基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的小麥旗葉表皮蠟質(zhì)差異表達(dá)基因分析

溫宏偉，黨一飛，董凡凡，陳 楠，張明義，武棒棒，逯臘虎，楊 斌

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，山西臨汾 041000；2.臨汾市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，山西臨汾 041000）

小麥作為我國(guó)主要的糧食作物之一，保障其產(chǎn)量穩(wěn)定和提高其抗逆性具有重要意義。表皮蠟質(zhì)是植物與外界環(huán)境接觸的第1 道物理屏障，不僅可以限制植物的非氣孔水分散失、提高植物抗旱能力，而且還能幫助植物減輕機(jī)械損傷、病蟲害入侵，保護(hù)植物免受高溫和強(qiáng)紫外線輻射的危害[1-2]，在抵御生物脅迫與非生物脅迫方面發(fā)揮著重要的作用[3-5]。因此，研究小麥葉片表皮蠟質(zhì)調(diào)控基因及機(jī)制，對(duì)于逆境條件下保障小麥產(chǎn)量形成具有重要意義[6]。

蠟質(zhì)的合成及調(diào)控機(jī)理研究雖始于20 世紀(jì)中葉，但小麥表皮蠟質(zhì)由于其組分與合成過程的復(fù)雜性，大多數(shù)還停留在蠟質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)的研究上[7]。目前，蠟質(zhì)分子調(diào)控方面的研究多以模式作物擬南芥為研究對(duì)象，在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)了許多參與蠟質(zhì)合成和調(diào)控的基因[8-9]，如擬南芥中CER1 的過表達(dá)導(dǎo)致烷烴大量積累[10]，CER4（AtFAR3）的過表達(dá)誘導(dǎo)伯醇的產(chǎn)生[11]。ZHOU 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsWR2 通過上調(diào)穗部超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成基因CER6/CUT1、FDH2、FAE 和LACS1 的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)蠟質(zhì)的合成與積累。而有關(guān)小麥表皮蠟質(zhì)分子調(diào)控機(jī)制的研究較少，CHAI 等[13]從小麥中克隆出了參與伯醇合成的幾個(gè)編碼脂肪?；o酶A 還原酶的基因TaFARs，劉曉宇等[14]對(duì)TaFAR10 進(jìn)行了克隆和功能驗(yàn)證，LI 等[15]通過研究小麥蠟質(zhì)缺失突變體w5 發(fā)現(xiàn)，β-二酮的生物合成阻斷，進(jìn)而抑制蠟質(zhì)合成。由于小麥基因組復(fù)雜，同源序列多，且小麥表皮蠟質(zhì)生物合成過程復(fù)雜，使得蠟質(zhì)相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制的研究受到很大限制?，F(xiàn)雖有相關(guān)學(xué)者對(duì)小麥表皮蠟質(zhì)分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了部分研究，但仍有許多調(diào)控機(jī)制未能明確，且現(xiàn)有研究多以不同遺傳背景下的蠟質(zhì)材料為研究對(duì)象，無法排除遺傳差異造成的影響。

本試驗(yàn)以蠟質(zhì)含量差異較大的濟(jì)麥22 無蠟突變體和多蠟突變體為研究材料，通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2 種突變體的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以挖掘表皮蠟質(zhì)差異表達(dá)基因，揭示小麥表皮蠟質(zhì)合成及分子調(diào)控的可能機(jī)制，為深入研究小麥表皮蠟質(zhì)代謝的遺傳與分子機(jī)制提供有價(jià)值的參考信息。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

使用0.6%的EMS 溶液誘變濟(jì)麥22[16]，從高代誘變材料中篩選出無蠟突變體（NW）和多蠟突變體（MW）。2020 年10 月，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所韓村試驗(yàn)基地（36°N，111°E），每個(gè)材料3 次重復(fù)，雙行區(qū)種植，行距0.3 m，行長(zhǎng)2 m，每行30 粒播種，常規(guī)管理。于抽穗期分別取NW 和MW 旗葉，錫箔紙包裹液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 總RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

NW 和MW 旗葉分別來自各3 個(gè)重復(fù)中的混樣，各自分成2 份用于RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用Trizol 法提取總RNA，使用NanoDrop2000（美國(guó)）測(cè)定RNA 濃度和純度，使用安捷倫生物分析儀2100 系統(tǒng)（美國(guó)）的RNA Nano 6000 分析試劑盒評(píng)估RNA 完整性，提取純度和完整性符合要求的RNA 樣本。將提取樣本送往北京百邁客公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 mRNA 差異表達(dá)分析

通過去除含有接頭的reads 和低質(zhì)量的reads，對(duì)Illumina 測(cè)序平臺(tái)上完成測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，以獲得高質(zhì)量的reads。利用HISAT2軟件對(duì)小麥參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，采用StringTie 對(duì)HISAT2 的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行拼接，通過ASprofile 軟件獲取每個(gè)樣品存在的可變剪接類型及相應(yīng)表達(dá)量（FPKM值）。利用DESeq2 進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，以Fold change≥2 且假發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR 即P-value）＜0.01 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)來確定無蠟突變體和多蠟突變體之間的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），并在百邁客云平臺(tái)（www.biocloud.net）以某一個(gè)基因在2 個(gè)樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、以基因表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的負(fù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制DEGs 火山圖。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行蠟質(zhì)功能注釋和通路顯著性富集分析，借助百邁客云平臺(tái)（www.biocloud.net）對(duì)蠟質(zhì)通路中的相關(guān)調(diào)控基因進(jìn)行篩選和查詢。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 個(gè)突變體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，共獲得40.63 Gb 的Clean Data，各樣品的Clean Data 均達(dá)到9.63 Gb，Q30 堿基百分比在94.22%以上。分別將各樣品的Clean reads 與指定的小麥參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)效率為91.79%～93.67%（表1）。結(jié)果表明，RNASeq 得到的數(shù)據(jù)利用率高，所選擇的參考基因組能夠滿足本試驗(yàn)后續(xù)分析的需求。

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制統(tǒng)計(jì)

2.2 差異基因表達(dá)分析

差異基因表達(dá)火山圖（圖1）直觀地顯示了無蠟突變體和多蠟突變體中差異表達(dá)基因，圖中的每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)基因。結(jié)果顯示，從2 種突變體葉片中共鑒定出6 840 個(gè)差異表達(dá)基因，與多蠟突變體相比，無蠟突變體中3 181 個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)，3 659 個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào)。

2.3 蠟質(zhì)差異基因功能分析

將2 種突變體共篩選到6 840 個(gè)的差異表達(dá)基因，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蠟質(zhì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集通路分析和分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)相關(guān)基因注釋到新陳代謝和細(xì)胞過程2 類，涉及脂肪酸降解、過氧化物酶體生理活動(dòng)及角質(zhì)、亞角質(zhì)和生物蠟的合成過程，其中，26 個(gè)基因與角質(zhì)、亞角質(zhì)和生物蠟合成有關(guān)（圖2）。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如表2 所示，發(fā)現(xiàn)其中上調(diào)基因9 個(gè)，下調(diào)基因17 個(gè)。

2.4 蠟質(zhì)合成通路調(diào)控基因分析

為了分析篩選到的差異基因?qū)ο炠|(zhì)合成的調(diào)控情況，通過KEGG 蠟質(zhì)注釋通路圖發(fā)現(xiàn)，調(diào)控蠟質(zhì)合成的基因主要包括醛脫碳酶基因（CER1）、中鏈烷烴羥化酶基因（MAH1）、醇合成過程中的脂肪?；o酶A 還原酶基因（FAR）和O-酰基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白基因（WSD1）（圖3、表2）。與多蠟突變體相比，在無蠟突變體葉片中，2 個(gè)CER1 相關(guān)基因表達(dá)均下調(diào)，以抑制醛到烷烴的合成進(jìn)而減少葉片蠟質(zhì)；而2 個(gè)MAH1、7 個(gè)FAR 和4 個(gè)WSD1 相關(guān)基因表達(dá)水平既有上調(diào)也有下調(diào)，通過調(diào)控，烷烴向仲醇的轉(zhuǎn)化、仲醇向酮的轉(zhuǎn)化、長(zhǎng)鏈酰基輔酶A 向伯醇的轉(zhuǎn)化以及長(zhǎng)鏈?；o酶A 和長(zhǎng)鏈伯醇向蠟酯的轉(zhuǎn)化過程來調(diào)控葉片表皮蠟質(zhì)的合成。說明CER1 是影響2 種突變體蠟質(zhì)差異的主要調(diào)控基因，通過抑制烷烴的形成減少葉片表皮蠟質(zhì)含量。

表2 無蠟突變體與多蠟突變體葉片蠟質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因

3 結(jié)論與討論

本研究通過對(duì)濟(jì)麥22 無蠟突變體與多蠟突變體葉片表皮蠟質(zhì)的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，得到6 840 個(gè)差異表達(dá)基因，主要富集在代謝過程中，這可能與蠟質(zhì)相關(guān)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化代謝有關(guān)。因?yàn)橄炠|(zhì)的合成需要多種酶參與并在不同器官進(jìn)行的復(fù)雜過程，也說明了檢測(cè)到的差異表達(dá)基因的準(zhǔn)確性。除了蠟質(zhì)的合成途徑外，還涉及到脂肪酸降解過程。前人研究表明，蠟質(zhì)的生物合成主要包含2 個(gè)步驟：C16、C18 脂肪酸前體的形成和超長(zhǎng)鏈脂肪酸（very long chain fatty acids，VLCFAs）及其衍生物的合成[17]。脂肪酸的降解過程中，差異基因的表達(dá)可能與其轉(zhuǎn)化為蠟質(zhì)組分中的脂肪衍生物的過程有關(guān)，因此也說明了本研究差異表達(dá)基因涉及到的脂肪酸降解途徑具有一定的合理性。

本研究檢測(cè)到26 個(gè)與小麥葉片表皮蠟質(zhì)相關(guān)的差異表達(dá)基因，通過KEGG 注釋通路圖發(fā)現(xiàn)，這些基因主要包括CER1、MAH1、FAR 和WSD1。與多蠟突變體相比，在無蠟突變體葉片中，CER1 相關(guān)基因全部下調(diào)表達(dá)，通過抑制長(zhǎng)鏈醛向長(zhǎng)鏈烷烴的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致葉片蠟質(zhì)減少。BERNARD 等[5]在擬南芥中研究也證實(shí)，CER1 基因主要通過抑制烷烴的生物合成來控制蠟質(zhì)的合成。目前發(fā)現(xiàn)的表皮蠟質(zhì)主要包括伯醇和仲醇、醛、烷烴、酮、酯、三萜類、甾醇和類黃酮[18-19]，因此，推測(cè)在本研究中影響2 種突變體葉片蠟質(zhì)表現(xiàn)差異的主要成分可能為烷烴。本研究發(fā)現(xiàn)，無蠟突變體葉片中MAH1 相關(guān)基因可以調(diào)控烷烴向仲醇的轉(zhuǎn)化以及仲醇向酮的轉(zhuǎn)化過程，楊昊虹[20]已對(duì)MAH1 相關(guān)基因進(jìn)行克隆與功能驗(yàn)證，本研究與其研究結(jié)果類似。另外，本研究中無蠟突變體葉片中MAH1 相關(guān)基因既有表達(dá)上調(diào)也有表達(dá)下調(diào)，推測(cè)2 種突變體葉片表皮蠟質(zhì)差異表達(dá)可能與烷烴、仲醇及酮的組分構(gòu)成比例有關(guān)。本研究中，F(xiàn)AR 相關(guān)基因通過上調(diào)和下調(diào)來影響長(zhǎng)鏈?；o酶A 向伯醇的轉(zhuǎn)化過程，李玲紅等[21]對(duì)小麥蠟質(zhì)缺失突變體研究發(fā)現(xiàn)FAR 基因在突變體中大部分表達(dá)下調(diào)，少部分表達(dá)上調(diào)，這與本研究結(jié)果一致。WSD1 相關(guān)基因通過調(diào)控長(zhǎng)鏈?；o酶A 和長(zhǎng)鏈伯醇向蠟酯的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)莖、葉的蠟酯積累[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在無蠟突變體葉片中WSD1 上調(diào)基因數(shù)量多于下調(diào)基因數(shù)量，這可能是由于更多的伯醇轉(zhuǎn)化為蠟酯，而減少了伯醇的含量，這與前人研究發(fā)現(xiàn)小麥葉片中主要蠟質(zhì)成分為醇、伯醇以及二酮的研究結(jié)果類似[23-24]。為了更好地研究小麥表皮蠟質(zhì)的調(diào)控機(jī)理，以保障逆境條件下小麥產(chǎn)量的穩(wěn)定[25]，可以借助化學(xué)誘變技術(shù)[26]，以不同遺傳背景下的蠟質(zhì)突變體（多蠟或少蠟）為研究材料，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)蠟質(zhì)分子調(diào)控機(jī)制，并對(duì)篩選到的蠟質(zhì)調(diào)控基因進(jìn)一步克隆和功能驗(yàn)證。

本研究通過對(duì)2 種蠟質(zhì)突變體小麥葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共檢測(cè)到6 840 個(gè)差異表達(dá)基因，包含3 181 個(gè)上調(diào)基因和3 659 個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步對(duì)其蠟質(zhì)功能注釋篩選出相關(guān)差異顯著表達(dá)基因26 個(gè)，主要包括CER1、MAH1、FAR 和WSD1，這些基因通過調(diào)控醛、烷烴、伯醇、仲醇、酮及蠟酯合成過程進(jìn)而影響小麥表皮蠟質(zhì)的差異表現(xiàn)。更重要的是，其中2 個(gè)CER1 相關(guān)基因（TraesCS1D03G0373-900 和TraesCS1D03G0374000）均表達(dá)下調(diào)，抑制烷烴合成而減少蠟質(zhì)含量，預(yù)測(cè)其為小麥葉片蠟質(zhì)的主調(diào)控基因。本研究結(jié)果為小麥葉片表皮蠟質(zhì)的合成基因克隆和功能驗(yàn)證提供了有價(jià)值的理論支撐。