減數(shù)分裂關(guān)鍵基因Spo11和Mlh1在鯽鯉雜交魚中的遺傳分析

朱辣 張美文 朱明 李琪 賀旺超 秦偉玲 周毅 楊聰慧 張純 劉少軍

摘要：【目的】明確鯽鯉雜交魚減數(shù)分裂關(guān)鍵基因（Spo11和Mlh1）的序列和表達(dá)特征，揭示異源雙親減數(shù)分裂因子在雜交品系的傳代中是否存在選擇壓力，為解析遠(yuǎn)緣雜交跨越生殖障礙打下遺傳學(xué)基礎(chǔ)?！痉椒ā恳砸研纬煞€(wěn)定品系的鯽鯉雜交魚為研究對(duì)象，包括紅鯽（RCC）、湘江野鯉（CC）、鯽鯉雜交子代（F1）和異源四倍體鯽鯉（4nAT），通過分子克隆、序列比對(duì)及Western blotting等方法研究Spo11基因和Mlh1基因在鯽鯉雜交魚中的遺傳規(guī)律和表達(dá)特征，并分析其與原始父母本間的關(guān)系?！窘Y(jié)果】RCC、CC、F1和4nAT的Spo11基因CDS序列絕大部分為1152 bp，僅4nAT中存在1157 bp的CDS序列;在F1和4nAT中均穩(wěn)定獲得2種原始親本的獨(dú)立遺傳片段，且在4nAT中還檢測(cè)到原始父母本重組基因片段[4n-SPO11-11-2（MT648223）]，其與原始母本RCC-Spo11基因?qū)?yīng)片段的相似性為96.2%，與原始父本CC-Spo11基因?qū)?yīng)片段的相似性為93.7%，表明Spo11基因表達(dá)模式并非完全保守性及4nAT存在遺傳變異性。Mlh1基因CDS序列在鯽鯉雜交魚中同樣穩(wěn)定存在，表現(xiàn)出穩(wěn)定的雜合遺傳特征，即F1和4nAT中既存在RCC-Mlh1基因CDS序列（相似性為99.5%），也存在CC-Mlh1基因CDS序列（相似性為99.4%），鯽鯉雜交魚相應(yīng)的遺傳片段和原始親本間僅存在極少的基因位點(diǎn)變異。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，SPO11蛋白和MLH1蛋白在鯽鯉雜交子代中均能正常表達(dá)。其中，4nAT的精巢中僅表達(dá)相對(duì)分子量較大的SPO11-β亞體，而F1的精巢中僅表達(dá)相對(duì)分子量較小的SPO11-α亞體?！窘Y(jié)論】F1和4nAT能穩(wěn)定雜合遺傳原始親本RCC的Spo11基因和Mlh1基因，雖然在CDS序列結(jié)構(gòu)上存在少量差異，但最終都能獨(dú)立表達(dá)相關(guān)蛋白，即雜交魚形成過程中減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的表達(dá)正?？蔀槠淇缭缴痴系K打下分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 異源四倍體鯽鯉（4nAT）;Spo11基因;Mlh1基因;減數(shù)分裂;遠(yuǎn)緣雜交;遺傳模式

中圖分類號(hào)： S917 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）08-2251-08

Genetic analysis of key genes Spo11 and Mlh1 controlling meiosis in hybrid fish of Carassius auratus red var. （♀） × Cyprinus carpio L. （♂）

ZHU La， ZHANG Mei-wen， ZHU Ming， LI Qi， HE Wang-chao， QIN Wei-ling，

ZHOU Yi， YANG Cong-hui， ZHANG Chun*， LIU Shao-jun*

（State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish/Engineering Research Center of Polyploid Fish Reproduction and Breeding of Ministry of Education/College of Life Sciences， Hunan Normal University，

Changsha ?410081， China）

Abstract：【Objective】The present study analyzed the characteristics of gene sequences and expression of key genes （Spo11 and Mlh1） in meiosis from the hybrid crucian carp（Carassius auratus red var.， ♀， abbreviated as RCC）×common carp（Cyprinus carpio L.， ♂， abbreviated as CC） ， which would reveal whether there was selection pressure for meiosis factors in hybrid lines， providing the genetic basis for understanding the mechanism of breaking through reproductive barriers in hybrid fishes. 【Method】In this study， the hybrid strains of RCC×CC which has formed stable strain was taken as research objects， containing RCC， CC， allodiploid hybrid of RCC（♀）×CC（♂） （abbreviated as F1） and allotetraploid hybrid of RCC（♀）×CC（♂）（abbreviated as 4nAT）， respectively. The genetic and expression characteristics of Spo11 gene and Mlh1 gene in hybrid crucian carp were studied by molecular cloning， sequence alignment and Western blot， and the gene-tic relationships among them and their original parents were analyzed. 【Result】Most of the CDS sequences of Spo11 gene in RCC， CC， F1 and 4nAT were 1152 bp， butsome1157bp CDS sequences were also found in 4nAT. Two independent genetic fragments of the original parents were stably obtained in F1 and 4nAT， and the recombinant gene fragment [4N-SPO11-11-2（MT648223）] of the original parents was also detected in 4nAT， and its similarity to the corresponding fragment of the RCC-SPO11 gene of the maternal was 96.2%， and to the corresponding fragment of the CC-Spo11 gene of the paternal was 93.7%， indicating that the expression pattern of Spo11 gene was not completely conserved and 4nAT possessed some genetic variations. CDS sequences of Mlh1 gene also were stably in hybrid crucian carp， showing stable heterozygous genetic characteristics， namely both CDS sequences of RCC-MLH1 gene（99.5%） and CC-MLH1 gene（99.4%） in F1 and 4nAT， and there were only a few gene loci variation in the corresponding genetic fragment between the original parents and hybrid fish. Furthermore， the results of western blotting showed that both SPO11protein and MLH1 protein expressed normally in the hybrid progeny of RCC（♀）×CC（♂）. The SPO11-β subunit with large molecular weight was only expressed in the testis of 4nAT， while SPO11-α subunit with small molecular weight was only expressed in testis of F1. 【Conclusion】These results show that F1 and 4nAT stabilize the Spo11 gene and Mlh1 gene of the heterozygous inherited original parental RCC， although there are small differences in CDS sequence structure， they can express related protein independently. It indicates that key meiotic genes are expressed normally during hybrid fish formation， and lay an important genetic basis for the analysis of the distant hybridization to overcome reproductive barriers.

Key words： allotetraploid crucian carp（4nAT）; Spo11 gene; Mlh1 gene; meiosis; distant crossing; genetic pattern

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31873038，31730098，U19A2040）; National Mo-dern Agriculture Industry Technology System Construction（CARS-45）

0 引言

【研究意義】異源四倍體鯽鯉（4n=200，簡(jiǎn)稱4nAT）是世界上首次人工培育的兩性可育異源四倍體魚，以其為父本、日本白鯽為母本，可雜交形成三倍體湘云鯽（3n=150）（劉少軍等，2000）。湘云鯽具有生長(zhǎng)速度快、不育及肉質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，已在我國(guó)28個(gè)?。ㄊ校┐笠?guī)模推廣養(yǎng)殖，產(chǎn)生了顯著的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益（顏金鵬等，2007）。4nAT源自紅鯽（Carassius auratus red var. ♀）和鯉（Cyprinus carpio L. ♂）的遠(yuǎn)緣雜交，其F1代部分可育，自交獲得的F2代部分能產(chǎn)生不減數(shù)的二倍體卵子和二倍體精子，從F3代中選育出4nAT。該四倍體魚兩性可育，且連續(xù)繁殖30余代，形成了遺傳性狀穩(wěn)定的異源四倍體魚群體（Liu et al.，2001）。在魚類遠(yuǎn)緣雜交育種過程中，減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的遺傳與表達(dá)直接關(guān)系到雜交魚生殖細(xì)胞能否越過減數(shù)分裂生殖障礙（Tao et al.，2008）。因此，在已越過生殖障礙的鯽鯉雜交魚品系中，解析減數(shù)分裂關(guān)鍵基因在雜交子代和原始親本間的遺傳關(guān)系及表達(dá)情況，有助于揭示雜交魚跨越生殖障礙的機(jī)理，進(jìn)而有效指導(dǎo)魚類遠(yuǎn)緣雜交育種?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】4nAT及相關(guān)鯽鯉雜交子代除了兼具原始父本和母本的特征條帶外，還具備一些特異的非親本特征條帶（李建中等，2003，2005;劉季芳等，2007a，2007b;袁柳嬌等，2020）。顏金鵬等（2005）對(duì)4nAT雌核發(fā)育后代及其親本進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子代G1與母本AT間的相似率為97%，遠(yuǎn)高于子代G1與父本SSC間的60%，說明異精激發(fā)產(chǎn)生的雌核發(fā)育后代G1的遺傳物質(zhì)與母本相同。Zhang等（2015）通過5S rDNA染色體原位雜交，發(fā)現(xiàn)鯽鯉雜交F1代及4nAT穩(wěn)定遺傳了等比例的原始親本紅鯽染色體組和鯉染色體組。但值得注意的是，4nAT存在重組基因片段，且較F1代具有更多的基因組變異（Wang et al.，2015;Ye et al.，2017a，2017b）。Liu等（2016）通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，二倍體鯽鯉后代表現(xiàn)出父系偏向表達(dá)，而4nAT后代表現(xiàn)出母系偏向表達(dá)。在鯽鯉雜交魚的等比例異源染色體組遺傳模式中，源自不同原始親本且存在穩(wěn)定差異的減數(shù)分裂關(guān)鍵基因是否伴隨染色體組穩(wěn)定遺傳，以及雜合遺傳模式是否最終影響蛋白表達(dá)，均有待進(jìn)一步探究。Spo11和Mlh1是減數(shù)分裂的關(guān)鍵基因，其基因功能正常發(fā)揮對(duì)于減數(shù)分裂過程中染色體行為的變化具有重要意義。其中，Spo11（Meiotic protein covalently bound to DSB homolog）為減數(shù)分裂特異性的拓?fù)洚悩?gòu)酶，是減數(shù)分裂重組過程產(chǎn)生程序性DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，DSB）的直接效應(yīng)蛋白（Robert et al.，2016;蔣涵瑋等，2017;Lam et al.，2017）。目前，已在日本鰻鱺（Anguilla anguilla）（Ozakiy et al.，2006）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus ）（尚婉婧等，2016）、斑馬魚（Danio rerio）（Pasquier et al.，2016;Zhang et al.，2020）及貴州草海鯽魚（董然然等，2018）等硬骨魚類中開展了Spo11基因的相關(guān)研究，并證實(shí)該基因在不同物種生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用，也說明Spo11的生物功能在不同物種中相對(duì)保守。Mlh1（Human mutL homolog 1）基因是減數(shù)分裂過程中錯(cuò)配修復(fù)的關(guān)鍵基因，其位點(diǎn)的出現(xiàn)在時(shí)間、數(shù)量和位置上與預(yù)期染色體交叉位點(diǎn)一致，已廣泛應(yīng)用于斑馬魚等脊椎動(dòng)物的染色體重組和交叉研究（Feitsma et al.，2007），且其功能在不同物種中也非常保守。【本研究切入點(diǎn)】減數(shù)分裂是有性生殖物種世代交替的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，不僅維持基因組的穩(wěn)定性，還通過重組創(chuàng)造遺傳多樣性，因此開展減數(shù)分裂關(guān)鍵基因克隆及其功能分析，對(duì)揭示減數(shù)分裂的分子機(jī)制具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以鯽鯉雜交品系中的親代紅鯽（RCC）、湘江野鯉（CC）、鯽鯉雜交子代（異源二倍體鯽鯉）F1和4nAT等4種魚為研究對(duì)象，從cDNA序列水平研究Spo11基因和Mlh1基因在鯽鯉雜交魚中的遺傳規(guī)律和表達(dá)特征，并分析其與原始父母本間的關(guān)系，揭示異源雙親減數(shù)分裂因子在雜交品系的傳代中是否存在選擇壓力，為解析遠(yuǎn)緣雜交跨越生殖障礙打下遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的RCC、CC、F1和4nAT均由湖南師范大學(xué)省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，取健康魚體的精巢組織為試驗(yàn)材料。魚體解剖前使用2-苯氧乙醇（美國(guó)Sigma公司）進(jìn)行昏迷處理。

1. 2 基因編碼區(qū)（CDS）序列克隆及比對(duì)分析

4種魚均隨機(jī)各取3尾，采集精巢組織提取總RNA。提取的總RNA采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰即為合格的總RNA樣品，然后以反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622，Thermo Scientific公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。從NCBI上檢索并下載人類、小鼠、斑馬魚和鯉等物種Spo11基因和Mlh1基因的CDS序列，通過BioEdit v7.0.9.0比對(duì)合成相關(guān)的簡(jiǎn)并引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10.0 μL：cDNA模板1.0 μL，Mix（Taq）5.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃進(jìn)行延伸（各對(duì)引物的特定退火溫度和延伸時(shí)間見表1），進(jìn)行32個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切割目的片段進(jìn)行膠回收純化。將純化后的目的基因片段克隆至pMD18-T載體上，菌液PCR鑒定呈陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，并利用BioEdit v7.0.9.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源比對(duì)分析。

1. 3 Western blotting檢測(cè)

于每年4月（魚類繁殖季節(jié)）收集4種供試魚雄性個(gè)體的精巢組織，提取組織總蛋白，使用PierceTM BCA Protein Assay Kit（Cat. 23225，Pierce Chemical公司）提供的蛋白BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度，確保各樣本上樣量統(tǒng)一（30～50 μg），經(jīng)SDS-PAGE電泳后，使用半干式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，加入1∶1000稀釋的抗SPO11抗體（Abcam81695）或抗MLH1抗體（Abcam92312），4 ℃孵育過夜，1×PBST洗膜3次，加入1∶2000稀釋的羊抗兔IgG（AS014，Abclonal公司），室溫孵育1 h后以1×PBST洗膜3次，加入適量ECL發(fā)光液（A∶B=1∶1），然后置于暗室顯影拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 Spo11基因CDS序列克隆及測(cè)序分析結(jié)果

利用NCBI中的BLAST對(duì)測(cè)序分析獲得的4種魚Spo11基因CDS序列（表2）與已知斑馬魚Spo11基因CDS序列（NM_205682.1）進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果顯示其相似性均高于86.4%。同時(shí)比對(duì)分析原始親本（RCC和CC）與鯽鯉雜交魚（F1和4nAT）的Spo11基因CDS序列，旨在了解鯽鯉雜交魚Spo11基因CDS序列與原始親本間的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明，RCC、CC、F1和4nAT的Spo11基因CDS序列絕大部分為1152 bp，僅4nAT中存在1157 bp的CDS序列（圖1）。其中，RCC-Spo11基因和CC-Spo11基因間存在穩(wěn)定的差異，其CDS序列相似性為95.8%～96.0%，但RCC-Spo11基因CDS序列和CC-Spo11基因CDS序列在鯽鯉雜交魚中均穩(wěn)定存在，即F1和4nAT中既存在RCC-Spo11基因CDS序列（相似性為98.6%～99.3%），也存在CC-Spo11基因CDS序列（相似性為98.9%～99.8%）。值得注意的是，在F1和4nAT中均穩(wěn)定獲得2種原始親本的獨(dú)立遺傳片段，且在4nAT中還檢測(cè)到原始父母本重組基因片段[4n-SPO11-11-2（MT648223）]，其與原始母本RCC-Spo11基因?qū)?yīng)片段的相似性為96.2%，與原始父本CC-Spo11基因?qū)?yīng)片段的相似性為93.7%。每尾魚取可重復(fù)的代表性序列上傳，Spo11基因CDS序列的同源比對(duì)分析結(jié)果詳見表3。

2. 2 Mlh1基因CDS序列克隆及測(cè)序分析結(jié)果

Mlh1基因CDS序列相對(duì)穩(wěn)定且保守。將所獲得重復(fù)性高的代表性Mlh1基因CDS序列上傳至NCBI Bankit獲取相應(yīng)序列號(hào)（表4）。在原始親本（RCC和CC）中，能穩(wěn)定克隆獲得保守性非常高的Mlh1基因CDS序列，其中，RCC-Mlh1基因CDS序列為2175 bp，CC-Mlh1基因CDS序列為2172 bp。RCC-Mlh1基因CDS序列與CC-Mlh1基因CDS序列的最穩(wěn)定差異在于CC較RCC在CDS序列的1076～1086 bp中段位置多出TAGTTCCTC堿基序列，且其3'端結(jié)尾序列也存在穩(wěn)定差異，相似性僅為93.4%。此外，RCC-Mlh1基因CDS序列終止密碼子是TAG，而CC-Mlh1基因CDS序列終止密碼子為TGA。RCC-Mlh1基因CDS序列和CC-Mlh1基因CDS序列在鯽鯉雜交魚中同樣穩(wěn)定存在，即鯽鯉雜交魚（F1和4nAT）中既存在RCC-Mlh1基因CDS序列（相似性為99.5%），也存在CC-Mlh1基因CDS序列（相似性為99.4%），鯽鯉雜交魚相應(yīng)的遺傳片段和原始親本間僅存在極少的基因位點(diǎn)變異（圖2）。Mlh1基因CDS序列的同源比對(duì)分析結(jié)果詳見表5。

RCC和CC的Mlh1基因CDS序列分別編碼724和723個(gè)氨基酸殘基;F1和4nAT的RCC-Mlh1基因CDS序列均編碼724個(gè)氨基酸殘基，CC-Mlh1基因CDS序列均編碼723個(gè)氨基酸殘基。使用MegAlign對(duì)4種魚的Mlh1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖3所示。由于CC-Mlh1基因CDS序列在1076～1086 bp中段位置存在TAGTTCCTC堿基序列，而在RCC-Mlh1基因CDS序列中不存在TAGTTCCTC堿基序列，說明該片段位點(diǎn)翻譯表達(dá)出的蛋白序列也存在穩(wěn)定差異，RCC為X--X，而CC為SSSS（圖3中以紅色框標(biāo)識(shí)）。此外，RCC-Mlh1基因CDS序列結(jié)尾處的AAAAAGAAGAATAAAAAGGAATAG堿基序列與CC-Mlh1基因CDS序列結(jié)尾處的TTTGAAAG--AT GCTGA----------堿基序列也存在明顯差異，其翻譯表達(dá)出的蛋白序列在RCC中是TKKKNKKE，在CC中則為FEXXAX（圖3中以黃色框標(biāo)識(shí)）?？梢?，Mlh1基因表達(dá)在原始父母本中存在穩(wěn)定差異，且這種差異在鯽鯉雜交魚中穩(wěn)定遺傳。

2. 3 鯽鯉雜交魚精巢SPO11和MLH1蛋白的表達(dá)分析結(jié)果

通過Western blotting檢測(cè)4種魚精巢SPO11蛋白和MLH1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)RCC、CC、F1和4nAT等4種魚的精巢均能成功表達(dá)SPO11蛋白。已知SPO11蛋白存在2種剪接亞體形式（SPO11-α和SPO11-β）（蔣涵瑋等，2017）。由圖4可看出，RCC的精巢中同時(shí)表達(dá)2種蛋白亞體，且相對(duì)分子量較大的SPO11-β亞體表達(dá)量高于相對(duì)分子量較小的SPO11-α亞體;4nAT和CC的精巢中僅表達(dá)相對(duì)分子量較大的SPO11-β亞體（或同時(shí)表達(dá)極少量的SPO11-α亞體）;F1的精巢中僅表達(dá)相對(duì)分子量較小的SPO11-α亞體。此外，4種魚的精巢均能成功表達(dá)出MLH1蛋白，且MLH1蛋白相對(duì)表達(dá)量在4種魚間的差異較小，可能與所取精巢組織中含相關(guān)時(shí)期的初級(jí)精母細(xì)胞比例有關(guān)。

3 討論

Spo11和Mlh1都是減數(shù)分裂的關(guān)鍵基因，在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中相對(duì)較保守，其保障減數(shù)分裂正常進(jìn)行的功能對(duì)物種延續(xù)具有重要意義。近年來，針對(duì)Spo11和Mlh1等關(guān)鍵基因在模式生物減數(shù)分裂過程中的調(diào)控機(jī)制越來越深入。Spo11在減數(shù)分裂的染色體重組后可使著絲粒解離（Hou et al.，2021），并協(xié)同切割產(chǎn)生DNA斷裂（Johnson et al.，2021）;Mlh1關(guān)聯(lián)信號(hào)通路調(diào)控減數(shù)分裂同源染色體交叉的產(chǎn)生（Cannavo et al.，2020）。至今，有關(guān)魚類Spo11和Mlh1的研究主要是作為生殖細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)生的分子標(biāo)記，通過克隆、組織定位及基因編輯等探究相關(guān)因子在魚類中的進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特征（尚婉婧等，2016;Zhang et al.，2020）。遠(yuǎn)緣雜交魚需克服生殖障礙，其減數(shù)分裂關(guān)鍵基因能否正常表達(dá)是關(guān)鍵。因此，明確能越過生殖障礙的鯽鯉雜交魚減數(shù)分裂關(guān)鍵基因遺傳模式，有利于解析遠(yuǎn)緣雜交跨越減數(shù)分裂生殖障礙的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，為魚類遺傳育種提供重要的理論指導(dǎo)。

本研究結(jié)果表明，Spo11基因和Mlh1基因在鯽鯉雜交子代中能正常轉(zhuǎn)錄及翻譯出結(jié)構(gòu)和功能正常的蛋白，說明這2種基因在鯽鯉雜交魚中均能正常表達(dá)，由其控制的減數(shù)分裂重組和錯(cuò)配修復(fù)過程在遠(yuǎn)緣雜交魚中均能表達(dá)出相關(guān)蛋白，對(duì)保證SDB的形成至關(guān)重要（Blokhina et al.，2019）。這也為雜交魚生殖細(xì)胞最終能完成減數(shù)分裂及產(chǎn)生具有功能的配子奠定了重要基礎(chǔ)。從CDS序列的遺傳模式來看，Spo11基因和Mlh1基因均較保守，其共同特征是在雜交子代中穩(wěn)定獲得2種原始親本的獨(dú)立遺傳片段。對(duì)于Spo11基因而言，F(xiàn)1和4nAT既擁有原始母本RCC-Spo11基因片段，也擁有原始父本CC-Spo11基因片段;對(duì)于Mlh1基因而言，F(xiàn)1和4nAT既擁有原始母本RCC-Mlh1基因片段，也擁有原始父本CC-Mlh1基因片段。整體上，二者均保持了雜交魚遺傳物質(zhì)的異源穩(wěn)定性，且4nAT是F1多倍化后繁殖30代以上的子代，仍保持這個(gè)雜合遺傳的特性，與已報(bào)道雜交魚在染色體組水平保持異源穩(wěn)定性（Zhang et al.，2015）的結(jié)論一致。值得注意的是，在4nAT中發(fā)現(xiàn)重組型的Spo11基因遺傳片段，與尚婉婧等（2016）研究報(bào)道Spo11基因表達(dá)模式并非完全保守的結(jié)論一致，也暗示4nAT較F1存在更多的變異性（Wang et al.，2015;Ye et al.，2017a，2017b）。說明這2個(gè)保守功能基因的穩(wěn)定遺傳在雜交多倍化過程中能和諧共處，進(jìn)一步驗(yàn)證雜交多倍化后的異源穩(wěn)定性特征。在歷經(jīng)30余代以后的4nAT中檢測(cè)到Spo11基因的原始父母本重組基因片段[4n-SPO11-11-2（MT648233）]，表明異源多倍體的功能基因序列有交流和同化趨勢(shì)，但具體進(jìn)化方向還需在后續(xù)子代中進(jìn)一步驗(yàn)證。

鯽鯉雜交魚原始親本RCC和CC的Mlh1基因CDS序列穩(wěn)定差異在于CC較RCC在1076～1086 bp中段位置多出TAGTTCCTC堿基序列，且3'端結(jié)尾序列存在穩(wěn)定差異及終止密碼子不同，此序列位點(diǎn)翻譯表達(dá)出的蛋白序列也存在穩(wěn)定差異。這種雙親間存在一定差異，在雜交后代中獨(dú)立表達(dá)且最終并未影響蛋白功能的內(nèi)在表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步解析。在SPO11蛋白翻譯水平上，RCC的精巢中同時(shí)表達(dá)出2種蛋白亞體，且相對(duì)分子量較大的SPO11-β亞體表達(dá)量高于相對(duì)分子量較小的SPO11-α亞體;CC和4nAT的精巢中僅表達(dá)相對(duì)分子量較大的SPO11-β亞體;F1的精巢中僅表達(dá)相對(duì)分子量較小的SPO11-α亞體。SPO11-β亞體通過與其他因子互作，參與常染色體DSB的產(chǎn)生;而SPO11-α亞體不能與其他相關(guān)因子互作，主要負(fù)責(zé)性染色體DSB的產(chǎn)生。此外，在DSB產(chǎn)生后的修復(fù)過程中，SPO11蛋白最終被移除（蔣涵瑋等，2017）。綜上所述，F(xiàn)1的精巢中僅高表達(dá)相對(duì)分子量較小的SPO11-α亞體，可能與其生殖細(xì)胞暫時(shí)被阻滯在DSB產(chǎn)生后的修復(fù)階段，與SPO11-α亞體未被及時(shí)移除有關(guān);而4nAT由于已完成減數(shù)分裂形成大量精子，導(dǎo)致SPO11-α亞體表達(dá)水平較低。該結(jié)論為探討F1的生殖阻滯提供了重要參考依據(jù)。

4 結(jié)論

F1和4nAT能穩(wěn)定雜合遺傳原始親本RCC的Spo11基因和Mlh1基因，雖然在CDS序列結(jié)構(gòu)上存在少量差異，但最終都能獨(dú)立表達(dá)相關(guān)蛋白，即雜交魚形成過程中減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的表達(dá)正?？蔀槠淇缭缴痴系K打下分子基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2021-06-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31873038，31730098，U19A2040）;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-45）

通訊作者：張純（1980-），https：//orcid.org/0000-0002-9840-2205，博士，副教授，主要從事魚類遺傳育種研究工作，E-mail：zhang-chun421@163.com;劉少軍（1962-），https：//orcid.org/0000-0001-5761-8571，博士，教授，中國(guó)工程院院士，主要從事魚類繁殖與育種研究工作，E-mail：lsj@hunnu.edu.cn

第一作者：朱辣（1996-），https：//orcid.org/0000-0001-6072-5685，研究方向?yàn)轸~類遺傳育種，E-mail：2966071937@qq.com