基于標(biāo)記法的福白菊精油抗真菌機(jī)理研究

付 俊，吳美嬋，王書珍，邵秀麗，何 峰，

（1.黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黃岡438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,黃岡438000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,濟(jì)南250355）

真菌感染給人類健康帶來重大危害，科學(xué)家們一直致力于尋找安全、高效的抗真菌藥物［1~3］.其中精油由于其廣譜抗真菌活性引起了研究人員的極大關(guān)注.例如，He等［4］發(fā)現(xiàn)來源于阿舒假囊酵母的精油具有廣譜抗真菌活性；Hu等［5］研究了紫蘇精油抗黃曲霉的作用機(jī)制；Diao等［6］通過測(cè)定茴香籽精油處理后酵母細(xì)胞內(nèi)容物的外泄研究了茴香籽精油對(duì)酵母細(xì)胞膜破壞作用；Tang等［7］發(fā)現(xiàn)用精油的主要組分香葉醇和檸檬醛處理黃曲霉后，黃曲霉細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致其細(xì)胞膜被破壞.這些研究啟發(fā)人們將來源豐富的精油作為天然的抗真菌候選藥物.

菊花中含有多種生物活性物質(zhì)，因此受到了研究人員的廣泛關(guān)注［8］.Yang等［9］發(fā)現(xiàn)菊花中的木犀草素可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；He等［10］發(fā)現(xiàn)菊花總黃酮可保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激作用；Wu等［11］從菊花中提取的多酚化合物顯示出有效的自由基清除活性；Han等［12］研究了5個(gè)菊花品種中的11常見種化合物，結(jié)果表明這些化合物具有潛在的抗炎作用；Zhang等［13］發(fā)現(xiàn)菊花對(duì)SARS的治療和預(yù)防具有抗補(bǔ)體活性.但目前利用菊花精油進(jìn)行抗真菌研究的報(bào)道還較少，特別是專門利用標(biāo)記法研究精油抗真菌機(jī)理的報(bào)道更少.

福白菊（Chrysanthemum morifoliumcv.Fubaiju）是湖北省麻城市特產(chǎn)菊花品種，是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，2020年7月麻城福白菊入選中歐地理標(biāo)志首批保護(hù)清單.本文采用福白菊作為研究對(duì)象，通過有機(jī)溶劑萃取和水蒸氣蒸餾相結(jié)合制備了福白菊精油.分別采用健那綠、細(xì)胞膜熒光探針1，1'-雙十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚菁高氯酸鹽（DiI）、碘化丙啶（PI）、羅丹明123和溴化乙錠（EB）等染料標(biāo)記酵母細(xì)胞、酵母細(xì)胞膜、核酸線粒體膜以及質(zhì)粒DNA，研究了福白菊精油的抗真菌機(jī)理，以便為將植物精油開發(fā)成為天然抗真菌藥物提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

福白菊（Chrysanthemum morifoliumcv.Fubaiju）采收于湖北省鳳凰山藥業(yè)有限公司福白菊種植基地，標(biāo)本保藏于黃岡師范學(xué)院標(biāo)本館（保藏編號(hào)為HGNU202000366）；抗真菌實(shí)驗(yàn)所用的指示菌為釀酒酵母（Saccharomyce scerevisiaeATCC 9080，S.cerevisiae），購(gòu)于上海魯微科技有限公司；染料健那綠（純度≥98%）、細(xì)胞膜紅色熒光探針DiI（純度≥98%）、碘化丙啶（純度98%）和溴化乙錠（純度≥95%）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光染料羅丹明123（純度≥95%）購(gòu)于福州飛凈生物科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司.

CX 41型熒光顯微鏡和CX41型高清顯微鏡，日本Olympus公司；A1 MP STORM型多光子-共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 福白菊精油的制備

采集含苞待放的菊花花蕾進(jìn)行冷凍干燥，再用粉碎機(jī)將干燥后的花蕾粉碎.以正己烷為溶劑，將菊花花蕾與正己烷按質(zhì)量比1∶4進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間3 h，期間適當(dāng)振蕩.抽濾得到萃取液，原料部分再利用正己烷進(jìn)行第二次和第三次萃取，合并所有萃取液進(jìn)行減壓蒸餾，濃縮后得到粗制毛油.利用水蒸汽對(duì)粗制毛油進(jìn)行蒸餾，得到油-水混合物.將油-水混合物在低溫條件下離心后，收集油層，然后用無水亞硫酸鈉進(jìn)行脫水，得到福白菊精油，置于棕色瓶中于4℃下避光保存.

1.3 抗真菌機(jī)理研究

釀酒酵母具有真核細(xì)胞生命活動(dòng)最基本的特征，常作為研究真核生物的模式生物.本文選用釀酒酵母為對(duì)象，使用健那綠、DiI、PI、羅丹明123和EB等染料來研究福白菊精油對(duì)釀酒酵母的抗真菌機(jī)理.

將指示菌釀酒酵母接種于滅菌的液體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)10 h，離心收集培養(yǎng)的指示菌液，用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液，pH=7.2）洗滌3次并制備成懸浮液，最終獲得細(xì)胞密度為106CFU/mL的酵母菌懸液.

取3份1 mL酵母菌懸液于Eppendorf管中，分別加入0，10和20 μL福白菊精油，于30℃黑暗條件下孵育1 h.各管中均加入10 μL健那綠染料，于30℃黑暗條件下孵育過夜.培養(yǎng)后，洗去染料和精油，將10 μL酵母菌懸液均勻涂覆于載玻片上，采用高清顯微鏡觀察樣品中釀酒酵母細(xì)胞的顏色變化來確定福白菊精油對(duì)酵母是否具有殺滅作用［14］.

利用DiI直接標(biāo)記酵母細(xì)胞膜，研究福白菊精油對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用.取3份1 mL酵母菌液于Eppendorf管中，分別加入10 μL DiI染料，于30℃黑暗條件下孵育過夜.分別加入0，10和20 μL福白菊精油，于30℃黑暗條件下孵育1 h.洗去染料和精油，將10 μL酵母菌懸液均勻涂覆于載玻片上，利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察釀酒酵母溶液熒光強(qiáng)度變化，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為549和565 nm［15］.

利用PI標(biāo)記酵母細(xì)胞膜被破壞后泄露的核酸，參照文獻(xiàn)［16］方法進(jìn)一步研究福白菊精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用.利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察時(shí)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535和615 nm［16］.

參照文獻(xiàn)［17］方法，利用羅丹明123標(biāo)記研究福白菊精油對(duì)酵母線粒體膜的作用，利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察時(shí)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488和528 nm［17］.

向4個(gè)Eppendorf管中分別加入5 μL質(zhì)粒（PCAMBIA1303）和15 μL TE緩沖液［20 mmol/L Tris和2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH=8.0）］，然后向每個(gè)管中加入2 μL福白菊精油和1 μL EB溶液，混合均勻后于28℃下孵育3 h.將每個(gè)管中的樣品點(diǎn)樣在1.2%瓊脂糖凝膠上，電泳30 min（28℃，10 V），觀察各泳道中不同條帶的位置，以確定精油對(duì)質(zhì)粒DNA的破壞作用［18］.以DNA marker、未處理的環(huán)形質(zhì)粒樣品和環(huán)形質(zhì)粒用內(nèi)切酶（Bam HI，0.1 mg/mL）處理后的樣品分別作為對(duì)照.

2 結(jié)果與討論

2.1 精油的制備

以福白菊為原料提取出的淡黃色福白菊精油具有濃郁的、獨(dú)特的菊花香味，產(chǎn)率為（0.64±0.2）%，高于神龍架產(chǎn)的野菊花精油（產(chǎn)率0.43%）［19］，也高于西班牙產(chǎn)的菊花精油（產(chǎn)率0.1%）［20］.

2.2 抗真菌機(jī)理

2.2.1 基于健那綠標(biāo)記的福白菊精油對(duì)酵母的殺滅作用利用健那綠標(biāo)記時(shí)精油對(duì)酵母的殺滅作用如圖1所示.健那綠能夠標(biāo)記正常的酵母細(xì)胞［圖1（B）］，隨著對(duì)酵母處理的精油量增加，健那綠標(biāo)記顏色變淺［圖1（C）］，甚至完全消失［圖1（D）］，與未標(biāo)記的酵母之間沒有明顯差異［圖1（A）］.健那綠是專一性的活細(xì)胞線粒體染料，與線粒體中有活性的細(xì)胞色素C氧化酶（COX）結(jié)合后，可保持氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍(lán)綠色；而死亡細(xì)胞中COX失活，健那綠則被還原，呈現(xiàn)無色.在本文中，隨著處理酵母的精油量增加，健那綠標(biāo)記顏色變淺，甚至完全消失，說明精油對(duì)酵母的殺滅作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［14］.

Fig.1 Effect of Fubaiju essential oil on S.cerevisiae according to Jana green labeling

2.2.2 基于DiI標(biāo)記的福白菊精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用利用DiI標(biāo)記時(shí)精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用如圖2所示，其中圖2（A）~（C）為明視場(chǎng)條件下觀察的酵母細(xì)胞，圖2（D）~（F）為熒光條件下觀察的酵母細(xì)胞，圖2（A）和（D），（B）和（E），（C）和（F）中酵母位置分別一一對(duì)應(yīng).DiI是一種親脂性的細(xì)胞膜探針，與細(xì)胞膜的親和力高，進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱.進(jìn)入細(xì)胞后DiI與完整細(xì)胞磷酯雙層膜結(jié)合后，可逐漸擴(kuò)散至整個(gè)細(xì)胞膜，發(fā)出強(qiáng)烈的橙紅色熒光.當(dāng)細(xì)胞膜被破壞后，DiI從磷酯雙層膜上脫落，進(jìn)入水中，熒光變?nèi)?因此，DiI的熒光強(qiáng)弱可反映細(xì)胞膜破壞程度［21］.從圖2可以看出，經(jīng)DiI標(biāo)記但未經(jīng)福白菊精油處理的正常酵母細(xì)胞幾乎每個(gè)細(xì)胞都散發(fā)出熒光［圖2（D）］，表明DiI能正常標(biāo)記細(xì)胞膜完整的酵母.利用10 μL/mL福白菊精油處理經(jīng)DiI標(biāo)記的酵母細(xì)胞后，部分細(xì)胞的熒光消失［圖2（E）］，表明當(dāng)酵母被精油處理后，一部分細(xì)胞膜被破壞，DiI從細(xì)胞膜上脫落，熒光減弱.利用20 μL/mL福白菊精油處理經(jīng)DiI標(biāo)記的細(xì)胞后，幾乎所有細(xì)胞的熒光消失［圖2（F）］，表明當(dāng)精油作用增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞膜幾乎全部被破壞，DiI從細(xì)胞膜上完全脫落，酵母的熒光幾乎完全消失.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酵母的細(xì)胞膜是福白菊精油抗菌作用的靶點(diǎn)之一.

Fig.2 Effects of Fubaiju essential oil on cell membrane of S.cerevisiae according to DiI labeling

2.2.3 基于PI標(biāo)記法的福白菊精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用利用PI標(biāo)記時(shí)精油對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜的破壞作用如圖3所示，其中圖3（A）~（C）為明視場(chǎng)條件下觀察的酵母細(xì)胞，圖3（D）~（F）為熒光條件下觀察的酵母細(xì)胞，圖3（A）和（D），（B）和（E），（C）和（F）中酵母位置分別一一對(duì)應(yīng).PI是一種紅色熒光染料，常用于核酸標(biāo)記.PI不能通過完整的細(xì)胞膜，但能穿過破損的細(xì)胞膜并與核酸結(jié)合后發(fā)出熒光，可利用PI的熒光強(qiáng)弱判斷細(xì)胞膜被破壞后核酸泄露的程度［22］.從圖3可以看出，未經(jīng)精油處理的酵母細(xì)胞無熒光［圖3（D）］，說明細(xì)胞完整，PI未能穿過細(xì)胞膜與核酸結(jié)合.當(dāng)酵母被10 μL/mL精油處理后，發(fā)出少量熒光［圖3（E）］，說明部分細(xì)胞的細(xì)胞膜被精油破壞，PI與細(xì)胞中泄露的核酸結(jié)合，發(fā)出熒光.當(dāng)精油濃度增加到20 μL/mL時(shí)，幾乎每個(gè)細(xì)胞都發(fā)出熒光［圖3（F）］，說明此時(shí)幾乎所有酵母的細(xì)胞膜都被破壞，PI與細(xì)胞中泄露的核酸結(jié)合，精油對(duì)酵母細(xì)胞膜的破壞作用隨著福白菊精油濃度增加而加強(qiáng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明酵母的細(xì)胞膜是福白菊精油抗真菌作用的靶點(diǎn)之一.

Fig.3 Effects of Fubaiju essential oil on cell membrane of S.cerevisiae according to PI labeling

2.2.4基于羅丹明123標(biāo)記的福白菊精油對(duì)酵母線粒體膜的破壞作用精油對(duì)釀酒酵母線粒體膜的破壞作用如圖4所示，其中圖4（A）~（C）為明視場(chǎng)條件下觀察的酵母細(xì)胞，圖4（D）~（F）為熒光條件下觀察的酵母細(xì)胞，圖4（A）和（D），（B）和（E），（C）和（F）中酵母位置分別一一對(duì)應(yīng).羅丹明123是一種檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，進(jìn)入正常細(xì)胞線粒體基質(zhì)后熒光強(qiáng)度降低或消失，但線粒體膜被破壞后，羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放，發(fā)出黃綠色熒光［18］.從圖4可以看出，經(jīng)羅丹明123標(biāo)記但未經(jīng)福白菊精油處理的正常酵母細(xì)胞無熒光，說明羅丹明123進(jìn)入細(xì)胞的線粒體基質(zhì)后熒光消失［圖4（D）］.當(dāng)酵母被10 μL/mL精油處理后，發(fā)射出較弱的黃綠色熒光［圖4（E）］，說明部分細(xì)胞的線粒體膜被破壞，羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放.當(dāng)精油濃度增加到20 μL/mL時(shí)，發(fā)射出強(qiáng)的黃綠色熒光［圖4（F）］，說明幾乎所有酵母的線粒體膜均被破壞，羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放出來.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酵母的線粒體是福白菊精油抗真菌作用的靶點(diǎn)之一.Guimar?es等［23］和Xu等［24］認(rèn)為精油中親脂性萜類和萜烯類化合物快速插入細(xì)胞膜、線粒體膜的膜系統(tǒng)后，由于其疏水性引起膜滲透性增加，破壞膜結(jié)構(gòu)，使膜內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致菌體死亡.福白菊精油中含有大量的萜類和萜烯類化合物，這可能是其破壞真菌細(xì)胞膜、線粒體的原因.

Fig.4 Effect of Fubaiju essential oil on mitochondrial membrane of S.cerevisiae according to rhodamine 123 labeling

Fig.5 DNA destruction assay by Fubaiju essential oil according to EB labeling

2.2.5 基于EB標(biāo)記法的福白菊精油對(duì)酵母DNA的破壞利用EB標(biāo)記時(shí)，福白菊精油對(duì)酵母DNA的破壞作用如圖5所示.泳道1和泳道2分別表示DNA marker和環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303，泳道3是環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303被Bam-HI內(nèi)切酶酶切后的線形質(zhì)粒，泳道4~7為環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303被福白菊精油處理過的電泳結(jié)果，泳道4~7是平行樣.經(jīng)福白菊精油處理后，環(huán)形pCAMBIA1303形成大小不一的片段.有的片段在泳道中移動(dòng)得快，說明環(huán)形pCAMBIA130可能被精油破壞成線性片段；有的片段在泳道中移動(dòng)得慢，說明環(huán)形pCAMBIA130可能被精油改變了結(jié)構(gòu)，使其在電泳作用下移動(dòng)得慢.這些結(jié)果表明，DNA可能是福白菊精油作用靶點(diǎn)之一.Chung等［16］發(fā)現(xiàn)韓茵陳（Artemisia iwayomogi）精油的主要成分Vulgarone B與PBR322質(zhì)粒結(jié)合后會(huì)改變其結(jié)構(gòu)，使其比原PBR322質(zhì)粒更大，電泳作用下移動(dòng)得慢.福白菊精油中含有類似于Vulgarone B的物質(zhì)［25］，但精油與DNA分子之間如何相互作用還有待于進(jìn)一步研究.

3 結(jié) 論

福白菊精油的抗真菌機(jī)理是通過多途徑、多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的.它不僅能破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)含物外泄；還能夠穿過細(xì)胞膜后破壞線粒體膜，破壞DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.不同于抗生素的抗菌作用位點(diǎn)單一而容易產(chǎn)生耐藥性，福白菊精油的多重作用機(jī)制可能使真菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，這為植物精油作為天然抗真菌藥物的開發(fā)提供了新的思路.