CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)及其在作物遺傳改良中的應用進展

王瑩婕，馬玲玲，梁 振

（山西大學生命科學學院，山西太原 030006）

隨著人口的快速增長，人們對于糧食作物的需求大大增加，然而傳統(tǒng)作物育種方法需要進行雜交、篩選，步驟繁瑣，耗時過長且效率低下，嚴重地限制了育種的速度，基因編輯技術(shù)的發(fā)展改變了這一現(xiàn)狀?；蚓庉嫾夹g(shù)因其可編程性倍受青睞，從鋅指核酸酶（Zinc finder nucleases，ZFNs）技術(shù)到類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)，再到突破性的規(guī)律成簇的間隔短回文重復及其相關(guān)蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/associated protein，CRISPR/Cas9）系統(tǒng)，基因編輯水平日益成熟?；蚓庉嫾夹g(shù)是利用人工設(shè)計的核酸酶對基因組定點修飾[1]，其修飾手段包括基因敲除/入、單堿基編輯、引導編輯等。近年來，基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展。目前常用于基因組編輯的CRISPR 系統(tǒng)基于RNA 的引導來實現(xiàn)對DNA 的切割[2]，幾經(jīng)改進，已能夠以“核苷酸水平”的精度在大多數(shù)生物中進行精確的修飾，因而具有更加廣泛的適用性。通過基因編輯技術(shù)合成變異能夠填補并在某些情況下取代自然遺傳變異，對目的基因進行高效、精準的修飾，極大地縮短了植物育種時間，提高了植物育種的效率。

筆者介紹了CRISPR/Cas9 基因組編輯及其衍生技術(shù)的發(fā)展歷程和工作原理，綜述了多種基因組編輯工具在不同作物育種上的應用發(fā)展，同時也探討了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)目前的一些局限性和未來對于基因編輯作物的展望，以期能為作物改良領(lǐng)域的研究者們提供一些參考，促進作物育種的發(fā)展。

1 基于CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)

1.1 CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)來源于細菌和古細菌，是為抵御噬菌體病毒和外源質(zhì)粒DNA 入侵的一種適應性免疫系統(tǒng)。1987 年，ISHINO 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的DNA 序列中有許多片段存在規(guī)律性重復，但未對其進行詳細研究。20 世紀90 年代，MOJICA 教授在海灘發(fā)現(xiàn)一種古細菌，分析其DNA 序列時，也發(fā)現(xiàn)其有類似規(guī)律重復序列，命名為CRISPR。2003 年，MOJICA 教授發(fā)現(xiàn)，規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列（CRISPR）與CRISPR 關(guān)聯(lián)基因（CRISPR asso ciated，Cas）一起構(gòu)成的原核適應性免疫系統(tǒng)能夠根據(jù)間隔序列的記錄，準確識別這些進化歷史上曾侵入過的噬菌體的特定序列，然后予以靶向的切割[4]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)由CRISPR 序列與Cas 基因家族組成。CRISPR 是原核生物基因組內(nèi)的一段重復序列，由前導序列（leader）、高度保守的重復序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成。前導序列位于CRISPR 基座上游，富含AT 堿基，被認為是CRISPR 序列的啟動子；重復序列包含5～7 bp 回文序列，轉(zhuǎn)錄出的發(fā)卡結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定RNA 的整體二級結(jié)構(gòu)；間隔序列是被細菌俘獲的外源DNA 序列。Cas 基因家族是可編碼DNA 切割結(jié)構(gòu)域的高度保守的與CRISPR 基座相關(guān)聯(lián)的基因，其位于CRISPR 基座附近或分散于基因組其他地方。

1.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)工作原理

根據(jù)Cas 蛋白組織不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為2 個類別，第1 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)利用多蛋白效應復合物，而第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)利用單蛋白效應物。其中，第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)能產(chǎn)生用于加工crRNA、識別降解外源遺傳物質(zhì)的標志性蛋白Cas9。具體而言，這一過程是CRISPR 陣列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、加工形成成熟的crRNA，并與核酸內(nèi)切酶結(jié)合，完成與間隔序列互補的前間隔序列的識別和靶向切割，從而破壞外來遺傳物質(zhì)[5-6]。

2012 年，EMMANUELLE 和JENNIFER確認CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)能在DNA 特定部位定點切開[2]。通過體外切割試驗證明，Cas9 在基因工程中具有一定潛力[7]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要工作原理是通過tracrRNA 與crRNA 結(jié)合形成復合物，招募引導Cas9 蛋白定點切割DNA 序列。此外，研究人員進一步將tracrRNA 與crRNA 組成的復合RNA 進行融合改造，成為僅有一條RNA 鏈的引導RNA（single guide RNA，sgRNA）。在sgRNA 的引導下，Cas 蛋白掃描尋找靶標DNA 上的一段保守原間隔序列（Protospacer Adjacent Motif，PAM），當sgRNA與雙鏈DNA 發(fā)生堿基互補配對時，Cas9 的2 個核酸酶催化中心對靶序列切割，產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（Double Strand Breaks，DSBs），進而激發(fā)細胞內(nèi)源的非同源末端連接（Non-homologous End-Joining，NHEJ）或同源重組（Homology-Directed Repair，HDR）修復機制，實現(xiàn)對靶標基因的定點編輯[8]。

2 基于CRISPR/Cas9 的基因組編輯策略

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)設(shè)計非常簡潔，其利用設(shè)計的特異性向?qū)NA 分子作為DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域從而替代了蛋白融合的過程。除此之外，相比以往2 種基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的靶位點選擇也極為靈活，由于該系統(tǒng)構(gòu)建過程簡便，編輯效率極高，致使其在短時間內(nèi)飛速發(fā)展，逐步成為基因編輯領(lǐng)域的主流技術(shù)[9-10]。在CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究人員又相繼開發(fā)出新型的單堿基編輯和引導編輯技術(shù)，進一步豐富了基因組編輯工具箱[11-12]?；贑RISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)主要通過以下策略對作物基因進行靶向修飾。

2.1 基于DNA 雙鏈斷裂的基因編輯

基因敲除是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中重要且廣泛的應用之一。2013 年，張鋒團隊首次將CRISPR 技術(shù)應用到哺乳動物細胞內(nèi)，并隨后成功在小鼠和人細胞中實現(xiàn)了靶向誘導DSB[7]。自CRISPR/Cas 技術(shù)誕生以來，植物學家便立刻對其在植物中的適用性進行探索，期待開發(fā)出更高效的新型植物基因組編輯方式。SHAN 等[13]證明了定制的sgRNAs 可以指導Cas9 在2 種最廣泛種植的糧食作物水稻（Oryza sativa）和普通小麥（Triticum aestivum）中誘導序列特異性的基因組修改。除了基因敲除以外，LI 等[14]借助NHEJ 途徑產(chǎn)生基因替換和插入的內(nèi)含子打靶方法，產(chǎn)生了抗草甘膦的水稻植株。通過設(shè)計1 對sgRNAs 靶向目標外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子區(qū)域，以及一個包含相應核苷酸替換的供體質(zhì)粒，產(chǎn)生2 個sgRNA 靶點之間的片段通過NHEJ 途徑被目標核苷酸片段所取代的重組DNA 序列。這一方法成功實現(xiàn)了靶向基因插入，將5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）保守基序中2 個氨基酸成功替換從而賦予水稻草甘膦抗性[14]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)高效誘導水稻靶向突變的實踐證實了該系統(tǒng)的通用性和高效性。但該方法產(chǎn)生和隨機插入或缺失，在植物基因精確修改方面難以施展應用。植物細胞還可通過精準同源重組修復途徑消除DSB，這一途徑保真度高，被用來產(chǎn)生精確的基因修改。然而由于HDR 介導的靶向整合頻率比NHEJ 低得多，并且需要外源修復模板的傳遞，故應用受到限制。其相關(guān)應用中一直存在效率低下的問題。對大豆的ALS1 基因進行HDR 介導的精準基因編輯，成功將178 位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，但所有愈傷中只發(fā)生了一個這樣的抗氯磺隆突變事件[15]。SAUER 等[16]使用單鏈寡核苷酸（single-stranded oligonucleotides，ssODNs）結(jié)合CRISPR/Cas9 組件對亞麻EPSPS 基因進行精確編輯，在3 個獨立試驗中，精確的EPSPS 編輯頻率在0.09%～0.23%。單獨或組合使用不同形式的外源DNA 模板，NHEJ 和HDR之間的相互競爭等因素均會影響基因敲入的效率。由于HDR 發(fā)生的頻率很低，迫切需要一種簡單、通用和有效的方法來實現(xiàn)DNA 片段的替換或敲入。

2.2 堿基編輯器

CRISPR/Cas9 介導的點突變都需要先在靶位點或其附近產(chǎn)生DSBs。盡管利用外源模板的情況下借助HDR 可以產(chǎn)生精確的突變，但由于細胞對斷裂的響應會產(chǎn)生隨機的插入或缺失，帶來了不必要的副產(chǎn)物。堿基編輯無需DSBs、同源定向修復（HDR）過程或供體DNA 模板，即可在目標基因組位點將一個堿基對直接、不可逆地轉(zhuǎn)換為另一個堿基對。dCas9 能夠在靶位點結(jié)合但失去了切割的能力，當dCas9 與介導堿基轉(zhuǎn)換的酶相結(jié)合時即有望直接在靶點進行點突變。2016 年，KOMOR 等[17]將胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1 與dCas9 連結(jié)形成一種新型胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine Base Editor，CBE），并通過不斷優(yōu)化和改造，得到了效率大幅度提高的BE3和BE4 版本，并在人和小鼠細胞中成功將胞嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶。其工作原理是：由于胞嘧啶和尿嘧啶的結(jié)構(gòu)相似，利用胞嘧啶脫氨酶對C 脫氨可以形成U，在DNA 繼續(xù)修復過程中，U 可被聚合酶識別為T，從而完成C 到T 的堿基編輯過程。BE 的產(chǎn)生受到了關(guān)注，并被用于不同物種進行嘗試。2017 年，David Liu 實驗室開發(fā)出腺嘌呤堿基編輯器（AdenineBaseEditor，ABE），該技術(shù)同樣也是通過將dCas9蛋白和腺苷脫氨酶組成融合蛋白，以此來實現(xiàn)將堿基A 突變成G 的突變編輯[18]。這一過程是利用腺苷脫氨酶對A 脫氨可以形成I（次黃嘌呤），I 在DNA修復中被識別成G，從而實現(xiàn)A 到G 堿基編輯。CBE和ABE 是目前使用廣泛的2 種單堿基編輯器，可以在不產(chǎn)生DSBs 的情況下，在目的基因的靶標位置高效地實現(xiàn)C 到T 或者A 到G 的堿基精準替換。目前植物中已建立了多版本高效CBE 和ABE編輯系統(tǒng)[19-21]，且被應用于作物農(nóng)藝性狀的改良。

ABE 和CBE 分別只能實現(xiàn)單一的A·T 到G·C和C·G 到T·A 轉(zhuǎn)換，為了實現(xiàn)提高編輯靈活性，擴大靶向范圍，LI 等[22]融合了胞苷脫氨酶和腺苷脫氨酶，從而得到兼具CBE 和ABE 功能的堿基編輯器即STEME，能夠?qū)崿F(xiàn)C 到T、A 到G 以及二者同時的轉(zhuǎn)換。將nCas9 升級為nCas9-NG 得到的STEMENG，可靶向NG PAM。值得注意的是，STEME-NG 在植物細胞能產(chǎn)生種類豐富的突變，除了C 到T、A 到G，還有C 到G/A 和G 到C/T 及少量插入或缺失，適于定向進化。對OsACC 基因的定向進化發(fā)現(xiàn)了未經(jīng)報道的抗ACC 抑制性除草劑的突變：P1927F和W2125C。該工具因為靶向范圍廣，能實現(xiàn)多種堿基轉(zhuǎn)換，具備很強的通用性，能夠在其他作物乃至動物細胞的蛋白進化中發(fā)揮更大的應用潛能[22]。

2.3 引導編輯器

CBE 與ABE 可以對C 到T 或者A 到G 堿基間進行轉(zhuǎn)換，但無法實現(xiàn)對任意堿基轉(zhuǎn)換。為解決這一問題，2019 年，David Liu 實驗室開發(fā)了一種可在不產(chǎn)生DSB 且不引入供體DNA 的情況下實現(xiàn)基因精準編輯工具，稱為引導編輯器（PE）[23]。引導編輯器在CRISPR/Cas9 的基礎(chǔ)上進行改造，首先將nCas9（H840A）與逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）相融合形成新的融合蛋白，其次在sgRNA 3′末端增加一段包含引物結(jié)合位點（PBS）和逆轉(zhuǎn)錄模板（Reverse Transcriptase，RT）在內(nèi)的RNA 序列，稱作引導編輯器的向?qū)NA（Prime Editing Guide RNA，pegRNA）[24]，最后在pegRNA 的引導下，將nCas9（H840A）與逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 復合物帶至靶標位置，以pegRNA 上的反轉(zhuǎn)錄序列為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生一段含有定點突變的單鏈DNA 序列，進而通過DNA 修復途徑實現(xiàn)多種精準的基因突變。

引導編輯器無需DNA 模板和DSBs 便可實現(xiàn)所有堿基的自由轉(zhuǎn)換（包括轉(zhuǎn)換和顛換），具有很高的安全性和應用潛力。2020 年，高彩霞團隊建立了適用于植物的引導編輯器（Plant Prime Editor，PPE），在水稻和小麥中利用PPE 可以產(chǎn)生各種類型的單堿基替換[25]。近乎同時期，先后還有其他5 篇文章報道了PE 系統(tǒng)在植物中的建立[26-30]。但是，起初發(fā)展的PPE 系統(tǒng)普遍效率低下，多個研究團隊對其進行了進一步優(yōu)化[31-33]。其中，2021 年，高彩霞團隊通過設(shè)計雙pegRNA 從而提高了水稻植株引導編輯效率[34]。隨后，高彩霞團隊在植物細胞及植物個體2 個水平上對引導編輯系統(tǒng)的脫靶效應進行深入評估。在對29 株引導編輯系統(tǒng)編輯的水稻植株進行了全基因組測序后，發(fā)現(xiàn)引導編輯未導致基因組出現(xiàn)單堿基突變和小片段插入或缺失等脫靶情況[35]。同年，David Liu 實驗室對引導編輯器進行改良，開發(fā)了效率更高的引導編輯系統(tǒng)，稱為PE4和PE5，并在哺乳動物細胞中得到驗證[36]。引導編輯系統(tǒng)具有極高的編輯特異性，為人類疾病治療和農(nóng)作物育種等帶來了無限可能。

3 利用CRISPR/Cas9 對作物性狀改良

常規(guī)育種方式周期長，且受到各種因素限制，通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種方式能夠擺脫自然環(huán)境變化等一系列因素的干擾，從而縮短培育周期。如今CRISPR/Cas9 基因編輯及其相關(guān)衍生技術(shù)已被廣泛應用于作物的遺傳改良（表1），包括對作物與產(chǎn)量、質(zhì)量、抗病、抗除草劑、抗非生物脅迫相關(guān)的基因定點編輯，能夠高效且精確的改良現(xiàn)有作物的農(nóng)業(yè)性狀，在作物分子設(shè)計育種方面具有廣闊前景。

表1 CRISPR/Cas9 在作物性狀改良上的應用

3.1 提高產(chǎn)量

在作物育種中，最需要改進的性狀之一就是產(chǎn)量。對于大多數(shù)作物來說，產(chǎn)量構(gòu)成因素主要包括每穗粒數(shù)和大小、每株成穗分蘗數(shù)、粒質(zhì)量及粒級[37，74]。2018 年MIAO 等[38]研究表明，與野生型水稻植株相比，CRISPR/Cas9 編輯創(chuàng)造的pyl1/4/6 三重敲除水稻變體產(chǎn)量高，穗粒長，主穗數(shù)更多，穗發(fā)芽更少。通過同時敲除水稻3 個與粒質(zhì)量相關(guān)的基因（GW2、GW5 和TGW6），極大地增加了水稻粒質(zhì)量[39]。通過敲除與營養(yǎng)分配有關(guān)的氨基酸滲透酶的編碼基因OsAAP3，培育出了在保持水稻品質(zhì)的同時分蘗數(shù)和籽粒產(chǎn)量提高的水稻品種[40]。還有研究表明，環(huán)型E3連接酶編碼基因TaGW2 的敲除也被證實能增加小麥籽粒的粒長和粒寬，從而提高小麥產(chǎn)量[41-42]。在影響產(chǎn)量的因素中，調(diào)控細胞分裂素穩(wěn)態(tài)是提高谷物產(chǎn)量一種切實可行的方式。敲除小麥中編碼細胞分裂素氧化酶/脫氫酶（CKX）的基因TaCKX2-D1可有效增加其粒數(shù)，提高小麥產(chǎn)量[43]。利用CRISPR/Cas9 敲除突變細胞分裂素激活酶OsLOGL5基因CDS 區(qū)的3′末端，可增加穗粒數(shù)和粒質(zhì)量，提高水稻產(chǎn)量[44]。

3.2 改良品質(zhì)

隨著人們生活水平的提高，對于作物品質(zhì)的要求也隨之增高。直鏈淀粉含量低的谷物具有更好的食用和烹飪價值，在紡織和黏合劑行業(yè)也得到廣泛的應用。如今，通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)，可以改善水稻直鏈淀粉含量、營養(yǎng)價值及香味。通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對水稻W(wǎng)x基因進行敲除，使得水稻直鏈淀粉含量降低[45，75]。與之類似，玉米Wx1基因也編碼一種與籽粒組成有關(guān)的淀粉合成酶[46]，通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除Wx1基因可以使玉米支鏈淀粉含量接近100%[47]，并且其他表型不發(fā)生變化。樊世婷[48]研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，對春大麥的Waxy基因編碼區(qū)進行定點敲除，可以獲得直鏈淀粉含量降低的編輯系，從而改良大麥種子的食用和加工品質(zhì)。而水稻香味也是其中一種重要的品質(zhì)，煮熟后帶有香味的水稻品種更容易被人們購買選擇，具有更高的商業(yè)價值。利用TALENs 和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將編碼甜菜堿醛脫氫酶的基因OsBADH2敲除，可以增加水稻的香味[49，76]。敲除α-醇溶蛋白家族成員最保守的結(jié)構(gòu)域，開發(fā)出的低筋、非轉(zhuǎn)基因小麥品系，可降低遺傳易感腹腔免疫反應[77]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還被用于改良作物的營養(yǎng)成分，如提高番茄的番茄紅素和γ-氨基丁酸含量，增加水稻的類胡蘿卜素含量和產(chǎn)生高油酸大豆[50，78-81]。DAHAN 等[51]利用HDR 編輯番茄中的CRTISO基因，從而將受體材料中的胡蘿卜素含量顯著提高。等[82]利用雙生病毒復制子，通過同源重組途徑在番茄ANT1基因的啟動子區(qū)域另外插入CaMV35S 啟動子，實現(xiàn)ANT1基因的原位定點激活，并將番茄中花青素的含量提高數(shù)倍。此外，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)還開發(fā)出更耐儲藏的番茄[53]。綜上可知，基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)能夠簡便且有效的對作物進行一系列品質(zhì)改良。

3.3 提高抗病性

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還用于作物抗病性的研究。白粉病是一種毀滅性的真菌病害。利用TALENs 和CRISPR/Cas9 技術(shù)，靶向突變六倍體小麥中3 個編碼抗霉位點（MLO）蛋白的同源等位基因，可產(chǎn)生具有廣譜抗白粉病的小麥品系[52]。通過突變小麥EDR1（編碼MAPK 激酶的基因）的3 個同源基因，獲得的Taedr1突變株對白粉病的抗性增強[54]。此外，CRISPR/Cas9 靶向編輯番茄的SlMlo1基因后，獲得的敲除突變體也能對白粉病產(chǎn)生抗性[55]。水稻白葉枯病是由γ-變形菌屬水稻黃單胞菌引起的一種毀滅性病害，嚴重威脅著水稻生產(chǎn)。在感染過程中，一組細菌因子可激活SWEET基因的轉(zhuǎn)錄，而SWEET基因的產(chǎn)物是緩解疾病易感性所必需的。通過使用CRISPR/Cas9 突變水稻SWEET11、SWEET13和SWEET14基因的啟動子區(qū)域，可產(chǎn)生對細菌性水稻白葉枯病病菌具有廣譜抗性的水稻品系[56-58]。另外，敲除乙烯反應因子轉(zhuǎn)錄基因OsERF922，可提高水稻對稻瘟菌的抗性[59]。赤霉病是一種嚴重影響小麥質(zhì)量和產(chǎn)量的病害。TaNFXL1基因與禾谷鐮刀菌致病性有關(guān)，TaNFXL1基因被定點敲除后，可以獲得赤霉病抗性明顯提高的小麥品種[60]。編碼9-脂氧合酶的Lpx-1基因被定點突變后也可以提高小麥抗病性[83]。此外，利用CRISPR/Cas9 敲除手段，提高了植物對多種病毒的抗性，如水稻東格魯病毒[84]、棉花曲葉病病毒[85]、花椰菜花葉病毒[86]、雙生病毒[61]等。

3.4 提升非生物脅迫的抗性

干旱、鹽分等非生物脅迫會對作物構(gòu)成重大威脅，并造成巨大的經(jīng)濟損失。在非生物脅迫中，由于耕地污染，需要防止有毒重金屬在作物中積累。通過剔除OsHAK1、OsARM1及OsNramp5基因，分別獲得放射性銫、砷和鎘含量降低的水稻[62-64]。ZmSRL5與玉米角質(zhì)層蠟結(jié)構(gòu)形成有關(guān)，突變ZmSRL5可以提高玉米的耐旱性[65]。對玉米乙烯反應的負調(diào)控因子ZmARGOS8基因的啟動子區(qū)域進行基因編輯，也可以提高玉米的抗旱性[87]。周天順等[88]選用超級稻恢復系“華占”為受體材料，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)改良的突變體水稻對ABA 的敏感性降低、葉片水分散失速度減慢，提高了水稻耐旱、耐高溫和耐滲透脅迫的能力。KUMAR 等[89]利用CRISPR/Cas9技術(shù)誘導秈稻抗旱基因發(fā)生突變，突變體在苗期表現(xiàn)出中等水平的耐滲透脅迫能力和高水平的耐鹽能力，提高了秈稻品種的耐旱性和耐鹽性。

3.5 增強除草劑抗性

雜草是限制作物產(chǎn)量的重要因素。商業(yè)化除草劑種類繁多，除草效果好，為糧食增產(chǎn)作出了巨大貢獻，推動了農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的進程。絕大多數(shù)除草劑以植物特定的代謝關(guān)鍵酶作為靶標，從而致死。開發(fā)抗除草劑的作物品種，能夠擴展除草劑的應用范圍，使除草劑應用更安全。自然界發(fā)現(xiàn)的除草劑抗性突變位點很多。將已發(fā)現(xiàn)的抗性突變引入作物就能獲得抗特定除草劑的植株。以往通過傳統(tǒng)育種方式已經(jīng)開發(fā)出抗除草劑品種[90]，然而這樣的育種畢竟耗時費力。CRISPR 技術(shù)縮短了這一過程，并且能同時獲得多種除草劑抗性。

乙酰乳酸合成酶ALS是支鏈氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶，所以開發(fā)出了許多以ALS 為靶標的除草劑，如磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑[66]。對ALS 基因自然發(fā)生的點突變研究表明，替換ALS 基因中的特定堿基可以賦予擬南芥除草劑抗性[91]。由于ALS基因的保守性，對不同植物的ALS抗性位點進行堿基替換都可以獲得抗性突變株系。HDR 作為最初的堿基替換途徑，需要使用和靶位點具有同源性的外源模板，RNA 作為修復模板成功在不同物種中修復DSB。sgRNA 作為修復模板更容易遞送至靶標細胞當中，因此，BUTT 等[67]設(shè)計了嵌合sgRNA（chimeric sgRNA，cgRNA），有sgRNA 和修復模板雙重功能。不同cgRNA 結(jié)構(gòu)具有不同的編輯效率，用cgRNA/Cas9基因編輯平臺對OsALS 進行定向基因編輯可快速高效地獲得抗除草劑雙草醚（Bispyribac Sodium，BS）的水稻。CBE 或ABE 靶向編輯水稻OsALS 基因，同樣可以賦予水稻除草劑抗性[68-69]。利用CBE編輯小麥TaALS 基因，可產(chǎn)生具有抗除草劑性狀的小麥突變株系[21]。另外，研究人員通過CBE 成功突變油菜乙酰乳酸合成酶基因BnALS，獲得具有除草劑抗性的油菜[70]。TIAN 等[73]利用BE 改造西瓜的ALS，在T0的堿基編輯效率高達23%，獲得了無轉(zhuǎn)基因的抗除草劑西瓜。另外，還成功構(gòu)建了抗除草劑大豆[15]。此外，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對玉米ZmALS2 基因進行精確替換，使編輯后的玉米材料具備氯磺隆抗性[92]。ZHANG 等[72]利用堿基編輯的手段進行抗除草劑小麥的開發(fā)，得到的無轉(zhuǎn)基因小麥種質(zhì)耐受磺酰脲類、咪唑啉酮類和芳氧基苯氧丙酸類除草劑。另外，煙嘧磺隆培養(yǎng)基可以直接作為篩選培養(yǎng)基進行初步篩選從而獲得雙重除草劑抗性的新品種，目前已利用這一方式獲得了雙突變體小麥，能對2 種除草劑產(chǎn)生抗性[72]。Target-AID 是將dCas9 和PmCDA1融合形成的合成復合物，可在酵母和哺乳動物細胞實現(xiàn)靶向核苷酸的C 到T 替換[69]。使用nCas9（D10A）的Target-AID 有著更高的效率，將Target-AID 經(jīng)過密碼子優(yōu)化使其適于植物基因組編輯，并用于水稻ALS的精準編輯，能夠賦予水稻除草劑抗性。ABE7.10可在實現(xiàn)精準的A·T 到G·C 轉(zhuǎn)換，高彩霞團隊利用這一工具對水稻OsACC 的2186 位進行Cys 到Arg的點突變，賦予了水稻除草劑抗性[71]。此外，通過精確編輯水稻OsTubA2 基因，成功獲得具有三氟甲磺酸和二甲戊樂靈除草劑抗性的水稻種質(zhì)[93]。

4 CRISPR/Cas9 局限性

雖然CRISPR/Cas9 及其相關(guān)的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，目前已在作物基因功能解析和精準分子設(shè)計育種領(lǐng)域有著廣泛的應用，但是其依舊存在著一些限制，其中主要包括編輯范圍和植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的限制。

4.1 編輯范圍限制

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)加快了作物性狀改良的步伐，然而CRISPR/Cas9 核酸酶的靶位點被相應PAM序列所限制，使其難以實現(xiàn)在任意位置上的編輯[94]。因此，如何對Cas9 蛋白進行相應地改造，拓展CRISPR 核酸酶對不同PAM 的兼容性，擴大CRISPR/Cas9 的可編輯范圍，也決定了未來CRISPR系統(tǒng)在作物中能否廣泛使用。2015 年，Keith 實驗室研發(fā)出可識別NGA 的SpCas9-VRQR 突變體和識別NGCG 的SpCas9-VRER 突變體[95]，自此開始，不斷出現(xiàn)能識別不同PAM 序列的各類變體，致使Cas9 的編輯范圍大大增加。2018 年，David Liu 實驗室所構(gòu)建的xCas9 3.7 變體能有效識別NGG、GAA和GAT[96]，推動了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的進展。隨之Nureki 實驗室構(gòu)建出可識別NG 的SpCas9-NG 變體，進一步擴展了可靶向范圍[97]。之后，各實驗室在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進一步拓展PAM識別位點。2020 年，David Liu 實驗室構(gòu)建出一系列SpCas9 突變體，致使可識別的PAM序列拓展至NRNH[98]。同年，Kleinstiver 實驗室改造SpCas9 后得到突變體SpRY，可有效識別NRN 和NYN[99]。至此，SpCas9 及其突變體幾乎擺脫了PAM的限制，極大地提升了作物基因編輯的范圍，但編輯效率略有降低，未來依舊需要進一步優(yōu)化，在實現(xiàn)對編輯范圍擴展的前提下提升編輯效率。另有研究表明，編輯范圍擴大會導致自我靶向，從而進一步降低編輯效率，影響編輯產(chǎn)物純度，這也是Cas 變體應用受限的原因之一，這一問題的解決必將進一步擴大CRISPR 系統(tǒng)的應用范圍。

4.2 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)限制

實現(xiàn)作物轉(zhuǎn)基因高轉(zhuǎn)化率離不開高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。目前在利用基因編輯技術(shù)對作物進行遺傳改良過程中，主要使用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是農(nóng)桿菌介導法和基因槍轟擊法。1983 年，研究人員利用農(nóng)桿菌介導法成功轉(zhuǎn)化煙草植株，隨后，在作物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌介導植物遺傳轉(zhuǎn)化的方式不斷改進，由于其轉(zhuǎn)化效率最高，逐漸成為了目前最常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化手段[100]。根癌農(nóng)桿菌是一種來自土壤的革蘭氏陰性菌，在自然環(huán)境下，農(nóng)桿菌能感染雙子葉植物傷口，并將T-DNA 通過宿主的DNA修復機制整合至宿主基因組中并表達[101]。農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化就是利用這種DNA 轉(zhuǎn)移機制從而將外源DNA 導入到植物基因組中。但由于農(nóng)桿菌介導法對宿主范圍有一定限制，并不能在所有作物植株和組織中適用?；驑屴Z擊法是利用高壓氣體加速將包被在金屬微粒表面的外源基因?qū)胧荏w細胞的一種DNA 直接轉(zhuǎn)化方法?；驑屴Z擊法可以同時轉(zhuǎn)化多個基因，還可以轉(zhuǎn)入RNA 或蛋白，為植物基因組編輯提供了新的可能性。

在這些常規(guī)轉(zhuǎn)化過程中，DNA 分子經(jīng)常整合到基因組或目標DSB 位點，易于導致外源基因引入，存在基因安全風險[102]。RNA 引導的工程化核酸酶核糖核蛋白首先在哺乳動物細胞中應用。由于RNP容易降解，因而能夠降低脫靶頻率，并在人類細胞中實現(xiàn)了高頻靶向突變[102]。DNA-free 利用CRISPR/Cas9 核糖核蛋白復合物（Ribonucleoprotein complexes，RNPs）直接轉(zhuǎn)入植物細胞中，無需轉(zhuǎn)化手段即可完成對靶向基因的編輯。2015 年，WOO 等[103]利用預組裝的CRISPR/Cas9 核糖核蛋白RNPs 將RNP 送至萵苣原生質(zhì)體中。2016 年，SVITASHEV等[104]在玉米進行耐除草劑的基因編輯中，首次將預先組裝的Cas9-gRNA 核糖核蛋白（RNP）導入玉米胚細胞，實現(xiàn)了對玉米ALS2的精確修飾。2017 年，LIANG 等[105]使用CRISPR/Cas9 核糖核蛋白復合物成功在小麥中完成DNA-free 編輯。2020 年，MA等[106]利用RNA 病毒載體向植物中遞送CRISPR/Cas9 核酸內(nèi)切酶，在煙草中成功完成DNA-free 編輯并能實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳。雖然RNP 遞送的方式脫靶率極低，但和DNA 載體傳遞方式相比，RNP 傳遞方式顯示出顯著降低的突變頻率[104]。因而，在實際應用中要根據(jù)基因組編輯的需要和試驗目標選擇最優(yōu)的方法。

5 基因編輯作物展望

2013 年，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)首次對植物進行基因組編輯[13，107]。隨后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)廣泛運用在小麥[108]、水稻[109]、大豆[110]、玉米[89]等重要農(nóng)作物中，逐漸形成了依賴于基因編輯技術(shù)的現(xiàn)代分子設(shè)計育種模式。利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)編輯目標作物內(nèi)源基因，利用后代雜交分離的方式剔除導入的外源基因，可獲得不含外源基因基因編輯產(chǎn)物。相比于效率低下的傳統(tǒng)育種方式，現(xiàn)代育種技術(shù)不僅效率高，同時也能克服傳統(tǒng)育種方式育種過程緩慢復雜、不易結(jié)實等缺點，對于作物育種發(fā)展具有重要意義。隨著測序技術(shù)不斷發(fā)展，測序成本逐年降低，目前許多農(nóng)作物的基因組測序工作已基本完成，為后續(xù)作物的遺傳改良提供了極大的便利。盡管CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在作物育種應用中已取得了一些成果，目前該方法仍存在諸多問題。一方面，植物常用的轉(zhuǎn)化方法主要是農(nóng)桿菌介導法和基因槍轟擊法，這2 種方法已十分成熟，但并不適用于所有的物種，尋找新的高效低成本的轉(zhuǎn)化方式，有助于未來開拓出更多種類的基因編輯作物。另一方面，雖然單堿基編輯器能夠定點編輯且不導致DNA 斷裂，但其仍需要進一步優(yōu)化，降低脫靶效率以保證編輯的精準。此外，由于基因編輯作物中攜帶外源基因，在大規(guī)模生產(chǎn)前需要將外源基因剔除，如何更高效精準地剔除外源基因，也是未來需要考慮的方向。盡管現(xiàn)代育種技術(shù)對于作物品質(zhì)改良優(yōu)勢巨大，但由于市場的監(jiān)管，絕大部分作物品種依舊只能在實驗室中生產(chǎn)，暫時不能大規(guī)模批量培育，與普通非編輯作物一樣進入市場中。但是相信日后對于基因編輯作物的管理方式也會逐漸緩和。綜上，現(xiàn)代育種技術(shù)對于我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展意義重大，CRISPR/Cas9 技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展極大地改變了作物育種方式，并有望在將來帶來更多品種改良新種質(zhì)，進一步推動科學研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。