蒿秦化斑方對(duì)紫外線損傷角質(zhì)形成細(xì)胞黏附分子及PI3K/AKTAKT/GSK-3β通路的影響

王思藝 孫麗蘊(yùn)

摘要 目的：觀察蒿秦化斑方對(duì)HaCat細(xì)胞紫外線B（UVB）急性損傷模型細(xì)胞黏附分子及PI3K/AKT/GSK-3β通路的影響，探討該方治療光敏感性皮膚病的作用機(jī)制。方法：采用300 mJ/cm2 UVB建立HaCat細(xì)胞急性光損傷模型，使用不同劑量蒿秦化斑方干預(yù)，分為空白對(duì)照組、UVB模型組、及蒿秦化斑方高、中、低劑量組。采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞黏附分子ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1相對(duì)表達(dá)量，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法分析PI3K/AKT/GSK-3β通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)p-AKT（Ser-473）、p-AKT（Thr-308）、GSK-3β、PI3K相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：UVB急性光損傷可有效減少HaCat細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)（P<0.01），對(duì)VCAM-1及ELAM-1表達(dá)影響不顯著;蒿秦化斑方高劑量組能有效抑制HaCat細(xì)胞3種細(xì)胞黏附分子的表達(dá)（P<0.05）;蒿秦化斑方中劑量組能有效抑制HaCat細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子-1（ELAM-1）及血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)（P<0.01）。UVB急性光損傷對(duì)HaCat細(xì)胞AKT磷酸化、PI3K表達(dá)影響不顯著，蒿秦化斑方低劑量處理對(duì)HaCat細(xì)胞AKT磷酸化具有促進(jìn)作用（P<0.05）。UVB急性光損傷使HaCat細(xì)胞糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表達(dá)水平升高（P<0.01），蒿秦化斑方高、中、低劑量處理均對(duì)HaCat細(xì)胞GSK-3β表達(dá)水平有所抑制（P<0.01）。結(jié)論：蒿秦化斑方能降低由UVB急性損傷造成的HaCat細(xì)胞ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達(dá)進(jìn)而緩解局部炎癥和遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，并且能夠激活HaCat細(xì)胞PI3K/AKT/GSK-3β通路，在UVB造成的急性光損傷中起到抗氧化、抗凋亡和降低炎癥反應(yīng)的作用。

關(guān)鍵詞 光敏感性皮膚病;蒿秦化斑方;蛋白激酶B;糖原合成酶激酶-3β;細(xì)胞黏附分子;人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞;紫外線B;紫外線損傷

Abstract Objective：To observe the effects of Haoqin-Huaban on the relative adhesion factors and the PI3K/AKT/GSK-3β pathway of an acute UVB light HaCat-cell injury model in order to further explore the mechanism of the treatment for photosensitive skin disorders.Methods：UVB light（300 mJ/cm2） was used to establish an acute light HaCat-cell injury model.The intervention was performed by using Haoqin-Huaban in various concentrations.The groups were divided into：a blank control group（C）; an UVB model group（M）; a high Haoqin-Huaban dosage group（G）; medium Haoqin-Huaban dosage group（Z）; low Haoqin-Huaban dosage group（D）.Real-time PCR was conducted to detect the relative expressions of 3 cell adhesion molecules（CAMs），i.e.，ICAM-1，ELAM-1 and VCAM-1.Western Blotting was implemented to analyze the relative expressions of p-AKT（Ser-473），p-AKT（Thr-308），GSK-3β，and PI3K，which were all related nodes of the PI3K/AKT/GSK-3β pathway.Western Blot method was used to analyze the relative expression of p-AKT（Ser-473），p-AKT（Thr-308），GSK-3β and PI3K related nodes in the PI3K/AKT/GSK-3β pathway.Results：UVB acute light injury reduced ICAM-1 expression in the HaCat cell model and had no significant effect on the expressions of VCAM-1 and ELAM-1（P<0.01）.The expressions of the three CAMs in the HaCat cell model were effectively inhibited in the G group（P<0.05），while those of ELAM-1 and VCAM-1 were considerably impeded in the Z group（P<0.01）.It was also found that acute UVB light injury had no significant effect on AKT phosphorylation and PI3K expression in the HaCat cell model.The low-concentration treatment of Haoqin Huaban Forumla can promote the phosphorylation of AKT in HaCat cells（P<0.05）.Acute UVB light damage increased the GSK-3β expression level of HaCat cells（P<0.01）.The high，medium and low concentration treatments of Haoqin Huaban Formula inhibited the GSK-3β expression level of HaCat cells（P<0.01）.Conclusion：Haoqin-Huaban Formula can reduce the expression of adhesion molecules such as ICAM-1，ELAM-1 and VCAM-1 in HaCat cells caused by acute UVB damage，thereby alleviating the occurrence of local inflammation and delayed-type hypersensitivity，and can activate HaCat cells PI3K/AKT/GSK-3β pathway and plays a role in anti-oxidation，anti-apoptosis and reducing inflammation in the acute light damage caused by UVB.

Keywords Photosensitive skin disease; Haoqin-Huaban Formula; AKT; GSK-3β; Cell adhesion molecule; HaCat cells; Ultraviolet B; Ultraviolet injury

中圖分類號(hào)：R289.5;R275.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.012

光敏感性皮膚病是由紫外線照射造成皮膚多種病理反應(yīng)的一系列疾病，其包括急性光損傷、慢性光老化、光變態(tài)反應(yīng)（如多形性日光疹）等，甚至能夠誘發(fā)皮膚腫瘤，其臨床表現(xiàn)通常以日光暴露部位出現(xiàn)紅斑、水腫及多形性皮損，患者自覺(jué)灼熱瘙癢為主[1]。蒿秦化斑方，是在皮外科名老中醫(yī)趙炳南“光毒郁膚”理論基礎(chǔ)下創(chuàng)立而來(lái)，以“清熱、解毒、涼血”為法，在治療光敏感性皮膚病方面具有較好療效。研究發(fā)現(xiàn)，蒿秦化斑方具有增強(qiáng)細(xì)胞活性、抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達(dá)的作用。光敏感性皮膚病在臨床中的主要表現(xiàn)為組織學(xué)上的炎癥和表皮細(xì)胞的病理變化，皮膚的炎癥性損害往往依賴于各種細(xì)胞的相互作用，有研究顯示紫外線造成的皮膚局部超敏反應(yīng)可能與細(xì)胞黏附分子的表達(dá)相關(guān)，細(xì)胞黏附分子的表達(dá)能夠誘導(dǎo)皮膚炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而產(chǎn)生局部炎癥和皮膚濕疹樣改變[2]。除此之外，既往研究顯示PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活具有抑制氧化應(yīng)激、促進(jìn)增殖、抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等作用[3-4]，這與紫外線輻射誘發(fā)的光敏感性皮膚病的發(fā)病機(jī)制較為一致。本研究以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（Human Skin Keratinocytes，HaCat）為研究對(duì)象，探索蒿秦化斑方緩解紫外線B（Ultraviolet B，UVB）損傷的潛在機(jī)制，以證明蒿秦化斑方保護(hù)HaCat細(xì)胞免受UVB輻射損傷的功效。探究了HaCat細(xì)胞相關(guān)黏附分子，細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子-1（ELAM-1），以及PI3K/AKT/GSK-3β通路相關(guān)靶點(diǎn)，肌酸肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的影響，進(jìn)一步探討該方治療光敏感性皮膚病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與培養(yǎng) HaCat細(xì)胞由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院（編號(hào)：3111C0001CCC000373）提供，HaCat細(xì)胞在1460培養(yǎng)基中加入10%牛胎血清，在37 ℃，5%二氧化碳劑量的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度大于80%，以胰酶（0.25%）消化后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 藥物 蒿秦化斑方組方與劑量均按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）規(guī)定執(zhí)行，方劑組成：青蒿30 g、龍膽草10 g、水牛角15 g、生地黃15 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、防風(fēng)15 g、生甘草6 g。實(shí)驗(yàn)藥物由北京中醫(yī)醫(yī)院飲片藥房提供（盛世隆藥業(yè)有限公司）提供。參照前期課題實(shí)驗(yàn)方法制備實(shí)驗(yàn)用藥液[5]，高劑量中藥為最大無(wú)毒劑量C（C=12.1 mg/L）、中劑量中藥為2/C、低劑量中藥為4/C。

1.1.3 主要試劑與儀器 RIPA總蛋白提取試劑盒（Sigma，美國(guó)，貨號(hào)：R0278）;BCA蛋白定量試劑盒（Sigma，美國(guó)，貨號(hào)：BCA1）;NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit（Thermo，美國(guó)，貨號(hào)：NP0050）;NuPAGE Transfer Buffer（20X）（Thermo，美國(guó)，貨號(hào)：NP0061）;TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP405-02）;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本，貨號(hào)：RR047B）;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ ROX plus（TaKaRa，日本，貨號(hào)：RR82LR）;DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本，貨號(hào)：3427Q）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO，日本，型號(hào)：MCO-15AC）;分光光度計(jì)（Therno scientific，美國(guó)，型號(hào)：NANODROP 2000）;酶標(biāo)儀（Therno scientific，美國(guó)，型號(hào)：MultiSkan3）;電泳儀（Therno scientific，美國(guó)，型號(hào)：Mini Ge Tank）;轉(zhuǎn)膜儀（Therno scientific，美國(guó)，型號(hào)：Mini Blot Module）;凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon 1600）;熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)，型號(hào)：ABI7500）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 將上述細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、蒿秦化斑方高、中、低劑量組5組，空白對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。其余各組置于UVB燈下給予單次劑量300 mJ/cm2的UVB輻射，UVB光照使用UV236照射系統(tǒng)（Waldmann Medizintechnik，Villingen-Schwenningen，德國(guó)）進(jìn)行照射，使用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的光度計(jì)（Waldmann）計(jì)量照射強(qiáng)度。UVB照射15 min后蒿秦化斑方高、中、低劑量組分別加入12.1 mg/mL（C）、6.05 mg/mL（2/C）、3.25 mg/mL（4/C）劑量中藥，作用24 h。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明，使用TRNzol總RNA提取試劑盒對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，使用NanoDrop ND-2000進(jìn)行RNA純度鑒定，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后按說(shuō)明進(jìn)行Real Time-PCR檢測(cè)，每組進(jìn)行3孔重復(fù)，以測(cè)量RNA表達(dá)。用2-△△Ct方法計(jì)算RNA水平，并標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，實(shí)驗(yàn)使用引物序列。見(jiàn)表1。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法分析 使用補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。使用Bradford方法，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)水平。通過(guò)電泳分離總蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到NC膜上，將NC膜用5%脫脂奶粉-TBS在37 ℃下封閉半小時(shí)，然后在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜。一抗包括：抗PI3K抗體（1∶1 000），抗p-AKT抗體（308）（1∶1 000），抗p-AKT抗體（473）（1∶2 000），抗mTOR抗體（1∶500）GSK-3β抗體（1∶1 000）。溫育后，每次用TBST沖洗NC膜5次，每次約3 min，以除去過(guò)量的單克隆溶液.然后用二抗孵育，用5%脫脂奶粉-TBS稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L），HRP（1∶20 000），孵育40 min。內(nèi)參蛋白組以Stripping Buffer、去離子水、TBST洗膜，將NC膜用5%脫脂奶粉-TBS在37 ℃下封閉半小時(shí)，加GAPDH鼠單抗（1∶10 000），溫育40 min;用5%脫脂奶粉-TBS稀釋二抗，山羊抗鼠IgG（H+L），HRP（1∶10 000），孵育40 min。之后進(jìn)行TBST洗膜并與ECL反應(yīng)，并對(duì)進(jìn)行膠片曝光顯影，2 min后定影，對(duì)影像進(jìn)行相對(duì)灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組及以上組間差異采用單因素方差分析以及Tukey檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞黏附分子相對(duì)表達(dá)水平 在HaCat細(xì)胞UVB急性光損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，經(jīng)UVB照射處理與中藥高劑量組處理的HaCat細(xì)胞ICAM-1相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01），中、低劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細(xì)胞ICAM-1表達(dá)量較模型組有所回升（P<0.01）;高、中劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細(xì)胞ELAM-1與VCAM-1表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 各組PI3K/AKT/GSK-3β通路標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)水平 在HaCat細(xì)胞UVB急性光損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，經(jīng)UVB照射處理的HaCat細(xì)胞p-AKT（Thr-308）表達(dá)顯著降低（P<0.01），GSK-3β表達(dá)顯著增高（P<0.01）;與模型組比較低劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細(xì)胞p-AKT（Thr-308）表達(dá)量有所回升（P<0.05），與模型組比較高、中、低劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細(xì)胞GSK-3β表達(dá)量有所下降（P<0.01）;此外與模型組比較中劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細(xì)胞PI3K表達(dá)量有所下降（P<0.01）。見(jiàn)表3。

3 討論

蒿秦化斑方是在皮科知名專家趙炳南教授驗(yàn)方的基礎(chǔ)上逐漸完善而成，以“光毒郁膚”為理論基礎(chǔ)，以清熱涼血解毒為主要原則。方中以青蒿為君藥，青蒿善解常夏之暑熱，清中有透散之力，可引邪外出，宣化濕熱，使血分伏熱外透而出。方中水牛角、生地黃、秦艽共為臣藥，水牛角咸寒，清熱解毒，專入血分，平熱降火;生地黃味甘苦寒，協(xié)水牛角行清熱涼血化斑、滋陰生津之效，秦艽能驅(qū)一身之風(fēng)，祛風(fēng)除濕，清熱利尿，利濕與泄熱并進(jìn)，瘀熱得去，濕濁自退。方中牡丹皮、赤芍、防風(fēng)為佐藥，共擔(dān)清熱涼血，活血散瘀，化斑之功效，牡丹皮味苦性辛微寒入心、肝腎經(jīng)，善清血中伏熱，且活血散瘀之力亦佳，赤芍清熱涼血、散瘀消腫，能使血流暢而不流瘀，防風(fēng)祛風(fēng)解表止癢，牡丹皮治風(fēng)熱在膚瘙癢劇烈者。此外在現(xiàn)代藥理學(xué)的研究中蒿秦化斑方中藥味也多有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，青蒿主要有效成分為青蒿素，相關(guān)衍生物為青蒿琥酯等，研究顯示，青蒿及其衍生物具有抑制IL-6、IL-10、TNF-α等炎癥介質(zhì)表達(dá)，對(duì)T細(xì)胞相關(guān)皮膚超敏反應(yīng)具有一定的抑制作用[6]。生地黃有效成分梓醇能夠抑制細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，并且可以抑制核因子κB以及IL-β、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[7]。牡丹皮中有效成分丹皮酚具有較好的抗氧化能力，同時(shí)能夠抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)，并具有抗細(xì)胞凋亡的作用[8-9]。赤芍的有效成分中包含較多黃酮類及苷類化合物，可減少細(xì)胞氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，并且能夠降低細(xì)胞炎癥介質(zhì)如TNF-α和IL-6的水平[10-11]。防風(fēng)的色原酮、多糖及揮發(fā)油均有較強(qiáng)的抗氧化作用，且能通過(guò)核因子κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[12-13]。有實(shí)驗(yàn)證明甘草提取物甘草酸能夠通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)和抗氧化從而減緩HaCat細(xì)胞光老化效應(yīng)，并且能夠抑制凋亡執(zhí)行蛋白的表達(dá)以達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用[14]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，蒿秦化斑方能夠抑制細(xì)胞凋亡增加細(xì)胞增殖活性，并且能夠增加SOD、CAT的表達(dá)，減少M(fèi)DA的表達(dá)從而抑制UVB誘導(dǎo)的HaCat細(xì)胞氧化損傷，并且可以降低HaCat細(xì)胞中IL-10的表達(dá)提高TGF-β的表達(dá)抑制UVB誘導(dǎo)的HaCat細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可以初步推測(cè)蒿秦化斑方具有抑制氧化應(yīng)激，下調(diào)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，修復(fù)細(xì)胞屏障功能[5]。

細(xì)胞黏附分子是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互結(jié)合且起黏附作用的膜表面糖蛋白[15-17]，廣泛參與炎癥免疫反應(yīng)，在皮膚科領(lǐng)域，細(xì)胞黏附分子與銀屑病、特應(yīng)性皮炎、慢性蕁麻疹、紅斑狼瘡均有較為密切的病理關(guān)系，細(xì)胞黏附分子的高表達(dá)常在一些炎癥性皮膚疾病、遲發(fā)型超敏反應(yīng)，感染性皮膚疾病中出現(xiàn)，在這些疾病過(guò)程中細(xì)胞黏附分子可促進(jìn)趨化因子和炎癥介質(zhì)的釋放，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的黏附作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞向炎癥部位浸潤(rùn)，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。在光敏感性皮膚疾病中，已有研究證明多形日光疹發(fā)病可能與細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)，紫外線誘導(dǎo)多形日光疹皮損與細(xì)胞黏附分子ELAM-1、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)密切相關(guān)，VCAM-1和ELAM-1促進(jìn)免疫細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附，多形日光疹的局部炎癥反應(yīng)時(shí)效應(yīng)T細(xì)胞通過(guò)表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子或受體配相互體作用使細(xì)胞黏附分子表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞上，從而促使具有互補(bǔ)表面受體結(jié)構(gòu)的白細(xì)胞向局部炎癥部位浸潤(rùn)，其黏附分子誘導(dǎo)局部炎癥的方式與皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)類似[18]。多形日光疹患者皮損部位細(xì)胞黏附分子及抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)力提高，黏附分子是參與多形日光疹發(fā)病機(jī)制的一類重要分子[19]。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)UVB照射建立HaCat急性光損傷模型，結(jié)果顯示與紫外線誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)不同，在HaCat急性光損傷的情況下對(duì)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)影響較小，只有ICAM-1的表達(dá)有所減低，結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期試驗(yàn)結(jié)果考慮，這可能與急性光損傷所引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)，但通過(guò)與空白組對(duì)比蒿秦化斑方高劑量組能夠有效降低ICAM-1、ELAM-1及VCAM-1 3種細(xì)胞黏附分子的表達(dá);蒿秦化斑方中劑量組能夠較為有效地抑制ELAM-1以及VCAM-1的表達(dá)，可見(jiàn)蒿秦化斑方對(duì)HaCat細(xì)胞UVB急性光損傷模型ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1相關(guān)炎癥反應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，可以推測(cè)蒿秦化斑方可能通過(guò)降低HaCat細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而減少相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá)和嗜酸性粒細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而具有一定抑制局部皮膚炎癥的作用，且更可能對(duì)紫外線誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有干預(yù)效果。

GSK-3β參與多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括代謝、分化和免疫，以及細(xì)胞的凋亡和成活[20]。GSK-3β在底物識(shí)別和激酶活性調(diào)節(jié)方面具有獨(dú)特的特點(diǎn)，其具有大量的磷酸化靶點(diǎn)，因此其廣泛的參與到多種細(xì)胞生物過(guò)程的調(diào)控當(dāng)中。如GSK-3β活性受PI3K/AKT信號(hào)的抑制，相反當(dāng)PI3K/AKT通路失活時(shí)，GSK-3β表現(xiàn)出促凋亡的作用，而當(dāng)PI3K在質(zhì)膜上被募集，其經(jīng)過(guò)相關(guān)細(xì)胞膜脂質(zhì)的相關(guān)磷酸化后促進(jìn)了AKT的募集以及磷酸化，AKT在氨基酸殘基T308和S473上的磷酸化激活后，會(huì)在其N端磷酸化GSK-3β，這導(dǎo)致GSK-3β的失活，有研究顯示PI3K/AKT通路的激活可使GSK-3β的活性降低40%～50%，進(jìn)而與Bcl-2等抗凋亡蛋白協(xié)同體現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡的作用。除此之外GSK-3β還是免疫系統(tǒng)許多組分的調(diào)節(jié)要素[21]，GSK-3β對(duì)于TLR的激活在細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生中至關(guān)重要，研究顯示抑制GSK-3β的活性能夠有效抑制細(xì)胞炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-8、TNF的表達(dá)，并且能夠抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以降低免疫細(xì)胞的募集作用，同時(shí)抑制GSK-3β還能夠還可以提高Treg的表達(dá)以及成活以抑制炎癥的發(fā)生。另研究指出激活PI3K/AKT/GSK-3β通路提高磷酸化GSK-3β的水平，可以通過(guò)抑制細(xì)胞NOX和iNOS的表達(dá)而表現(xiàn)出抗氧化活性[3]。在本實(shí)驗(yàn)中，UVB處理對(duì)HaCat細(xì)胞AKT Thr-308位點(diǎn)磷酸化具有一定的抑制作用，蒿秦化斑方低劑量處理對(duì)HaCat細(xì)胞AKT Thr-308位點(diǎn)磷酸化具有促進(jìn)作用，HaCat細(xì)胞GSK-3β表達(dá)會(huì)因UVB輻射而增加，蒿秦化斑方處理對(duì)HaCat細(xì)胞GSK-3β表達(dá)水平有所抑制，這可能與蒿秦化斑方促進(jìn)PI3K、AKT的磷酸化相關(guān)，可見(jiàn)蒿秦化斑方對(duì)UVB輻射損傷HaCat細(xì)胞PI3K/AKT/GSK-3β通路具有一定調(diào)節(jié)作用，這與我們?cè)谇捌谘芯恐械玫狡淠軌蚩沟蛲?、抗氧化、降低炎癥水平的結(jié)果一致，可以推測(cè)蒿秦化斑方的藥理作用途徑很有可能與PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活有關(guān)。

總之，蒿秦化斑方能夠以降低由UVB輻射急性損傷造成的HaCat細(xì)胞ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達(dá)進(jìn)而緩解局部炎癥和遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，并且能夠激活HaCat細(xì)胞PI3K/AKT/GSK-3β通路，在UVB造成的細(xì)胞損傷中起到抗氧化、抗凋亡和降低炎癥反應(yīng)的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]孫麗蘊(yùn)，王萍，楊博華，等.光敏性皮膚病的中醫(yī)研究進(jìn)展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5（9）：809-913.

[2]李建仁.308 nmφ分子光與窄譜中波紫外線在白癜風(fēng)患者治療中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2016，11（11）：103-105.

[3]Chen L，Wei X，Hou Y，et al.Tetramethylpyrazine analogue CXC195 protects against cerebral ischemia/reperfusion-induced apoptosis through PI3K/Akt/GSK3β pathway in rats[J].Neurochem Int，2014，66：27-32.

[4]Zeng T，Zhang CL，Song FY，et al.CMZ reversed chronic ethanol-induced disturbance of PPAR-α possibly by suppressing oxidative stress and PGC-1α acetylation，and activating the MAPK and GSK3β pathway[J].PLoS One，2014，9（6）：e98658.

[5]馮丹，劉婷，李冠汝，等.蒿秦化斑方對(duì)紫外線B誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2020，13（5）：778-783.

[6]李琛琛，尹昆，閆歌.抗瘧藥青蒿素及其衍生物相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2016，11（2）：185-188.

[7]黃傳君，趙方正，張才擎.生地黃有效成分梓醇藥理作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2017，51（2）：93-97.

[8]伍淳操，郭小紅，劉霞，等.近5年牡丹皮現(xiàn)代藥學(xué)作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2020，29（3）：281-284.

[9]蔣麗麗，張彥龍，王春杰，等.牡丹皮中有效成分丹皮酚的藥理活性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代診斷與治療，2016，27（22）：4223-4224.

[10]陸小華，馬驍，王建，等.赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（4）：595-602.

[11]吳修紅，孫曉蘭，胡妮娜，等.赤芍功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（2）：120-122.

[12]劉雙利，姜程曦，趙巖，等.防風(fēng)化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2017，48（10）：2146-2152.

[13]辛國(guó)，李鑫，黃曉巍.防風(fēng)化學(xué)成分及藥理作用[J].吉林中醫(yī)藥，2018，38（11）：1323-1325.

[14]李想，李冀.甘草提取物活性成分藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥，2019，51（5）：81-86.

[15]Chen L，Lin SX，Amin S，et al.VCAM-1 blockade delays disease onset，reduces disease severity and inflammatory cells in an atopic dermatitis model[J].Immunol Cell Biol，2010，88（3）：334-342.

[16]Cabrijan L，Batinac T，Lenkovic M，et al.The distinction between lesional and non-lesional skin in psoriasis vulgaris through expression of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1[J].Med Hypotheses，2009，72（3）：327-329.

[17]朱卉雯，田靜，陳家惠，等.健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方對(duì)脾虛型濕疹小鼠ICAM-1及VCAM-1的影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2015，29（2）：193-196.

[18]彭麗倩，江娜，劉清，等.多形性日光疹發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展[J].皮膚性病診療學(xué)雜志，2016，23（2）：133-135.

[19]Bansal I，Kerr H，Janiga JJ，et al.Pinpoint papular variant of polymorphous light eruption：clinical and pathological correlation[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2006，20（4）：406-410.

[20]Maurer U，Preiss F，Brauns-Schubert P，et al.GSK-3-at the crossroads of cell death and survival[J].J Cell Sci，2014，127（Pt 7）：1369-1378.

[21]Beurel E，Michalek SM，Jope RS.Innate and adaptive immune responses regulated by glycogen synthase kinase-3（GSK3）[J].Trends Immunol，2010，31（1）：24-31.

（2020-11-27收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）