jìn)行觀察和測(cè)量，胸肌組織各觀察10～12 個(gè)切片，選取5 個(gè)視野，測(cè)量20 根肌纖維直徑，總計(jì)測(cè)量100 根肌纖維直徑，計(jì)算平均值，即為所測(cè)量胸肌組織樣品的肌纖維直徑數(shù)據(jù)。觀察的切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)算肌纖維根數(shù)，計(jì)算平均值后，即為胸肌組織樣品所測(cè)肌肉的肌纖維密度。

1.2.2 肌肉品質(zhì)性狀測(cè)定 肌肉剪切力采用肌肉嫩度儀（C-LM 3B，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)）測(cè)量，肉色采用color meter 色差儀（CR-10plus，日本柯尼卡美能達(dá)有限公司）、pH 值采用酸度計(jì)（S2-Food kit，瑞士梅特勒-托利國(guó)際多國(guó)際股份有限公司）測(cè)定。

1.2.3 組織總RNA 提取和cDNA 合成 將所采集胸肌樣品使用RNAiso Plus 試劑盒（TaKaRa，大連寶生物有限公司）提取總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA 檢測(cè)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA 濃度。以不同雉雞品種胸肌總RNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連寶生物有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Primer 5.0 和oligo 7.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和評(píng)估。所有引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。目的基因和內(nèi)參基因引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息表

1.2.5 目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 使用SYBR GreenI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，大連寶生物有限公司），具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，利用熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 7500）進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，設(shè)定無(wú)cDNA 樣品作為陰性對(duì)照。20 μL 反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模 板cDNA（10×diluted）2 μL，滅菌雙蒸水5.6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，58℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)利用SAS 10.0 軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。所有數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 雉雞肌肉的組織學(xué)特性 由表2 可知，雉雞胸肌肌纖維直徑為蒙古雉雞＞中國(guó)環(huán)頸雉＞黑化雉雞＞綠雉雞＞申鴻七彩雉雞，蒙古雉雞胸肌纖維直徑顯著高于其他雉雞，中國(guó)環(huán)頸雉與綠雉雞和黑化雉雞差異不顯著。肌纖維密度為綠雉雞＞申鴻七彩雉雞＞中國(guó)環(huán)頸雉＞黑化雉雞＞蒙古雉雞，綠雉雞顯著高于其他雉雞，中國(guó)環(huán)頸雉與申鴻七彩雉雞肌纖維密度差異不顯著，蒙古雉雞胸肌肌纖維密度最低。

表2 雉雞胸肌纖維直徑和密度測(cè)定結(jié)果

2.2 雉雞肌肉的品質(zhì)性狀 由表3 可知，5 種雉雞胸肌剪切力、失水率、pH、肌肉紅度值（a）、肌肉黃度值（b）和肌肉亮度值（L）均差異不顯著。

表3 雉雞胸肌纖維直徑和密度測(cè)定結(jié)果

2.2 目的基因在不同雉雞品種中的相對(duì)表達(dá)量 如圖1所示，ATIC、AMPD1和CAPN1基因在中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞、綠雉雞、申鴻七彩雉雞和黑化雉雞胸肌中均有表達(dá)，ATIC基因表達(dá)量大小依次為申鴻七彩雉雞＞蒙古雉雞＞綠雉雞＞中國(guó)環(huán)頸雉＞黑化雉雞，申鴻七彩雉雞ATIC基因的表達(dá)量與中國(guó)環(huán)頸雉和黑化雉雞差異顯著，與蒙古雉雞和綠雉雞差異不顯著；AMPD1基因表達(dá)量大小依次為申鴻七彩雉雞＞蒙古雉雞＞綠雉雞＞黑化雉雞＞中國(guó)環(huán)頸雉，申鴻七彩雉雞與其他雉雞均差異顯著。蒙古雉雞與綠雉雞、中國(guó)環(huán)頸雉與黑化雉雞之間差異不顯著；CAPN1基因表達(dá)量大小為蒙古雉雞＞ 綠雉雞＞申鴻七彩雉雞＞中國(guó)環(huán)頸雉＞黑化雉雞，蒙古雉雞與綠雉雞和申鴻七彩雉雞差異不顯著，與中國(guó)環(huán)頸雉和黑化雉雞差異顯著。

圖1 不同品種雉雞ATIC、AMPD1 和CAPN1 基因表達(dá)變化圖

2.3 雉雞ATIC、AMPD1和CAPN1基因表達(dá)量與肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)性

2.3.1 雉雞ATIC基因表達(dá)量與肉質(zhì)性狀相關(guān)性 由表4可知，中國(guó)環(huán)頸雉ATIC基因表達(dá)量與肌肉pH 之間存在極顯著正相關(guān)；蒙古雉雞ATIC基因表達(dá)量與失水率之間呈顯著正相關(guān)；綠雉雞ATIC基因表達(dá)量與肌纖維直徑之間存在極顯著正相關(guān)；申鴻七彩雉雞ATIC基因表達(dá)量與肌肉L 值之間呈顯著正相關(guān)；黑化雉雞ATIC基因表達(dá)量與肌肉a 值之間呈極顯著正相關(guān)。說(shuō)明不同雉雞品種ATIC基因表達(dá)量與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性存在差異。

表4 雉雞ATIC 基因表達(dá)量與肌纖維特性和肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

2.3.2 雉雞AMPD1基因表達(dá)量與肉質(zhì)性狀相關(guān)性 由表5 可知，中國(guó)環(huán)頸雉AMPD1基因表達(dá)量與失水率之間呈極顯著正相關(guān)；蒙古雉雞AMPD1基因表達(dá)量與肌肉a 值之間呈顯著負(fù)相關(guān)；綠雉雞與肌肉性狀之間無(wú)相關(guān)性；申鴻七彩雉雞AMPD1基因表達(dá)量與失水率和肌肉b 值之間呈顯著正相關(guān)；黑化雉雞AMPD1基因表達(dá)量與肌肉a 值之間呈顯著正相關(guān)。

表5 雉雞AMPD1 基因表達(dá)量與肌纖維特性和肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

2.3.3 雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肉質(zhì)性狀相關(guān)性 由表6 可知，中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞和黑雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肌纖維直徑之間呈顯著正相關(guān)；綠雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肌纖維直徑和失水率之間呈極顯著正相關(guān)；申鴻七彩雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肌纖維直徑之間呈極顯著正相關(guān)，與pH 之間呈顯著正相關(guān)，與失水率之間呈顯著負(fù)相關(guān)。與肌肉L 值之間呈顯著正相關(guān)；綠雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肌纖維直徑和失水率之間呈極顯著正相關(guān)，申鴻七彩雉雞CAPN1基因表達(dá)量與pH 之間呈顯著正相關(guān)，與失水率之間呈顯著負(fù)相關(guān)，黑化雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肌肉a 值之間呈顯著正相關(guān)，與肌肉b 值之間呈顯著負(fù)相關(guān)。

表6 雉雞CAPN1 基因表達(dá)量與肌纖維特性和肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

3 討 論

肌肉纖維是構(gòu)成肌肉組織的重要組成部分。動(dòng)物肌肉組織的生長(zhǎng)主要是衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化，使得肌肉纖維變長(zhǎng)變粗，不依賴于肌肉纖維數(shù)量的增加[8]。動(dòng)物肌肉體積的增加是肌纖維體積增大導(dǎo)致，隨著動(dòng)物肌肉纖維的逐漸變粗，肌肉之間的結(jié)締組織與脂肪數(shù)量也會(huì)逐漸增加，從而導(dǎo)致肌纖維密度下降。鳥類動(dòng)物肌纖維數(shù)量在出生后會(huì)相對(duì)穩(wěn)定，保持不變[9]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，肌纖維直徑和肌纖維密度與肉質(zhì)性狀密切相關(guān)[10]。吳信生等[11]、楊燁等[12]和陳潔波等[13]分別對(duì)雞肉肌纖維和肉品質(zhì)性狀相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肌纖維越細(xì)，肉質(zhì)嫩度就越好，兩者呈負(fù)相關(guān)性，主要原因?yàn)榧±w維較粗時(shí)，肌原纖維之間結(jié)合就會(huì)越牢固，所以肌肉剪切力會(huì)變大，嫩度就會(huì)越差。目前，肌纖維指標(biāo)已經(jīng)成為衡量產(chǎn)肉動(dòng)物肉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。影響動(dòng)物肌纖維的因素很多，有動(dòng)物年齡、體重增長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)供給和運(yùn)動(dòng)量等，動(dòng)物年齡越大，肌纖維會(huì)越粗，體重增長(zhǎng)速度越快，動(dòng)物肌纖維的增粗速度也會(huì)加快，因此動(dòng)物日增重比較快，其肌肉嫩度會(huì)相應(yīng)下降。在養(yǎng)殖過(guò)程中，需要找到動(dòng)物生長(zhǎng)速度和肉品質(zhì)之間的平衡點(diǎn)[14]。

國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)雉雞肌纖維直徑和密度的相關(guān)研究報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)我國(guó)家養(yǎng)中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞、綠雉雞、申鴻七彩雉雞肌纖維特性測(cè)定結(jié)果分析可知，申鴻七彩雉雞胸肌和腿肌肌纖維直徑最小，肌纖維密度胸肌低于綠雉雞，腿肌低于蒙古雉雞，但均高于其他雉雞。申鴻七彩雉雞為我國(guó)多年人工選育適應(yīng)籠養(yǎng)的雉雞新品種，而中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞、綠雉雞和黑化雉雞均為國(guó)外引入品種，在國(guó)外養(yǎng)殖多為狩獵使用，推測(cè)選種目標(biāo)不同導(dǎo)致其肉嫩度存在差異。

本研究中ATIC、AMPD1和CAPN1基因在中國(guó)環(huán)頸雉、蒙古雉雞、綠雉雞、申鴻七彩雉雞和黑化雉雞胸肌均有表達(dá)，這與吳瓊[4]對(duì)中國(guó)環(huán)頸雉ATIC基因相對(duì)表達(dá)量研究結(jié)果一致，雉雞AMPD1和CAPN1基因相對(duì)表達(dá)量的研究國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道，但與于平[15]和高海軍[16]對(duì)雞的研究結(jié)果一致。ATIC和AMPD1基因在申鴻七彩雉雞中表達(dá)量最高，推測(cè)可能因?yàn)樯犋櫰卟曙綦u為人工選育品種，其表達(dá)量與品種有關(guān)，但其表達(dá)模式是否為其所特有，能否作為影響其肉質(zhì)性狀的候選基因，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究中雉雞CAPN1基因表達(dá)量與肌纖維直徑呈顯著正相關(guān)，這與Zhang 等[17]發(fā)現(xiàn)雞CAPN1基因的表達(dá)量與肌纖維直徑顯著關(guān)聯(lián)的結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn)，ATIC、AMPD1和CAPN1基因與雉雞肌纖維和肉質(zhì)性狀存在一定相關(guān)性，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié) 論

不同品種雉雞肌纖維組織學(xué)特性和肉質(zhì)性狀存在差異，雉雞ATIC、AMPD1和CAPN1基因在不同雉雞胸肌中均有表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量對(duì)肉質(zhì)的影響存在差異。因此，對(duì)雉雞肉質(zhì)相關(guān)候選基因表達(dá)規(guī)律與肉質(zhì)相關(guān)性的研究將為我國(guó)雉雞資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。