白毛藤多糖通過調(diào)控miR-431表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖及凋亡的影響

王東宏,徐 斌,劉 潔

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肛腸科,烏魯木齊 830000)

結(jié)直腸癌是威脅人類生命安全的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第4位,目前手術(shù)、化療等是結(jié)直腸癌的主要治療手段,但患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是結(jié)直腸癌治療亟待解決的問題,黃芪多糖、鴉膽子苦醇等多種植物提取物可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,但關(guān)于其作用機(jī)制尚未闡明[1-4]。白毛藤屬于茄科植物,白毛藤多糖是其主要活性成分,其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]。但白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未可知。miR-431在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平降低,并可通過抑制CUL4B而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲[6]。但miR-431是否可作用白毛藤多糖治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)尚未可知。因此,本研究旨在探討白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其對(duì)miR-431的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白毛藤購(gòu)自毫州市君源堂藥材站;結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620購(gòu)自上海弗元生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco;胰蛋白酶購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司;Lipofectamine2000、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;MTT試劑購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司;miR-NC、miR-431 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-431購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司;Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher;兔抗人Ki-67(貨號(hào):9129T)、Bcl-2(貨號(hào):4223S)、Bax(貨號(hào):2774S)抗體購(gòu)自美國(guó)CST;二抗(貨號(hào):ab150077)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 白毛藤多糖制備 白毛藤多糖制備[7]:稱取100 g白毛藤粉末,加入95%乙醇浸泡3 h,連續(xù)處理2次后采用95%乙醇回流提取2次,1 h/次,收集兩次提取液后減壓濃縮,經(jīng)3 000 r/min離心8 min后吸取上清,采用95%乙醇醇沉6次,相同條件下離心后吸取上清,加入等倍體積的三氯乙酸處理后離心取上清,采用氫氧化鈉調(diào)pH值(pH=7),減壓濃縮后加入無水乙醇,多糖析出,采用95%乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌后收集沉淀,分別經(jīng)過抽濾、加水溶解、干燥后獲得白毛藤多糖,配置母液濃度為10 g/L,按照實(shí)驗(yàn)需求分別稀釋至0.4,0.8,1.6 g/L。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 為探究白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,本研究將SW620細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,分別加入不同濃度(0.4,0.8,1.6 g/L)的白毛藤多糖處理細(xì)胞24 h,分別記為白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的SW620細(xì)胞記為對(duì)照組。

為探究miR-431在結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制,本研究將miR-NC、miR-431 mimics分別轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過程按照Lipofecta-mine2000試劑說明書進(jìn)行操作,分別記為miR-NC組和miR-431組。

同時(shí)為探討miR-431是否可作為白毛藤多糖治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn),本研究分為:白毛藤多糖+anti-miR-NC組()和白毛藤多糖+anti-miR-431組,分別用anti-miR-NC和anti-miR-431轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后加入含濃度為1.6 g/L白毛藤多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集“1.2.2”各組SW620細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔分別加入20 μl MTT試劑,將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min,棄上清,每孔加入150 μl DMSO,室溫孵育10 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值(OD值)并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%]。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集“1.2.2”各組SW620細(xì)胞加入0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞,加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清,將500 μl Binding Buffer加入細(xì)胞沉淀中,按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書及應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-431的表達(dá)水平 采用Trizol法提取“1.2.2”各組SW620細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA加入DPEC水稀釋20倍后進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),擴(kuò)增體系:SYBR Green Master Mix 10 μl/孔,正反向引物0.8 μl/孔,cDNA 1 μl/孔,ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)40次。miR-431以U6為內(nèi)參,采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-431相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 收集“1.2.2”各組SW620細(xì)胞加入500 μl RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白,按照BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,并將上樣緩沖液加入蛋白樣品中,充分混勻后置于沸水中煮10 min蛋白變性,采用SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后加入Ki-67(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1 ∶3 000)稀釋液,將其置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜,采用TBST洗滌后加入二抗稀釋液(1 ∶5 000),將其置于室溫條件下孵育1 h,采用TBST洗滌后滴加ECL,應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較,白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05),Ki-67蛋白水平降低(P<0.05),且白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組細(xì)胞增殖抑制率、Ki-67蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1、圖1)。

表1 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖的影響s,n=9)Table 1 Effect of solanum lyratum polysaccharide on the proliferation of colorectal cancer SW620

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與白毛藤多糖低劑量組比較,#P<0.05;與白毛藤多糖低中量組比較,&P<0.05圖1 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞Ki-67蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of solanum lyratum polysaccharide on the expression of Ki-67 protein in colorectal cancer SW620 cells

2.2 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較,白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),Bax蛋白水平升高(P<0.05),且白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.3 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞中miR-431表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組miR-431的表達(dá)水平升高(P<0.05),且白毛藤多糖低劑量組、白毛藤多糖中劑量組、白毛藤多糖高劑量組間miR-431的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與白毛藤多糖低劑量組比較,#P<0.05;與白毛藤多糖低中量組比較,&P<0.05圖2 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of solanum lyratum polysaccharide on cell apoptosis of colorectal cancer SW620 cells

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與白毛藤多糖低劑量組比較,#P<0.05;與白毛藤多糖低中量組比較,&P<0.05圖3 白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞中miR-431表達(dá)的影響Figure 3 Effect of solanum lyratum polysaccharide on the expression of miR-431 in colorectal cancer SW620 cells

2.4 miR-431過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC組比較,miR-431組細(xì)胞增殖抑制率與細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),Ki-67、Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),Bax蛋白水平升高(P<0.05,見圖4、表2)。

表2 miR-431過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響Table 2 Effect of miR-431 overexpression on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer SW620

2.5 干擾miR-431表達(dá)聯(lián)合白毛藤多糖(1.6 g/L)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與白毛藤多糖+anti-miR-NC組比較,白毛藤多糖+anti-miR-431組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),Ki-67、Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),Bax蛋白水平降低(P<0.05,見表3、圖5)。

與miR-NC組比較,*P<0.05圖4 miR-431過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響Figure 4 Effect of miR-431 overexpression on proliferation and apoptosis of colorectal cancer SW620 cells

表3 干擾miR-431表達(dá)聯(lián)合白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響Table 3 Effects of interference of miR-431 expression combined with solanum lyratum polysaccharide on proliferation and apoptosis of colorectal cancer SW620

3 討論

植物提取物的活性成分包括多糖、黃酮等,具有抗腫瘤等作用,其作用機(jī)制與多途徑、多靶點(diǎn)密切相關(guān),芍藥苷通過抑制FoxM1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[8]。丹參酮ⅡA通過激活JNK-Mff信號(hào)通路促進(jìn)線粒體裂變,從而降低結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。醉茄素A通過ROS依賴的線粒體功能障礙誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[10]。但白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未可知。

白毛藤多糖可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[11]。白毛藤多糖可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制與激活Fas及抑制Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示,不同劑量的白毛藤多糖處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖抑制率升高,且隨著藥物劑量的增加而明顯升高。研究表明Ki-67表達(dá)異常與細(xì)胞周期密切相關(guān),抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,抑制細(xì)胞增殖[13,14]。本研究結(jié)果顯示,不同劑量的白毛藤多糖可明顯降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)水平,且隨著藥物濃度的增加而明顯降低,提示白毛藤多糖可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,且呈劑量依賴性。Bcl-2表達(dá)上調(diào)可抑制Bax表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡,Bax表達(dá)上調(diào)可激活線粒體途徑而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示,不同劑量的白毛藤多糖可明顯提高結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率,并抑制Bcl-2的表達(dá)及促進(jìn)Bax的表達(dá),且隨著藥物濃度的增加而明顯變化,提示白毛藤多糖可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴性。但白毛藤多糖調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制尚未闡明。

與白毛藤多糖+anti-miR-NC組比較,*P<0.05圖5 干擾miR-431表達(dá)聯(lián)合白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響Figure 5 Effects of interference of miR-431 expression combined with solanum lyratum polysaccharide on proliferation and apoptosis of colorectal cancer SW620 cells

本研究檢測(cè)結(jié)果顯示,不同劑量的白毛藤多糖可明顯提高結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-431的表達(dá)水平,且隨著藥物劑量的增加而明顯升高,提示白毛藤多糖可能通過上調(diào)miR-431的表達(dá)從而發(fā)揮作用。miR-431通過下調(diào)DDX5抑制肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。miR-431通過靶向CDK14抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。circ-0001742通過miR-431-5p/ATF3軸促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果顯示,miR-431過表達(dá)可明顯提高結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖抑制率與細(xì)胞凋亡率,提示miR-431過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究將干擾miR-431表達(dá)聯(lián)合白毛藤多糖處理結(jié)直腸癌細(xì)胞,結(jié)果顯示,細(xì)胞增殖抑制率與細(xì)胞凋亡率降低,提示干擾miR-431表達(dá)可明顯降低白毛藤多糖對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

綜上所述,白毛藤多糖可通過上調(diào)miR-431的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,miR-431可能作為白毛藤多糖治療結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)之一,可為進(jìn)一步揭示白毛藤多糖治療結(jié)直腸癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),還可為結(jié)直腸癌的治療提供新方向。