槲皮素通過(guò)ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)下大鼠心肌收縮蛋白表達(dá)的影響

賈夢(mèng)楠 朱明軍 王永霞 李彬 郝軒軒 王新陸 于瑞 常鑫迪 李潔薇

中圖分類號(hào) R96;R541 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）23-2839-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.05

摘 要 目的：探討槲皮素（Que）通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-血管緊張素-（1-7）-Mas軸[ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸]對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)下原代大鼠心肌收縮蛋白表達(dá)的影響。方法：取1～2 d 日齡大鼠的心肌組織，分離、培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，并構(gòu)建心肌細(xì)胞ACE2基因沉默模型。實(shí)驗(yàn)分為12組，其中AngⅡ組、AngⅡ+小干擾RNA（siRNA）組、AngⅡ+A779組為模型組，AngⅡ+氯沙坦組為陽(yáng)性對(duì)照組，AngⅡ+Que40組、AngⅡ+Que80組、AngⅡ+siRNA+Que40組、AngⅡ+siRNA+Que80組、AngⅡ+A779+Que40組、AngⅡ+A779+Que80組為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)空白組、siRNA組。其中AngⅡ終濃度為1×10-6 mol/L，siRNA終濃度為50 nmol/L，Que終濃度分別為40、80 μmol/L，A779（Mas受體拮抗劑）終濃度為1 μmol/L，氯沙坦終濃度為1×10-4 mol/L。分別檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及Na+/Ca2+交換通道（NCX）、鈣泵（SERCA2a）、磷蛋白（PLB）等3種心肌收縮蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與AngⅡ組比較，AngⅡ+Que80組細(xì)胞中的Mas mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）;AngⅡ+氯沙坦組細(xì)胞中的ACE2、Mas mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Que40組細(xì)胞中的ACE2、Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）;與AngⅡ+siRNA組比較，僅AngⅡ+siRNA+Que40組Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）;與AngⅡ+A779組比較，僅AngⅡ+A779+Que40組Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Que40組NCX蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），AngⅡ+氯沙坦組NCX蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）;與AngⅡ+A779組比較，AngⅡ+A779+ Que80組NCX蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。結(jié)論：Que一定程度上提高了AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞模型中ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)心肌收縮蛋白。

關(guān)鍵詞 槲皮素;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-血管緊張素（1-7）-Mas軸;心肌細(xì)胞;血管緊張素Ⅱ;心肌收縮蛋白

Effects of Quercetin on the Expression of Ang Ⅱ-induced Myocardial Contractile Protein of Rats through ACE2-Ang-（1-7）-Mas Axis

JIA Mengnan1，ZHU Mingjun2，WANG Yongxia2，LI Bin2，HAO Xuanxuan1，WANG Xinlu2，YU Rui2，CHANG Xindi1，LI Jiewei1（1. Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China; 2. Heart Center， the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450099， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of quercetin （Que） on the expression of angiotensin Ⅱ （AngⅡ）-induced myocardial contractile proteins of primary rats through angiotensin-converting enzyme 2-angiotensin-（1-7）-Mas （ACE2-Ang-（1-7）-Mas） axis. METHODS： Cardiac tissue of rats aged 1-2 d were collected， and primary cardiomyocytes were isolated and cultured. The gene silencing model of cardiomyocytes ACE2 was constructed. Experiments were divided into 12 groups. Among them， AngⅡ group， AngⅡ+ small interference RNA （siRNA） group， and AngⅡ+ A779 group were the model groups; AngⅡ+losartan group was? positive control group; AngⅡ+Que40 group， AngⅡ+Que80 group， AngⅡ+siRNA+Que40 group， AngⅡ+siRNA+Que80 group， AngⅡ+A779+Que40 group and AngⅡ+A779+Que80 group were the experimental groups; blank group and siRNA group were set up. AngⅡ concentration was 1×10-6 mol/L; siRNA final concentration was 50 nmol/L; Que concentration was 40 and 80 μmol/L; A779 （Mas receptor inhibitor） concentration was 1 μmol/L; losartan concentration was 1×10-4 mol/L. mRNA and protein expression of ACE2， Ang-（1-7） and Mas in primary cardiomyocytes were detected; the expressions of myocardial contractile proteins were also determined， such as Na+/Ca2+ exchange channel （NCX）， calcium pump （SERCA2a）， phosphoprotein （PLB）. RESULTS： Compared with AngⅡ group， mRNA expression of Mas was increased significantly in AngⅡ+Que80 group （P<0.05）; mRNA expression of ACE2 and Mas were increased significantly in AngⅡ+ losartan group （P<0.05）. Compared with AngⅡ group， the protein expression of ACE2 and Ang-（1-7） were increased significantly in AngⅡ+Que40 group （P<0.05）; compared with AngⅡ+siRNA group， the protein expression of Ang-（1-7） were increased significantly in AngⅡ+ siRNA+Que40 group （P<0.05）; compared with AngⅡ+A779 group， the protein expression of Ang-（1-7） were increased significantly in AngⅡ+A779+ Que40 group （P<0.05）. Compared with AngⅡ group， the protein expression of NCX was decreased in AngⅡ+Que40 group （P<0.05）， protein expression of NCX was reduced in AngⅡ+losartan group （P<0.05）; compared with AngⅡ+A779 group， the protein expression of NCX was decreased in AngⅡ+A779+ Que80 group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Que improves the expression of AngⅡ-induced ACE2-Ang-（1-7）-Mas axis in cardiomyocyte model to some extent， so as to regulate myocardial contractile protein.

KEYWORDS? ?Quercetin; ACE2-Ang-（1-7）-Mas axis; Cardiomyocytes; Angiotensin Ⅱ; Myocardial contractile protein

心力衰竭是多種心臟疾病的終末期階段，其主要的病理特征是心肌收縮力下降和心功能降低[1]。腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)是廣泛存在于心血管循環(huán)的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其過(guò)度激活是導(dǎo)致心力衰竭進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ1型受體軸（ACE-AngⅡ-AT1R軸）是RAS系統(tǒng)的重要組成部分;其中AngⅡ是關(guān)鍵因子，可引起心肌收縮力下降等多種心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)[2]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，RAS系統(tǒng)中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-血管緊張素-（1-7）- Mas軸[ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸]可拮抗ACE-AngⅡ- AT1R軸;其中ACE2是關(guān)鍵因子，它可有效地將AngⅡ降解為Ang-（1-7），后者與其特異性受體Mas結(jié)合從而抑制ACE-AngⅡ-AT1R軸造成的不良反應(yīng)，增加心肌收縮力[3]。

心肌收縮力與Ca2+循環(huán)有著密切聯(lián)系，Na+/Ca2+交換通道（NCX）、鈣泵（SERCA2a）、磷蛋白（PLB）是心肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)心肌收縮力的主要蛋白：NCX能夠交換細(xì)胞內(nèi)外的Na+和Ca2+從而維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)[4];SERCA2a是介導(dǎo)心肌細(xì)胞Ca2+重新進(jìn)入肌漿網(wǎng)的關(guān)鍵蛋白，可將細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+重新攝取到肌漿網(wǎng)中，使心肌細(xì)胞松弛，從而維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)[5];PLB可影響SERCA2a與Ca2+的親和力進(jìn)而調(diào)節(jié)Ca2+的攝取，主要通過(guò)SERCA2a發(fā)揮作用[6]。上述心肌收縮蛋白通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)來(lái)保持心肌收縮力，其異常表達(dá)是心功能降低和心室重構(gòu)的重要原因[7]。

槲皮素（quercetin，Que）是天然黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗增殖、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)活性[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，Que可調(diào)節(jié)心肌收縮蛋白、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、改善心肌收縮力[10]，但其是否可通過(guò)作用于ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸來(lái)影響心肌收縮蛋白的表達(dá)，尚不明確。本研究采用RNA干擾的方法沉默ACE2基因來(lái)阻斷ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸上游，以探討Que是否通過(guò)該信號(hào)軸調(diào)控心肌收縮蛋白;并使用Mas受體的特異性拮抗劑A779同Ang-（1-7）競(jìng)爭(zhēng)性地與Mas結(jié)合來(lái)阻斷該信號(hào)軸下游[11]，以進(jìn)一步驗(yàn)證Que是否通過(guò)該信號(hào)軸調(diào)控心肌收縮蛋白。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器包括SpectraMax M3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），ROC-3000TVBB型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Revco公司），LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司），DMI3006型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），CK40型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），Alpha 1106分光光度計(jì)（上海譜元儀器有限公司），164-5050電泳儀、Mini-Protean垂直電泳槽、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Biofuge Stratos型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），F(xiàn)C-96G 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（杭州比格飛序生物科技有限公司），ABI 7500 Fast型熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究使用的主要藥品包括：Que（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)Q817161），A779（南京肽業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)NJP90025-181225），氯沙坦對(duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)124750-99-8），AngⅡ（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)4474-91-3）。本研究使用的主要試劑包括：胎牛血清（以色列Bioland公司，批號(hào)04-001-1A），DMEM培養(yǎng)基、膠原酶Ⅱ、4%組織細(xì)胞固定液、二甲基亞砜、CCK-8試劑盒、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為12100、C8150、P1110、D8371、CA1210、20190606、P0100、PC0020、P1200、IB0260），RIPA細(xì)胞裂解液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)OC183166），Trizol試劑（美國(guó)Ambion Life公司，批號(hào)103105），? ? ? INTERFERin?轉(zhuǎn)染試劑（法國(guó)Polyplus Transfection公司，批號(hào)PT-409-10），Opti-MEMTM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)31985062），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)10494-1-AP），ACE2兔多克隆抗體、NCX小鼠單克隆抗體、SERCA2a兔多克隆抗體、PLB兔多克隆抗體（美國(guó)GeneTex公司，批號(hào)分別為GTX101395、GTX22869、GTX22861、TX109254），Ang-（1-7）兔多克隆抗體（武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，批號(hào)PAS085Ra01），Mas兔多克隆抗體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)分別為PA5-43668、4368814），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)ISEQ00010）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康SPF級(jí)SD大鼠，日齡1～2 d，體質(zhì)量約5 g。大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2017-0001。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)規(guī)定進(jìn)行（倫理號(hào)YFYDW2018004）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原代心肌細(xì)胞的分離

取日齡1～2 d的大鼠置于超凈臺(tái)下，以乙醇消毒后開(kāi)胸取心室部分組織，以預(yù)冷滅菌的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗后，剪成1～2 mm3大小組織塊;加入15 mL心肌細(xì)胞消化液，將組織轉(zhuǎn)移至滅菌過(guò)的50 mL玻璃瓶中攪拌10 min;靜置，棄上清液，加入10 mL 0.1% 膠原酶Ⅱ繼續(xù)消化10 min;靜置，抽取上清液，加入10%胎牛血清的含雙抗DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“全培養(yǎng)基”）制成細(xì)胞懸液，暫置于37 ℃培養(yǎng)箱。共消化4～5次，直至組織塊消失。收集合并細(xì)胞懸液于15 mL 離心管中，以1 200? r/min離心10 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀并輕輕吹打，過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)。將所得細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1.5 h，所得懸浮細(xì)胞為心肌細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為成纖維細(xì)胞[12]。

2.2 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

收集“2.1”項(xiàng)下分離的心肌細(xì)胞于15 mL離心管中，以1 200 r/min離心10 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基，按1×105 mL-1密度接種于6孔板或96孔板，加入BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng);24 h后觀察，心肌細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng);更換完全培養(yǎng)基，加入BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng);繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，觀察可見(jiàn)細(xì)胞已成細(xì)胞簇，且搏動(dòng)明顯、節(jié)律一致，可用于后續(xù)基因沉默、加藥等實(shí)驗(yàn)[12]。

2.3 原代心肌細(xì)胞ACE2基因沉默模型的構(gòu)建

取“2.2”項(xiàng)下心肌細(xì)胞，更換含10%胎牛血清不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染以沉默ACE2基因。將第2代心肌細(xì)胞以1×105 mL-1的密度接種于6孔板中，以完全培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24 h后，觀察可見(jiàn)心肌細(xì)胞融合至60%～70%;更換為含10%胎牛血清不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染步驟為：①將11 μL小干擾RNA（siRNA）加入到200 μL Opti-MEMTM培養(yǎng)基（siRNA終濃度為50 nmol/L），于室溫渦旋5 s，瞬時(shí)離心;加入10 μL INTERFERin? 轉(zhuǎn)染試劑，于室溫混勻10 s，瞬時(shí)離心，再于37 ℃下孵育10 min。②加入完全培養(yǎng)基，每孔2 mL。③將“①”項(xiàng)下配制好的液體加入到6孔板中，輕晃搖勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由綠光激發(fā)出紅色熒光（發(fā)射光波長(zhǎng)為480 nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為525 nm）。計(jì)數(shù)熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為心肌成纖維細(xì)胞數(shù)（n），鏡下細(xì)胞總數(shù)為N，按公式計(jì)算轉(zhuǎn)染率：轉(zhuǎn)染率（%）=n/N×100%。若轉(zhuǎn)染率>60%即為轉(zhuǎn)染成功[13]，表示成功構(gòu)建原代心肌細(xì)胞ACE2基因沉默模型。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

實(shí)驗(yàn)分為12組，其中AngⅡ組、AngⅡ+siRNA組、AngⅡ+A779組為模型組，AngⅡ+氯沙坦組為陽(yáng)性對(duì)照組，AngⅡ+Que40組、AngⅡ+Que80組、AngⅡ+siRNA+Que40組、AngⅡ+siRNA+Que80組、AngⅡ+A779+ Que40組、AngⅡ+A779+Que80組為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)空白組、siRNA組?？瞻捉M：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。AngⅡ組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ。siRNA組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，按“2.3”項(xiàng)下方法沉默ACE2基因。AngⅡ+siRNA組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，按“2.3”項(xiàng)下方法沉默ACE2基因后，加入AngⅡ。AngⅡ+Que40組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ、Que（40 μmol/L）。AngⅡ+Que80組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ、Que（80 μmol/L）。AngⅡ+siRNA+Que40組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，按“2.3”項(xiàng)下方法沉默ACE2基因后，加入AngⅡ、Que（40 μmol/L）。AngⅡ+siRNA+Que80組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，按“2.3”項(xiàng)下方法沉默ACE2基因后，加入AngⅡ、 Que（80 μmol/L）。AngⅡ+A779組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ、A779。AngⅡ+A779+Que40組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ、 A779、 Que（40 μmol/L）。AngⅡ+ A779 + Que80組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ、 A779、Que（80 μmol/L）。AngⅡ+氯沙坦組：心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加入AngⅡ、氯沙坦（1×10-4 mol/L）?；谖墨I(xiàn)研究及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)CCK-8試劑盒梯度檢測(cè)心肌細(xì)胞活性的方法篩選AngⅡ、siRNA、A779、Que的適宜濃度，最終確定以AngⅡ終濃度為1×10-6 mol/L、siRNA終濃度為50 nmol/L、A779終濃度為1 μmol/L、Que終濃度為40 μmol/L及其2倍濃度80 μmol/L進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)及沉默ACE2基因后無(wú)血清同步化24 h，加入干預(yù)藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 各組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas? mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取心肌細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法分組干預(yù)后，以TRIzol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以GAPDH作為參照，在ABI 7500 Fast型PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)（PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1），重復(fù)3次。

2.6 各組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas及心肌收縮蛋表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot進(jìn)行檢測(cè)。取心肌細(xì)胞，按照“2.4”項(xiàng)下方法分組干預(yù)后，用磷酸鹽緩沖液清洗，加入RIPA裂解液適量于冰上孵育5 min;將裂解后的樣品以12 000 r/min離心5 min，取適量上清液通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，余上清液加入適量SDS-PAGE上樣緩沖液，于100 ℃變性5 min。取變性后的蛋白樣品適量，行15% SDS-PAGE;電泳后轉(zhuǎn)膜，以脫脂奶粉封閉2 h，加入內(nèi)參蛋白和各目的蛋白的一抗進(jìn)行雜交（各一抗稀釋度：GAPDH為1 ∶ 5 000，ACE2為1 ∶ 1 000，Ang-（1-7）為1 ∶ 500，Mas為1 ∶ 800，NCX為1 ∶ 1 000，SERCA2a為1 ∶ 1 000，PLB為1 ∶ 5 000），于4 ℃下孵育過(guò)夜;依次用 TBST溶液、TBS溶液在室溫下洗滌10 min×2次、10 min×1次后，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 或HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于室溫孵育1 h;依次用TBST溶液、TBS溶液在室溫下洗滌5 min×2次、5 min×1次后，以AP-NBT/BICT顯色液顯色，然后置于凝膠成像系統(tǒng)上成像。使用 Image J軟件分析，以ACE2、Ang-（1-7）、Mas、 NCX、SERCA2a、PLB與內(nèi)參蛋白GAPDH 的灰度值比值表示上述目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細(xì)胞ACE2基因沉默情況

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的原代心肌細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，轉(zhuǎn)染率>60%，表明實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原代心肌細(xì)胞ACE2基因沉默模型，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ACE2基因沉默模型原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染的熒光顯微圖見(jiàn)圖1。

3.2 各組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas的mRNA表達(dá)水平比較

與空白組比較，AngⅡ組和AngⅡ+ siRNA組細(xì)胞中ACE2、Mas以及AngⅡ+A779組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Que80組細(xì)胞中的Mas mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;AngⅡ+氯沙坦組細(xì)胞中的ACE2、Mas mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞ACE2、Ang-（1-7）、Mas的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 各組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas的蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比較，AngⅡ組、AngⅡ+ siRNA組和AngⅡ+A779組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Que40組細(xì)胞中ACE2、Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與AngⅡ+siRNA組比較，僅AngⅡ+siRNA+ Que40組細(xì)胞中Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與AngⅡ+A779組比較，僅AngⅡ+A779+ Que40組細(xì)胞中Ang-（1-7）蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞ACE2、Ang-（1-7）、Mas蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果及電泳圖見(jiàn)表3、圖2。

3.4 各組細(xì)胞中心肌收縮蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比較，AngⅡ組細(xì)胞中NCX蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;AngⅡ+ siRNA組細(xì)胞中PLB、SERCA2a蛋白表達(dá)水平均顯著降低，NCX蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;AngⅡ+A779組細(xì)胞中SERCA2a蛋白表達(dá)水平顯著降低，NCX蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Que40組細(xì)胞中NCX蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;AngⅡ+氯沙坦組細(xì)胞中NCX蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與AngⅡ+A779組比較，AngⅡ+A779+Que80組細(xì)胞中NCX蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各組細(xì)胞中NCX、SERCA2a、PLB的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果及電泳圖見(jiàn)表4、圖3。

4 討論

正常情況下，RAS系統(tǒng)中ACE-AngⅡ-AT1R軸和ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸處于動(dòng)態(tài)平衡中;當(dāng)發(fā)生心力衰竭時(shí)，AngⅡ活性的增加使心肌細(xì)胞肥大、凋亡，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)。研究表明，心力衰竭模型大鼠心肌細(xì)胞基礎(chǔ)收縮力、舒張力及Ca2+濃度均降低，AngⅡ刺激的心肌細(xì)胞功能和Ca2+濃度反應(yīng)明顯減弱[14]。心臟中的正性肌力是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化調(diào)節(jié)的，即Ca2+濃度變化介導(dǎo)了心肌的興奮-收縮偶聯(lián)機(jī)制，而Ca2+的濃度變化與PLB、SERCA2a、NCX蛋白密切相關(guān)[15]。發(fā)生心力衰竭以后，AT1R數(shù)量的改變、AngⅡ-AT1R介導(dǎo)的Ca2+濃度變化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變等因素導(dǎo)致心臟對(duì)AngⅡ刺激的收縮反應(yīng)發(fā)生改變。AngⅡ通過(guò)AT1R與幾種酪氨酸激酶相互作用，AT1R介導(dǎo)的AT1通路因細(xì)胞類型不同而不同，加劇Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，這可能是心力衰竭發(fā)生后心肌收縮力和舒張力效應(yīng)改變的原因[16]。ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸在心力衰竭過(guò)程中可改變心肌收縮力。有研究表明，ACE2基因缺失的小鼠心肌收縮力受損[17]。Ang-（1-7）的積聚與左心室舒張末壓升高直接相關(guān)，能增加細(xì)胞內(nèi)鈣電流參與Ca2+穩(wěn)態(tài)和心肌收縮力的調(diào)節(jié)[18-19]。敲除Mas基因的小鼠心功能下降，鈣電流峰值時(shí)間延長(zhǎng)[20-21]。

Que的生物學(xué)活性可能與RAS系統(tǒng)有關(guān)。有研究表明，Que可通過(guò)降低ACE的mRNA表達(dá)水平，抑制ACE活性，從而阻斷RAS系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)[22]。給予Que處理的大鼠，其ACE的作用明顯被抑制;給予一定濃度的Que可以降低AngⅠ引起的高血壓反應(yīng)[23]。Que還可改善AngⅡ誘導(dǎo)的原代大鼠心肌細(xì)胞及H9C2心肌細(xì)胞株的細(xì)胞肥大[24-25]，抑制氧化應(yīng)激，改善線粒體功能，保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷[26]。Que亦可抑制心肌細(xì)胞缺氧損傷從而減少心肌細(xì)胞凋亡，維持存活的心肌細(xì)胞數(shù)量[27-28]。研究表明，Que在低濃度時(shí)抑制PLB的活性，在較高濃度時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制SERCA2a的活性，從而刺激離體心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)的SERCA2a活性[10]。另有研究表明，Que的變力作用與洋地黃類似，通過(guò)抑制肌膜上的Na+/K+-ATP酶而增強(qiáng)鈣瞬變，進(jìn)而通過(guò)減少質(zhì)膜上的Na+/Ca2+交換而抑制細(xì)胞質(zhì)Ca2+的排出，增強(qiáng)心肌細(xì)胞肌節(jié)縮短的幅度和心肌肌絲的收縮性，從而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生正性肌力作用[29-30]。

本研究結(jié)果顯示，在AngⅡ誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞中加入Que后，細(xì)胞中ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸上各mRNA及蛋白表達(dá)增加，心肌收縮蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)發(fā)生變化，提示Que可以提高AngⅡ誘導(dǎo)ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的表達(dá)并調(diào)節(jié)心肌收縮蛋白。ACE2基因被沉默后，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸在上游被阻斷，軸上各mRNA及蛋白表達(dá)水平降低;Que加入后，其提高ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸上各mRNA及蛋白表達(dá)的能力降低，多數(shù)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從該信號(hào)軸上游驗(yàn)證了Que可通過(guò)此軸調(diào)節(jié)心肌收縮蛋白。A779競(jìng)爭(zhēng)性地與Mas受體結(jié)合從而阻斷ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸下游，軸上各mRNA及蛋白表達(dá)降低;Que加入后，其提高ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸上各mRNA及蛋白的表達(dá)能力降低，多數(shù)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從軸下游驗(yàn)證了Que可通過(guò)該信號(hào)軸調(diào)節(jié)心肌收縮蛋白。本研究在沉默ACE2基因及Mas受體阻斷后加入Que，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸上各mRNA及蛋白表達(dá)仍有所增加。分析原因，一是由于細(xì)胞未全部轉(zhuǎn)染成功僅為部分阻斷;二是Que可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮作用，但此推測(cè)仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究通過(guò)阻斷ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的不同部位，驗(yàn)證了Que能夠改善ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸上各mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控心肌收縮蛋白。但本研究仍存在一定局限性：（1）由于樣本量較小，標(biāo)準(zhǔn)差較大，導(dǎo)致具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的結(jié)果較少;（2）本研究為離體實(shí)驗(yàn)，重在研究Que通過(guò)ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸調(diào)控心肌收縮蛋白，未檢測(cè)與心肌收縮力相關(guān)的Ca2+濃度;（3）基因沉默及藥物阻斷僅為部分阻斷，導(dǎo)致結(jié)果有所偏差。以上問(wèn)題仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究完善。

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（收稿日期：2021-05-15 修回日期：2021-11-08）

（編輯：舒安琴）