蒙藥額力根-7對(duì)肝纖維化的改善作用及機(jī)制研究

顏羽昕 張春艷 高曉陽 馬月宏

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）23-2832-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.04

摘 要 目的：研究蒙藥額力根-7對(duì)肝纖維化的改善作用及機(jī)制。方法：以大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為模型組（空白血清）和額力根-7含藥血清低、中、高劑量組（10%、15%、20%額力根-7含藥血清）。各組細(xì)胞均先加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β溶液（0.2 mg/mL）培養(yǎng)48 h以復(fù)制肝纖維化模型，然后再加入相應(yīng)空白或含藥血清。檢測(cè)各組細(xì)胞的光密度（OD）值并計(jì)算增殖抑制率（加血清后培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)）;檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率、周期分布和細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）以及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路相關(guān)因子[PI3K、Akt、磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）]的mRNA和蛋白表達(dá)水平（加血清后培養(yǎng)24 h時(shí)）。進(jìn)一步以Wistar大鼠為研究對(duì)象，將大鼠分為空白組、模型組和額力根-7低、中、高劑量組（135、270、405 mg/kg），每組10只?？瞻捉M和模型組大鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10周。末次灌胃后，觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)肝組織中CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt、PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，各劑量給藥組細(xì)胞的OD值（培養(yǎng)72 h時(shí)的中、高劑量組除外）、S期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.01），晚期凋亡率、早期凋亡率（低劑量除外）、總凋亡率和G2/M期細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.01）;細(xì)胞和大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：額力根-7具有抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路活性、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 肝纖維化;額力根-7;PI3K/Akt信號(hào)通路;細(xì)胞凋亡;肝星狀細(xì)胞;大鼠

Study on Improvement Effects of Mongolian Medicine Eligen-7 on Hepatic Fibrosis and Its Mechanism

YAN Yuxin，ZHANG Chunyan，GAO Xiaoyang，MA Yuehong（School of Basic Medicine， Inner Mongolian Medical University， Hohhot 010000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of Mongolian medicine eligen-7 on hepatic fibrosis （HF） and its mechanism. METHODS： Taking rat hepatic stellate cells HSC-T6 as research object， the cells were divided into model group （blank serum） and low-dose， medium-dose and high-dose groups of eligen-7 containing serum （10%， 15% and 20% eligen-7 containing serum）. Transforming growth factor β solution （0.2 mg/mL） was added into the cells for 48 h to induce liver fibrosis model， and then added into the corresponding blank or drug-contained serum. The optical density （OD） of cells in each group was measured and inhibition rate of cell proliferation was calculated （after treated for 24， 48 and 72 h）. The apoptotic rate and cycle distribution of cells were detected; mRNA and protein expression of type Ⅰ collagen （Collagen Ⅰ）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， phosphatidylinositol-3-kinase and protein-serine-threonine kinase （PI3K/Akt） signaling pathway related factors （PI3K， Akt， PTEN） were also detected （after treated for 24 h）. Wistar rats were further divided into blank group， model group and low-dose， medium-dose and high-dose groups of eligen-7 （135， 270， 405 mg/kg）， with 10 rats in each group. Blank group and model group were given 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution intragastrically; other groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 10 weeks. After last intragastric administration， the pathomorphological changes of liver tissue were observed; mRNA and protein expression of Collagen Ⅰ， α-SMA， PI3K， Akt and PTEN were detected in liver tissue. RESULTS： Compared with model group， OD value （except for medium-dose and high-dose groups of eligen-7 containing serum） and the proportion of cells at S phase in administration groups were decreased significantly （P<0.01）; late apoptotic rate， early apoptotic rate （except for low-dose group）， total apoptotic rate and the proportion of cells at G2/M phase increased significantly （P<0.01）; mRNA and protein expression of Collagen Ⅰ， α-SMA， PI3K and Akt in cells and liver tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， those of PTEN were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Eligen-7 shows the effect of anti-hepatic fibrosis， the mechanism of which may be related to regulating the activity of PI3K/Akt signaling pathway and promoting the apoptosis of hepatic stellate cells.

KEYWORDS? ?Hepatic fibrosis; Eligen-7; PI3K/Akt signaling pathway; Cell apoptosis; Hepatic stellate cells; Rat

肝纖維化是慢性肝損傷進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的異常沉積，對(duì)肝臟功能具有重要影響[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，藥物可通過作用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/Smad、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等信號(hào)通路來降低肝組織中ECM的異常沉積，從而發(fā)揮治療肝纖維化的目的[2]。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝臟中關(guān)鍵的纖維化效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)其活化后，可在肝臟內(nèi)產(chǎn)生過多的ECM，從而導(dǎo)致肝纖維化[3-4]。

蒙藥傳統(tǒng)方劑額力根-7由藍(lán)盆花、紅花、人工牛黃、石膏、香青蘭、瞿麥、五靈脂等7味藥材組成，具有清肝熱的作用，臨床可用于治療黃疸、肝區(qū)疼痛、肝纖維化等[5]。但額力根-7僅有臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，并無具體藥理機(jī)制研究，從而使其推廣受限。

α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）在HSC處于不活化的靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)不表達(dá)或低表達(dá)[6];Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）是ECM的主要組成部分之一，在HSC活化時(shí)其表達(dá)逐漸增強(qiáng)[7]。因此，通過測(cè)定二者含量能夠反映出肝纖維化的病理情況。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可促使HSC活化，從而影響ECM的產(chǎn)生和降解，并和眾多致纖維化因子發(fā)生關(guān)聯(lián)[8]。磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）是PI3K活化的主要負(fù)調(diào)控因子，能抑制PI3K通路下游蛋白的激活，如Akt和蛋白激酶C（PKC）[9]。但額力根-7是否能通過PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮治療肝纖維化的作用，尚不明確。

基于此，本研究擬采用大鼠HSC-T6細(xì)胞為對(duì)象[10]，從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面研究額力根-7的抗肝纖維化作用;再結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討額力根-7抗肝纖維化的作用及機(jī)制，以期為該方劑抗肝纖維化的機(jī)制闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有JP-1000B-8W型藥物粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司），CT15RE型高速離心機(jī)（日本Hitachi公司），DYY-6C型電泳槽、DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），7500 Fast型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），SM2010R型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用藍(lán)盆花（批號(hào)171219）、紅花（批號(hào)171103）、瞿麥（批號(hào)170910）、香青蘭（批號(hào)171109）、五靈脂（批號(hào)171215）、人工牛黃（批號(hào)171030）、石膏（批號(hào)171217）等藥材均購(gòu)自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)有限責(zé)任公司，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制實(shí)驗(yàn)中心呼日樂巴根副教授鑒定為真品。重組人TGF-β（美國(guó)? ? ?Peprotech公司，批號(hào)0918AF35451419）;胰酶（美國(guó)Proemga公司，批號(hào)121652）;FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)分別為U8305、S8129）;兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體、兔抗大鼠CollagenⅠ多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為00075696、00075847、00066288）;兔抗大鼠PI3K多克隆抗體、兔抗大鼠Akt多克隆抗體、兔抗大鼠PTEN多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為bs-10657R、bs-6951R、bs-0748R）;Dylight 800標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國(guó)Abbkine公司，批號(hào)ATSMR2201）;Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為092120201021、081820200917）;MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20210727）;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成（PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，鼠齡8周，體質(zhì)量為190～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016- 0006，動(dòng)物使用許可證為SYXK（蒙）2015-0001。大鼠均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔區(qū)，室溫為18～22 ℃。

1.4 細(xì)胞

大鼠HSC-T6細(xì)胞購(gòu)自北京北納科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究

2.1.1 額力根-7含藥血清的制備 除人工牛黃外，將額力根-7處方中其余藥材均粉碎，過100目篩，然后取紅花180 g、香青蘭60 g、藍(lán)盆花60 g、瞿麥60 g、石膏180 g、五靈脂60 g（均為藥材粉末）和人工牛黃80 g混合均勻后得到額力根-7（臨用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解）。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組（1.35 g/kg額力根-7，劑量為臨床等效劑量的10倍），每組8只。對(duì)照組大鼠灌胃等量羧甲基纖維素鈉溶液，給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)8 d。第8天時(shí)，給藥組大鼠于腹主動(dòng)脈取血適量，血樣靜置20 min后，以3 000 r/min離心15 min;取上清液，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得含藥血清[6-7]。對(duì)照組同法操作，制備空白血清。

2.1.2 細(xì)胞分組、造模與給藥 將HSC-T6細(xì)胞復(fù)蘇種板后置于37 ℃、5% CO2的條件下（以下培養(yǎng)條件相同）培養(yǎng)12 h，然后調(diào)整細(xì)胞密度為6×107 mL-1，分為模型組和額力根-7含藥血清低、中、高劑量組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞先加入0.2 mg/mL TGF-β溶液10 μL，培養(yǎng)48 h以復(fù)制肝纖維化模型[10];然后棄培養(yǎng)基，模型組加入10%空白血清，額力根-7含藥血清各劑量組分別加入10%、15%、20%含藥血清（劑量根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）。

2.1.3 細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè) 采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107 mL-1，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥（同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照組），分別培養(yǎng)24、48、72 h后，按MTT試劑盒說明書方法測(cè)定各孔吸光度（OD）值，并計(jì)算HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率[增殖抑制率=（模型組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/（模型組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）×100%]。

2.1.4 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。取HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107 mL-1，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，按Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒說明書方法操作后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

2.1.5 細(xì)胞周期的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。取HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107 mL-1，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，按細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書方法操作后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布。

2.1.6 細(xì)胞中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 采用q-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107 mL-1，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，然后根據(jù)試劑盒說明書相關(guān)方法，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物各0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.4? ? ? μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt、PTEN mRNA的表達(dá)水平。

2.1.7 細(xì)胞中CollagenⅠ、α-SMA蛋白和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107 mL-1，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2～3次，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，并置于冰上充分裂解20 min后于4 ℃條件下以13 000 r/min離心15 min;取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)煮沸變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）;轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h;加入GAPDH（稀釋度為1 ∶ 20 000）、α-SMA（稀釋度為1 ∶ 2 500）、CollagenⅠ（稀釋度為1 ∶ 1 000）、PI3K（稀釋度為1 ∶ 1 000）、Akt（稀釋度為1 ∶ 1 000）、PTEN（稀釋度為1 ∶ 1 000）一抗，于4 ℃孵育過夜;以TBST清洗10 min×3次，加入熒光標(biāo)記二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000）常溫孵育1 h;以TBST清洗10 min×3次，采用近紅外激光成像系統(tǒng)成像。采用Image Studio軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

2.2.1 造模、分組與給藥 將Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和額力根-7低、中、高劑量組（135、270、405 mg/kg，劑量分別為臨床等效劑量的1、2、3倍），每組10只。除空白組外，其余4組大鼠參考文獻(xiàn)[11-12]灌胃CCl4（2 mL/kg）以復(fù)制肝纖維化模型，每周2次，連續(xù)10周。造模的同時(shí)，空白組和模型組大鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10周。

2.2.2 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的觀察 末次灌胃結(jié)束后，處死各組大鼠，取其肝組織，一部分置于4%甲醛溶液中固定，一部分于-80 ℃下保存，備用。將固定48 h的肝組織進(jìn)行乙醇梯度脫水，再以二甲苯透明替換、浸蠟、包埋、切片（厚度約5 μm）后，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化。

2.2.3 大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取“2.2.2”項(xiàng)下凍存的各組大鼠肝組織，同“2.1.6”項(xiàng)下“采用TRIzol法提取總RNA……PTEN mRNA的表達(dá)水平”操作，檢測(cè)肝組織中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA的表達(dá)水平。

2.2.4 大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA蛋白和PI3K/ Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 取“2.2.2”項(xiàng)下凍存的各組大鼠肝組織，同“2.1.7”項(xiàng)下“以PBS洗滌2～3次……表示目的蛋白的表達(dá)水平”操作，檢測(cè)肝組織中CollagenⅠ、α-SMA蛋白和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 額力根-7含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響 與模型組比較，給藥培養(yǎng)24 h后，額力根-7含藥血清各劑量組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.01），增殖抑制率分別為49.42%、33.96%和59.56%;培養(yǎng)48 h后，額力根-7含藥血清各劑量組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.01），增殖抑制率分別為26.29%、22.45%、35.21%;培養(yǎng)72 h后，額力根-7含藥血清低劑量組細(xì)胞的OD值顯著降低（P<0.05），增殖抑制率為18.12%。結(jié)果見表2。

3.1.2 額力根-7含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響 與模型組比較，額力根-7含藥血清各劑量組細(xì)胞的晚期凋亡率、早期凋亡率（低劑量組除外）以及總凋亡率均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表3、圖1。

3.1.3 額力根-7含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞周期的影響 與模型組比較，額力根-7含藥血清各劑量組的S期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.01），G2/M期細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

3.1.4 額力根-7含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 與模型組比較，額力根-7含藥血清各劑量組細(xì)胞中Collagen Ⅰ、α-SMA、PI3K、Akt的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），PTEN mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表5。

3.1.5 額力根-7含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞中CollagenⅠ、α-SMA蛋白和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，額力根-7含藥血清各劑量組細(xì)胞中CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），PTEN蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表6、圖3。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 額力根-7對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色和Masson染色結(jié)果均顯示，空白組大鼠肝小葉完整，肝細(xì)胞排列整齊且未見纖維組織增生;模型組大鼠肝細(xì)胞排列不規(guī)則，肝索紊亂，可見大量膠原纖維同時(shí)伴有假小葉形成;額力根-7各劑量組大鼠纖維化程度均較模型組減輕，肝索排列趨于正常，肝小葉清晰。結(jié)果見圖4。

3.2.2 額力根-7對(duì)大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），PTEN mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，額力根-7各劑量組大鼠肝組織中上述指標(biāo)水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.01）。結(jié)果見表7。

3.2.3 額力根-7對(duì)大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA蛋白和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），PTEN蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，額力根-7各劑量組大鼠肝組織中上述指標(biāo)水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見表8、圖5。

4 討論

肝纖維化是由一種或多種物理、化學(xué)或微生物因子引起的常見慢性疾病，其特征是成纖維細(xì)胞的異常積累和ECM的過度沉積，并伴有明顯的炎性病變和結(jié)構(gòu)改變[13-14]。HSC是在肝損傷過程中促進(jìn)纖維化發(fā)生的細(xì)胞，主要位于肝竇空間和Disse空間，可分泌ECM并產(chǎn)生膠原酶，從而參與肝臟中膠原蛋白的合成[15-16]。靜止?fàn)顟B(tài)下的HSC對(duì)肝臟的正常代謝功能至關(guān)重要;但當(dāng)肝臟出現(xiàn)損傷時(shí)，靜止的HSC會(huì)向其活化表型轉(zhuǎn)分化，從而加快肝損傷后的纖維化進(jìn)程[17]。

PI3K/Akt信號(hào)通路是肝纖維化形成過程中的重要信號(hào)通路，其可調(diào)控HSC的活化來干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程[13]。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活是一個(gè)多步驟的過程，包括兩種方式：一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構(gòu)象改變而被激活;另一種是通過Ras蛋白和p110蛋白直接結(jié)合從而被激活[13]。PI3K/Akt信號(hào)源于膜受體酪氨酸激酶（RTK）的激活，當(dāng)細(xì)胞外的配體與膜受體RTK結(jié)合后，RTK被激活而發(fā)生同源或異源寡聚化或者自身磷酸化，從而為p85蛋白亞單位的SH2結(jié)構(gòu)域提供錨定位點(diǎn)，進(jìn)而激活p85蛋白[18-19]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，解除p85蛋白對(duì)p110蛋白亞單位的抑制作用，可活化p110蛋白，進(jìn)而催化膜表面的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）[20];然后，PIP3作為第二信使與Akt的普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，從而定位于磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和磷酸肌醇依賴性激酶2（PDK2）附近[21]。當(dāng)Akt的構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，將暴露其磷酸化位點(diǎn)，使PDK1磷酸化Akt的Thr308結(jié)構(gòu)域，PDK2磷酸化Akt的Ser473結(jié)構(gòu)域[22];然后磷酸化的Akt脫離細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，從而引起信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡[23]。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能夠促使HSC活化和凋亡來干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程，影響ECM的產(chǎn)生和降解，并和眾多致纖維化因子發(fā)生關(guān)聯(lián)，從而起到促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。PTEN是細(xì)胞生長(zhǎng)和存活信號(hào)傳導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物[24]，可通過去磷酸化作用將PIP3轉(zhuǎn)換成PIP2，從而導(dǎo)致PIP3和依賴于PIP3的信號(hào)均減少[25]。因此，PTEN能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)的PIP3水平，抑制PI3K信號(hào)通路下游蛋白Akt的激活，從而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，進(jìn)而阻止肝纖維化的持續(xù)發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量額力根-7含藥血清干預(yù)后，HSC-T6細(xì)胞的晚期凋亡率、早期凋亡率（低劑量組除外）、總凋亡率以及G2/M期的細(xì)胞比例均顯著升高，OD值（培養(yǎng)72 h時(shí)的中、高劑量組除外）和S期細(xì)胞比例均顯著降低，表明額力根-7含藥血清能通過阻滯細(xì)胞于G2/M期，來抑制細(xì)胞的增殖。q-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)額力根-7含藥血清干預(yù)后，HSC-T6細(xì)胞中CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。為了證明額力根-7對(duì)肝纖維化有明確的改善作用，筆者又基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究不同劑量額力根-7的抗肝纖維化作用。結(jié)果顯示，經(jīng)額力根-7干預(yù)后，大鼠肝纖維化程度減輕，肝索排列趨于正常，肝小葉清晰;大鼠肝組織中 CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化情況與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。這表明額力根-7抗肝纖維化的作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路活性有關(guān)。

綜上所述，額力根-7具有抗肝纖維化的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路活性、促進(jìn)HSC凋亡有關(guān)。

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（收稿日期：2021-06-20 修回日期：2021-09-09）

（編輯：唐曉蓮）