pH微環(huán)境對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖行為的影響

董少杰,梅鈺坤,石昊羽,趙舒揚(yáng),牛 林,谷冬華,4*

(1西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院,陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710004;2陜西省牙頜疾病臨床研究中心;3西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科;4西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔特診特需科;*通訊作者,E-mail:27585859@qq.com)

齲病是口腔最常見的一類牙齒硬組織疾病,可破壞原有的牙體結(jié)構(gòu)和功能完整性,若持續(xù)發(fā)展可引起牙髓癥狀,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。傳統(tǒng)的齲壞治療方式為去凈腐質(zhì)、預(yù)備洞型后使用銀汞合金、復(fù)合樹脂等材料充填,但是存在力學(xué)傳導(dǎo)性差、繼發(fā)齲風(fēng)險(xiǎn)大及容易脫落、刺激牙髓等不足,使其強(qiáng)度、美學(xué)效果難與天然牙齒相媲美[2,3]。研究發(fā)現(xiàn),牙本質(zhì)受損后,近缺損處的成牙本質(zhì)細(xì)胞可分泌牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白,重建羥基磷灰石晶體,在受損處相對(duì)的髓腔壁處形成修復(fù)性牙本質(zhì)以保護(hù)牙髓。因此,通過促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成實(shí)現(xiàn)齲壞組織的修復(fù)成為新的齲病治療策略和研究熱點(diǎn)[4]。

微環(huán)境的改變是促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的重要因素。牙本質(zhì)齲壞通常伴隨牙本質(zhì)小管口形態(tài)扭曲、有機(jī)基質(zhì)及膠原纖維的降解等[5,6]。隨著硬組織微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,氧分壓、溫度刺激、pH等成牙本質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境發(fā)生改變。盡管已有較多研究關(guān)注氧分壓、溫度刺激等因素對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,但pH對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖分化的影響則尚未見文獻(xiàn)報(bào)道[7]。pH的改變既是齲壞進(jìn)展的標(biāo)志、也是齲壞進(jìn)展的誘因[8,9],然而,目前對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖分化及礦化能力的體外研究通常是在常規(guī)培養(yǎng)液中進(jìn)行的,并不能反映細(xì)胞在齲洞的真實(shí)酸堿微環(huán)境。鑒于此,本研究擬通過精準(zhǔn)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值模擬齲洞酸堿微環(huán)境,并以永生化小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)成牙本質(zhì)細(xì)胞在齲洞低pH微環(huán)境下增殖行為特點(diǎn),并期望為促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成這一齲壞治療新策略提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó))、胎牛血清(Gibco,美國(guó))、0.25%胰蛋白酶(Gibco,美國(guó))、鹽酸溶液與氫氧化鈉溶液(1 mol/L,西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)、CCK8試劑盒(上海貝博生物公司)、MDPC-23細(xì)胞(美國(guó)佐治亞奧古斯塔大學(xué)Franklin Tay教授贈(zèng)予)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(FSX100,OLYMPUS,日本)、普通光學(xué)顯微鏡(DMLB,Leica,德國(guó))、全自動(dòng)高溫高壓滅菌鍋(HV-50,Hirayama,日本)、恒溫干燥箱(Eppendorf,德國(guó))、數(shù)字化pH計(jì)(Sartorius,德國(guó))。

1.3 不同pH齲洞微環(huán)境的模擬構(gòu)建

用高溫高壓滅菌后的生理鹽水將1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液稀釋至0.1 mol/L;在超凈臺(tái)內(nèi)使用一次性無菌濾器過濾,確保溶液無菌、無雜質(zhì);將4個(gè)50 ml高壓滅菌后的離心管編號(hào)為1,2,3,4,均加入20 ml DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清);使用移液器向1,2號(hào)離心管逐滴加入過濾后的HCl溶液,4號(hào)離心管加入過濾后的NaOH溶液。1-4試管各取1 ml培養(yǎng)液,用數(shù)字化酸度計(jì)測(cè)量pH值。根據(jù)測(cè)量結(jié)果調(diào)整酸堿溶液加入量,直至達(dá)到目標(biāo)pH。培養(yǎng)液pH重復(fù)測(cè)量3次穩(wěn)定后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 不同pH環(huán)境MDPC-23細(xì)胞形態(tài)觀察

MDPC-23細(xì)胞接種至4個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中,編號(hào)為A,B,C,D;用倒置顯微鏡觀察記錄實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)情況;當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至大約50%接觸時(shí),吸出培養(yǎng)液,PBS沖洗兩遍,A,B,C,D分別加入pH值為5.5,6.5,7.5和8.5培養(yǎng)液;每8 h更換相應(yīng)pH值的培養(yǎng)液,通過提高換液頻次確保培養(yǎng)皿內(nèi)pH環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定;48 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5 不同pH環(huán)境MDPC-23增殖活性檢測(cè)

待MDPC-23細(xì)胞生長(zhǎng)至80%接觸時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化獲取細(xì)胞懸液。取出0.5 ml細(xì)胞懸液加無菌水稀釋10倍,以每中格的細(xì)胞量可查為度。取潔凈的血球計(jì)數(shù)板(16×25規(guī)格),懸液搖勻,移液器吸取少許懸液滴加在計(jì)數(shù)區(qū)(計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)避免沾上細(xì)胞懸液,防止加蓋蓋玻片后計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高),然后加蓋蓋玻片(避免產(chǎn)生氣泡)。靜置片刻使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板。將細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái),低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)觀察并計(jì)數(shù);調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml接種于6個(gè)96孔培養(yǎng)板(編號(hào)1-6),每個(gè)96孔板選取4排(編號(hào)A、B、C、D)每排5個(gè)復(fù)孔,每孔加入100 ul細(xì)胞懸液;培養(yǎng)1 d,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁后,吸去A、B、C、D各排復(fù)孔內(nèi)舊培養(yǎng)液,分別加入pH5.5,6.5,7.5,8.5培養(yǎng)液,再額外設(shè)置5個(gè)復(fù)孔分別加入pH 5.5,6.5,7.5,8.5培養(yǎng)液作為空白對(duì)照孔,用于校正不同顏色培養(yǎng)基對(duì)光密度(optical density, OD)值的影響。每天同一時(shí)刻取一個(gè)96孔板(防止檢測(cè)吸光度時(shí)污染其他孔),每孔細(xì)胞加入CCK8試劑,繼續(xù)孵育4 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇450 nm的波長(zhǎng),測(cè)定各孔吸收值,記錄結(jié)果,以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,OD平均值為縱軸繪制MDPC-23細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 不同pH齲洞微環(huán)境的模擬構(gòu)建

成功配制了4組不同pH的培養(yǎng)液,pH值分別為5.5,6.5,7.5,8.5。其中,pH7.5接近普通DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,pH約為7.7)的初始酸堿度被選為對(duì)照組。不同組培養(yǎng)液在多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)重復(fù)測(cè)量,pH值穩(wěn)定;24,48 h后分別測(cè)量樣本的pH值,同一組的pH沒有明顯變化,極差不超過0.5。由于DMEM培養(yǎng)基含有酸堿指示劑,因而不同pH的培養(yǎng)液,呈現(xiàn)不同的顏色:pH為5.5時(shí),酸性DMEM培養(yǎng)液呈現(xiàn)淺黃色;pH為6.5時(shí),DMEM培養(yǎng)液呈現(xiàn)淺粉色,pH為7.5時(shí),DMEM培養(yǎng)液呈現(xiàn)淺紫色,繼續(xù)調(diào)整培養(yǎng)液pH值至8.5,堿性DMEM培養(yǎng)液則呈現(xiàn)深紫色(見圖1)。

圖1 不同pH的DMEM培養(yǎng)液顏色變化趨勢(shì)Figure 1 Color changes of DMEM medium with different pH values

2.2 不同pH環(huán)境MDPC-23形態(tài)觀察

不同pH培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后,MDPC-23細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)情況呈現(xiàn)不同特點(diǎn)。pH 5.5環(huán)境下,細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組(pH 7.5)差異明顯,由對(duì)照組的短梭形或三角形變異為長(zhǎng)梭形,部分細(xì)胞形態(tài)完整性破壞,細(xì)胞數(shù)量少且呈現(xiàn)輕度聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)(見圖2A);pH 6.5環(huán)境下,細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比有輕度變化,近似梭形,相同放大倍率視野下細(xì)胞數(shù)量較少,表現(xiàn)出一定的聚集傾向(見圖2B);pH 7.5環(huán)境下,細(xì)胞形態(tài)基本恒定,細(xì)胞呈短梭形或三角形;細(xì)胞聚集生長(zhǎng),可形成細(xì)胞結(jié)節(jié)。顯微鏡視野下細(xì)胞較密集,聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯(見圖2C);pH 8.5環(huán)境下,與對(duì)照組(pH 7.5)相比,相同放大倍率的顯微鏡視野下,細(xì)胞數(shù)分布更為密集,聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象明顯,胞體較小。多個(gè)細(xì)胞聚集在一起,可形成細(xì)胞結(jié)節(jié)形態(tài)。部分細(xì)胞一端有細(xì)長(zhǎng)突起,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(見圖2D)。

圖2 分別以pH5.5,6.5,7.5和8.5培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)Figure 2 The morphology of MDPC-23 cells cultured in pH 5.5,6.5, 7.5 and 8.5 for 48 h

2.3 不同pH微環(huán)境下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

pH 5.5環(huán)境下,光密度值(optical density, OD)并未隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高,4 d后OD值開始降低,表示加入pH 5.5培養(yǎng)液后,細(xì)胞數(shù)量基本沒有增加,增殖受到抑制。pH 6.5環(huán)境下,細(xì)胞增長(zhǎng)大致呈“S”型,在培養(yǎng)3 d后OD值達(dá)到最大值,細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期;pH 7.5環(huán)境下,細(xì)胞增殖呈現(xiàn)較為典型的“S”型,在培養(yǎng)3 d后達(dá)到峰值,細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期;pH 8.5環(huán)境下,細(xì)胞增殖呈現(xiàn)典型的“S”型,但4 d后達(dá)到平臺(tái)期,晚于pH 7.5和pH 6.5;pH 8.5培養(yǎng)液組OD值峰值高于pH 6.5組和pH 7.5組(見圖3)。

圖3 不同pH環(huán)境下MDPC-23生長(zhǎng)曲線Figure 3 The growth curve of MDPC-23 cultured in different pH environment

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,永生化小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23在不同的pH微環(huán)境中,呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征,由此可以判斷pH微環(huán)境對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的生理功能具有一定的影響。采用不同pH值的培養(yǎng)液培養(yǎng)MDPC-23細(xì)胞48 h后,觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)酸堿環(huán)境均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變異,顯微鏡視野內(nèi)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)量也有所差異;本實(shí)驗(yàn)也利用CCK8試劑檢測(cè)不同pH環(huán)境下MDPC-23細(xì)胞的增殖活性,發(fā)現(xiàn)酸、堿性環(huán)境均對(duì)細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生影響。pH 5.5組在培養(yǎng)4 d后顯示出抑制細(xì)胞增殖活性的作用,說明齲洞內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生超出細(xì)胞耐受閾值的酸性環(huán)境,對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖有較為明顯的負(fù)向影響;相對(duì)于pH 7.5和pH 8.5組的細(xì)胞增殖情況,pH 6.5組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量均低于這兩組,提示弱酸微環(huán)境對(duì)細(xì)胞有持續(xù)的輕度抑制作用。此外,成牙本質(zhì)細(xì)胞在pH8.5堿性環(huán)境培養(yǎng)初期受到抑制,后期則顯示出較好的耐受性。

齲壞引起成牙本質(zhì)細(xì)胞暴露于外界刺激,導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞生活的微環(huán)境由穩(wěn)定的牙本質(zhì)小管環(huán)境變?yōu)橐资芡饨绺蓴_的不穩(wěn)定環(huán)境,其中,細(xì)胞生活微環(huán)境pH的變化是齲壞引起的變化因素之一。通過對(duì)不同pH培養(yǎng)液環(huán)境下MDPC-23形態(tài)觀察,可以初步認(rèn)為pH微環(huán)境對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、增殖狀態(tài)具有一定的影響。pH 5.5的環(huán)境對(duì)細(xì)胞有明顯的細(xì)胞增殖毒性,在加入pH 5.5培養(yǎng)液4 d后OD值開始降低,說明細(xì)胞在pH 5.5的環(huán)境中增殖活性受到抑制在pH 6.5和pH 7.5的培養(yǎng)液中,細(xì)胞增殖在第3 d達(dá)到平臺(tái)期,但pH 6.5組測(cè)得的OD值峰值低于pH 7.5組,說明相比于pH 7.5的環(huán)境,在pH 6.5時(shí),細(xì)胞的增殖有所下降。pH 8.5的堿性環(huán)境中,OD值開始的前3 d小于pH 6.5和pH 7.5組,在第4天達(dá)到峰值,且峰值大于pH 6.5和pH 7.5兩組的OD值,說明細(xì)胞在堿性環(huán)境下的增殖活性在前期受到抑制,后期對(duì)堿性環(huán)境則有較好的耐受性。因此,酸性的環(huán)境具有細(xì)胞增殖抑制作用,齲壞患牙由于產(chǎn)酸細(xì)菌代謝作用導(dǎo)致的洞腔低pH微環(huán)境可能是引起成牙本質(zhì)細(xì)胞生理代謝發(fā)生改變的因素之一[10]。

綜上所述,在不同pH微環(huán)境下,永生化小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23的增殖能力和形態(tài)特征均有所差異,且可以初步認(rèn)為pH微環(huán)境是造成這些差異的最主要原因。然而,造成這一差異的機(jī)制尚不完全明確。有研究認(rèn)為pH可能通過酸敏感離子通道ASICs、細(xì)胞膜Ca2+通道或TREK-1 K+離子通道影響細(xì)胞活性[11]。此外,研究表明成牙本質(zhì)細(xì)胞具有初級(jí)纖毛細(xì)胞器結(jié)構(gòu),與高爾基復(fù)合體聯(lián)系密切,推測(cè)也可能具有細(xì)胞定向功能或定向分泌高爾基復(fù)合體分子的作用,為成牙本質(zhì)細(xì)胞響應(yīng)外界刺激、調(diào)控修復(fù)性牙本質(zhì)的形成提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12-14]。本研究初步明確pH能夠影響成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖活性,今后尚需進(jìn)一步研究以闡明pH調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞生理活動(dòng)的具體機(jī)制。