2013—2019年我國流行性出血病病毒血清1型毒株的分離與遺傳特征分析

李卓然 吳健敏 朱建波 王金萍 呂敏娜 肖雷 楊振興 廖德芳 李華春 楊恒

李卓然（1985-），博士，主要從事動(dòng)物蟲媒病毒遺傳學(xué)及病毒免疫學(xué)研究工作。先后主持或參與國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)及云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目等科研項(xiàng)目8項(xiàng);現(xiàn)主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“藍(lán)舌病病毒抑制JAK-STAT通路內(nèi)I型干擾素信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究”和云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目“BTV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS4拮抗JAK-STAT通路內(nèi)IFN-I信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究”，并入選2020年云南省高層次人才培養(yǎng)支持計(jì)劃“青年拔尖人才”專項(xiàng)。以第一作者在《PNAS》《Emerging Infectious Diseases》《Veterinary Microbiology》《Virology Journal》《BMC Veterinary Research》《病毒學(xué)報(bào)》《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》等國內(nèi)外科技期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文10余篇。

摘要：【目的】掌握流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）血清1型毒株（EHDV-1）在我國南方地區(qū)的流行情況及其遺傳特征，為開展EHDV-1血清型特異性診斷、流行病學(xué)調(diào)查和致病性研究提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā?013—2019年通過在我國云南、廣東和廣西設(shè)立牛羊蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)和哨兵牛，定期采集哨兵牛血液樣本進(jìn)行蟲媒病毒分離;通過微量中和試驗(yàn)確定EHDV分離株的血清型，然后對EHDV分離株的部分基因節(jié)段（Seg-2、Seg-3和Seg-6）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、雙向測序及序列分析，并利用BioEdit計(jì)算EHDV基因組各節(jié)段核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的相似性。【結(jié)果】2013—2019年從云南、廣東及廣西的蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)共分離獲得33株EHDV，其中7株為EHDV-1型毒株。分離獲得的7株EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列高度同源，其平均相似性分別為（97.65±1.51）%、（94.87±4.72）%和（97.61±1.41）%，對應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列相似性平均為（97.69±1.36）%、（99.49±0.32）%和（97.51±2.47）%?；赟eg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均顯示，不同EHDV-1型毒株可劃分為東方（Eastern）和西方（Western）2種地域型，東方地域型毒株分離自中國、日本及澳大利亞，西方地域型毒株主要來源于美洲和非洲。在基于Seg-2核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，分離獲得的7株EHDV-1型毒株歸屬于西方地域型，且聚類形成一個(gè)相對獨(dú)立的進(jìn)化分支;在基于Seg-3核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，分離獲得的7株EHDV-1型毒株分屬2種地域亞型（Eastern-1和Eastern-2），分別與日本EHDV-1型和EHDV-6型毒株具有最近的親緣關(guān)系;在基于Seg-6核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，分離獲得的7株EHDV-1型毒株屬于東方地域型，與日本EHDV-1型毒株具有較近的親緣關(guān)系?！窘Y(jié)論】EHDV-1型毒株已在我國南方地區(qū)廣泛流行，其Seg-2和Seg-6序列分別具有最近的共有祖先病毒，而Seg-3序列來自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我國流行EHDV-1型毒株中的出現(xiàn)，說明西方地域型毒株在侵入我國后可能與本土流行的毒株發(fā)生重配，即我國流行EHDV-1型毒株為西方地域型與東方地域型的重配型毒株，為防范強(qiáng)致病性西方地域型毒株傳入我國而造成畜牧業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失提供了警示。

關(guān)鍵詞： 流行性出血病病毒（EHDV）;EHDV-1型;病毒分離;遺傳特征;重配

中圖分類號(hào)： S852.65 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）08-0000-10

Isolation and genetic characterization of epizootic hemorrhagic disease virus serotype 1 strains prevalent in

China from 2013 to 2019

LI Zhuo-ran1，WU Jian-min2，ZHU Jian-bo1，WANG Jin-ping1，LYU Min-na3，XIAO Lei1，YANG Zhen-xing1，LIAO De-fang1，LI Hua-chun1*，YANG Heng1*

（1Yunnan Academy of Animal and Veterinary Science/Yunnan Key Laboratory of Tropical and Subtropical Animal Virus， Kunming ?650224， China; 2Guangxi Veterinary Research Institute， Nanning ?530001， China; 3Institute of Animal Health， Guangdong Academy of Agricultural Science/Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health/Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Disease Prevention， Guangzhou ?510640， China）

Abstract：【Objective】Mastering the prevalence and genetic characteristics of epidemic hemorrhagic disease virus（EHDV） serotype 1 （EHDV-1） strains in southern China provides basis for developing EHDV-1 serotype specific diagnosis methods， epidemiology investigation and pathogenicity research. 【Method】Cattle and sheep arbovirus monitoring sites and sentinel cattle were set up in Yunnan， Guangdong and Guangxi from 2013 to 2019. Animal blood samples were collected regularly for arbovirus isolation. The serotypes of isolated EHDV strains were determined by neutralization test， and the genomic segments（Seg-2， Seg-3 and Seg-6） of the isolated EHDV strains were amplified using RT-PCR， bidirectionally sequenced and analyzed. BioEdit was used to calculate the identities of the nucleotide and deduced amino acid sequences.【Result】A total of 33 EHDV strains were isolated from sentinel animals between 2013 and 2019 in Yunnan， Guangdong and Guangxi， including 7 EHDV-1 strains. Sequence analysis showed that the Seg-2，Seg-3 and Seg-6 nucleotide sequences of EHDV-1 strains isolated from Yunnan，Guangdong and Guangxi sharedhigh similarty， with average sequence identities of （97.65±1.51）%， （94.87±4.72）% and （97.61±1.41）%， respectively. The average sequence identities of the corresponding deduced amino acid sequences were （97.69±1.36）%，（99.49±0.32）% and （97.51±2.47）%， respectively. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-2， Seg-3 and Seg-6 indicated that EHDV-1 strains could be divided into Eastern and Western topotypes. The Eastern topotype strains were usual-ly isolated from China， Japan and Australia， while the Western topotype strains mainly came from America and Africa. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-2 indicated that the 7 EHDV-1 strains belonged to the Western topotype and formed an independent evolutionary branch on the phylogenetic tree. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-3 indicated that the 7 EHDV-1 strains belonged to Eastern-1 and Eastern-2 sub-topotypes， and shared the closest relationship with Japanese EHDV-1 and EHDV-6 strains， respectively. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-6 indicated that the 7 EHDV-1 strains belonged to the Eastern topotype branch， and possessed the closest relationship with EHDV-1 strains isolated from Japan. 【Conclusion】The EHDV-1 strains are widely prevalent in southern China. Seg-2 and Seg-6 sequences of EHDV-1 strains prevalent in southern China had the most recent common ancestor， respectively， while Seg-3 comes from different ancestral viruses. The emergence of Western topotype Seg-2 in EHDV-1 strains isolated from China indicatesthat Western topotype strains have reassorted with the local epidemic EHDV-1 strains after invading China， suggesting that the EHDV-1 strains prevalent in China are reassortant strains of the Western and the Eastern topotypes. The study provides a warning to prevent the invasion of highly pathogenic Western topotype strains into China and causing severe economic losses in animal industry.

Key words： epidemic hemorrhagic disease virus（EHDV）; EHDV-1 serotype; virus isolation; sequence analysis; reassortment

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2017YFC1200505，2016YFD050 0908）;Special Project for Agro-scientific Research in the Public Interest of Ministry of Agriculture and Rural Affairs （201303035）;Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders Reserve Talents Training Project of Yunnan ?（2017HB055）

0 引言

【研究意義】流行性出血病病毒（Epizootic hae-morrhagic disease virus，EHDV）引起的動(dòng)物流行性出血?。‥pizootic haemorrhagic disease，EHD）是一種嚴(yán)重危害反芻動(dòng)物的蟲媒病毒病，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告的跨境動(dòng)物疫?。⊿avini et al.，2011;Rath，2018）。目前，我國南方地區(qū)廣泛流行的EHDV血清1型（EHDV-1）毒株的遺傳背景尚不清楚，阻礙了全國EHDV流行病學(xué)研究與防控工作的開展。因此，開展EHDV-1型毒株的分離、鑒定和遺傳特征分析，對掌握我國EHDV-1型毒株的流行情況及科學(xué)制定EHD防控策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】EHDV隸屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus），通過庫蠓（Culicoides spp.）叮咬進(jìn)行傳播，可感染牛、鹿及羊駝在內(nèi)的多種家養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物（楊俊興等，2009;Rath，2018）。EHDV基因組包含10個(gè)節(jié)段（Seg-1～Seg-10）雙鏈RNA（Savini et al.，2011），其外層衣殼由Seg-2和Seg-6編碼的VP2蛋白與VP5蛋白構(gòu)成，具有高度變異的特性，是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白，并決定著EHDV的血清型（Anthony et al.，2009b;Shirafuji et al.，2017）。參與構(gòu)成病毒內(nèi)層衣殼的VP3蛋白高度保守，但其編碼基因Seg-3存在一定差異，據(jù)此可將世界范圍的EHDV分為東方（Eastern）和西方（Western）2種地域型（Shirafuji et al.，2017;Anthony et al.，2009a）。至今，已發(fā)現(xiàn)9種血清型EHDV（EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8、EHDV-9和EHDV-10），不同血清型的地理分布區(qū)域不同，對動(dòng)物的致病性也存在明顯差異（Yadin et al.，2008;Sa-vini et al.，2011;Shirafuji et al.，2017;Brown-Joseph et al.，2019;Golender and Bumbarov，2019）。過去認(rèn)為，只有日本EHDV-2型的茨城病毒（Ibaraki virus，IBAV）能導(dǎo)致牛出現(xiàn)類似藍(lán)舌病的臨床癥狀，而其他血清型EHDV均為隱性感染，但近年來EHDV不僅呈全球性擴(kuò)散趨勢，EHDV-1、EHDV-6和EHDV-7型毒株還在亞洲、中東地區(qū)、南非及北美洲引起EHD暴發(fā)（Temizel et al.，2009;Golender and Bumbarov，2019）。EHDV-7型毒株曾導(dǎo)致以色列牛場5%～80%的奶牛發(fā)?。╕adin et al.，2008;Temizel et al.，2009;Golender et al.，2017;Brown-Joseph et al.，2019）。在我國，呂敏娜等（2017）首次在廣東省分離獲得EHDV-1型毒株;隨后，本課題組相繼在云南、廣東和廣西的哨兵牛中分離出EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株，并證實(shí)各血清型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列均屬東方地域型，與分離自日本或澳大利亞的毒株具有較近的親緣關(guān)系（李占鴻等，2019，2020;楊振興等，2019a，2019b，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，EHDV-1型毒株廣泛流行于我國南方地區(qū)，但目前僅有1株EHDV-1型毒株的相關(guān)報(bào)道（呂敏娜等，2017），因此亟待掌握EHDV-1型毒株在我國南方地區(qū)的流行特征及其遺傳背景?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過設(shè)立牛羊蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)和哨兵牛分離EHDV-1型毒株，并對其Seg-2、Seg-3和Seg-6序列進(jìn)行比對分析，旨在掌握EHDV-1型毒株在我國南方地區(qū)的流行情況及其遺傳特征，為開展EHDV-1血清型特異性診斷、流行病學(xué)調(diào)查和致病性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）和白紋伊蚊細(xì)胞（C6/36）由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供;EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-8型參考毒株由澳大利亞麥克阿瑟—伊麗莎白農(nóng)業(yè)研究所惠贈(zèng)，EHDV-10型毒株由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離獲得（李占鴻等，2019）;EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備提供。磁珠法病毒RNA抽提試劑盒、胎牛血清、Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）和Minimum Eagles medium（MEM）培養(yǎng)基購自Thermo公司，One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit試劑盒（Perfect Real Time）購自寶生物工程（大連）有限公司，HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit試劑盒（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，病毒DNA/RNA提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit及DNA膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已公布的EHDV-1型毒株基因組序列，利用Oligo 7.0設(shè)計(jì)3對引物（表1），用于EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為913、1095和1130 bp，引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 3 監(jiān)控動(dòng)物設(shè)立及血液樣本采集

2013—2019年，在云南師宗縣、江城縣和景洪市、廣東汕頭市及廣西馬山縣和合浦縣分別設(shè)立牛羊蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)（表2），篩選藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）和EHDV抗體檢測呈陰性、年齡在1周歲的牛作為哨兵動(dòng)物，共10頭。哨兵牛不使用任何疫苗和驅(qū)蟲藥物，采取白天放牧，夜間趕回欄舍的方式進(jìn)行飼養(yǎng)。每年5—10月，每周定期采集哨兵牛的全血、肝素鈉抗凝血及EDTA抗凝血等3種血液樣本，4 ℃冰盒保存，立即送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蟲媒病毒檢測與分離。

1. 4 病毒分離與鑒定

取50.0 μL采集自哨兵牛的EDTA抗凝血樣本，利用MagMax Express核酸自動(dòng)提取儀提取EHDV核酸，參照楊振興等（2019c）的方法對提取的核酸進(jìn)行檢測。取EHDV核酸檢測呈陽性的動(dòng)物血液樣本（肝素鈉抗凝血），離心收集紅細(xì)胞，加滅菌水進(jìn)行裂解。將裂解的紅細(xì)胞接種至BHK-21細(xì)胞或C6/36細(xì)胞，并在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)盲傳3～5代，直至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變（Cytopathic effect，CPE）。取200.0 μL出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)液，利用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取核酸，94 ℃變性3 min后立即冰浴;然后參照楊振興等（2019c）的方法，采用EHDV特異性實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對分離病毒再次進(jìn)行鑒定。

1. 5 微量中和試驗(yàn)

將待鑒定的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度的病毒培養(yǎng)液分別接種至96孔板（生長有單層BHK-21細(xì)胞），連續(xù)觀察，并以Karber法測定分離病毒的TCID50。參照“Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019”EHDV章節(jié)中的微量中和試驗(yàn)對EHDV分離株進(jìn)行血清型鑒定，具體操作步驟：將EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和EHDV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，取50.0 μL稀釋后的血清與含100個(gè)TCID50病毒的待鑒定病毒培養(yǎng)液等體積混合，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入100.0 μL密度為1.5×105 Cells/mL的BHK-21細(xì)胞;置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察是否出現(xiàn)CPE，并計(jì)算血清中和指數(shù)。當(dāng)陽性血清的中和指數(shù)大于75%則認(rèn)為待鑒定毒株能被該血清型的陽性血清中和。

1. 6 RT-PCR擴(kuò)增及雙向測序

使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取EHDV分離株核酸，94 ℃變性3 min后立即冰浴。取5.0 μL變性核酸為模板，使用表1中的引物對，通過一步法RT-PCR（楊振興等，2019d）擴(kuò)增EHDV分離株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列，RT-PCR反應(yīng)體系50.0 μL：One Step Enzyme Mix 2.5 μL，2×One Step Mix（Dye Plus）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，變性核酸模板5.0 μL，以無RNA酶水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳膠回收，以上、下游引物為測序引物，對純化的DNA片段進(jìn)行雙向測序。

1. 7 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAStar 6.0對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接和組裝，以MEGA 6.0對EHDV基因組各節(jié)段核苷酸序列進(jìn)行比對分析，并采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Tamura et al.，2013）。其中，Seg-2序列選擇“GTR+G”模型，Seg-3序列選擇“TN93+I”模型，而Seg-6序列選擇“GTR+G+I”模型;自舉檢驗(yàn)（Bootstrap）取值為1000。在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，其他國家和地區(qū)分離獲得的EHDV參考株序列以“GenBank序列號(hào)_EHDV-血清型_分離國家/地區(qū)_病毒分離時(shí)間”表示。同時(shí)利用Bio-Edit計(jì)算EHDV基因組各節(jié)段核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的相似性，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Average±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病毒分離與血清型鑒定結(jié)果

2013—2019年從云南、廣東及廣西的蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)共分離獲得33株EHDV（李占鴻等，2019，2020;楊振興等，2019a，2019b，2020），微量中和試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，僅有7株EHDV分離株能被EHDV-1型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，其中云南4株、廣東1株、廣西2株（表2）。

2. 2 EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6序列RT-PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果

采用設(shè)計(jì)的3對引物（表1）對分離獲得EHDV-1型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，分別特異性擴(kuò)增出大小約900、1000和1100 bp的目的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。利用BLAST對測序結(jié)果與GenBank已公布的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示成功獲得7株EHDV-1型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列。

2. 3 EHDV-1型毒株Seg-2序列分析結(jié)果

利用BioEdit計(jì)算Seg-2核苷酸序列及其推導(dǎo)VP2氨基酸序列的相似性，結(jié)果表明，分離獲得的7株EHDV-1型毒株Seg-2核苷酸序列相似性平均為（97.65±1.51）%，其推導(dǎo)VP2氨基酸序列相似性平均為（97.69±1.36）%（表3）;與世界范圍內(nèi)其他血清型EHDV的Seg-2核苷酸序列相似性在（46.63±0.05）%～（50.21±0.25）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP2氨基酸序列相似性在（32.81±1.02）%～（38.74±0.33）%?；赟eg-2核苷酸序列相似性，可將不同血清型EHDV劃分為4個(gè)群（Group A～Group D）（Anthony et al.，2009b;Shirafuji et al.，2017），所有EHDV-1型毒株均歸屬于Group C（圖1）。分離獲得的7株EHDV-1型毒株與美國、厄瓜多爾、尼日利亞及法國海外行政區(qū)（Guyane and Reunion Island）分離毒株構(gòu)成西方地域型，其Seg-2核苷酸序列相似性為（73.07±0.13）%～（73.86±1.64）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP2氨基酸序列相似性為（77.76±0.94）%～（78.01±0.64）%;與東方地域型（日本和澳大利亞）毒株的Seg-2核苷酸序列相似性僅為（69.66±0.21）%～（70.37±0.51）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP2氨基酸序列相似性為（69.47±0.41）%～（71.31±0.59）%（表3）。在基于Seg-2核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1）中，分離獲得的7株EHDV-1型毒株聚類形成一個(gè)相對獨(dú)立的進(jìn)化分支，表明我國EHDV-1型毒株雖然與西方地域型毒株具有更近的親緣關(guān)系，但在進(jìn)化上存在著相對獨(dú)立的起源。

2. 4 EHDV-1型毒株Seg-3序列分析結(jié)果

由表4可知，分離獲得的7株EHDV-1型毒株Seg-3核苷酸序列相似性平均為（94.87±4.72）%，其推導(dǎo)VP3氨基酸序列相似性平均為（99.49±0.32）%;與世界范圍內(nèi)其他血清型EHDV的Seg-3核苷酸序列相似性在（79.11±0.51）%～（92.43±1.90）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP3氨基酸序列相似性為（96.47±0.16）%～（99.57±0.16）%?；赟eg-3核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）顯示，不同血清型EHDV也可劃分為東方和西方2種地域型，分離獲得的7株EHDV-1型毒株與日本分離毒株均屬于東方地域型，其Seg-3核苷酸序列相似性平均為（94.17±2.66）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP3氨基酸序列相似性平均為（99.40±0.23）%;與西方地域型（美國和尼日利亞）毒株的Seg-3核苷酸序列相似性在（79.57±0.40）%～（79.90±0.26）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP3氨基酸序列相似性為（95.79±0.18）%～（96.47±0.16）%（表4）。此外，云南分離毒株和廣東分離毒株均屬于Eastern-2地域亞型，與來自日本的EHDV-1型毒株（LC202971）具有較近的親緣關(guān)系，其Seg-3核苷酸序列相似性為（97.72±0.30）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP3氨基酸序列相似性為（99.52±0.16）%;廣西分離毒株則屬Eastern-1地域亞型，與日本EHDV-6型毒株（LC320036）親緣關(guān)系最近，其Seg-3核苷酸序列相似性為97.80%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP3氨基酸序列相似性高達(dá)99.70%，表明我國EHDV-1型毒株的Seg-3序列可能來自不同的祖先病毒。

2. 5 EHDV-1型毒株Seg-6序列分析結(jié)果

由表5可知，分離獲得的7株EHDV-1型毒株Seg-6核苷酸序列相似性平均為（97.61±1.41）%，其推導(dǎo)VP5氨基酸序列相似性平均為（97.51±2.47）%;與世界范圍內(nèi)其他血清型EHDV的Seg-6核苷酸序列相似性在（59.3±0.73）%～（64.51±0.58）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP5氨基酸序列相似性在（57.13±1.67）%～（64.08±1.64）%?；赟eg-6核苷酸序列相似性，可將不同血清型EHDV劃分為4個(gè)群（Group A～Group D）（Anthony et al.，2009b;Shirafuji et al.，2017），所有EHDV-1型毒株均歸屬于Group C（圖3）。基于Seg-6核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，分離獲得的7株EHDV-1型毒株與日本分離毒株均屬于東方地域型，其Seg-6核苷酸序列相似性平均為（97.01±1.16）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP5氨基酸序列相似性平均為（98.49±1.87）%;與西方地域型（美國和尼日利亞）毒株的Seg-6核苷酸序列相似性為（80.30±0.90）%～（80.56±0.95）%，對應(yīng)的推導(dǎo)VP5氨基酸序列相似性為（93.79±1.66）%～（94.79±1.781）%（表3）。在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，分離獲得的7株EHDV-1毒株聚為一簇，表明我國EHDV-1型毒株的Seg-6序列可能來自共同的祖先病毒，且與日本分離毒株具有較近的親緣關(guān)系，而與美國及非洲分離毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

過去認(rèn)為只有屬于EHDV-2型的IBAV對牛具有較強(qiáng)致病性（Allison et al.，2010），但近年來發(fā)現(xiàn)EHDV-1、EHDV-6和EHDV-7型毒株在世界上多個(gè)國家和地區(qū)的牛群中引起EHD暴發(fā)（Temizel et al.，2009;Kamomae et al.，2018;Golender and Bumbarov，2019）。此外，隨著氣候變暖和蚊蟲媒介活動(dòng)范圍的擴(kuò)大，EHDV的流行區(qū)域呈逐步擴(kuò)散趨勢，不僅給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，還阻礙了家畜及畜產(chǎn)品的國際貿(mào)易（Kedmi et al.，2010;Yanase et al.，2020）。已有學(xué)者對我國流行EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株的遺傳特征進(jìn)行研究報(bào)道（李占鴻等，2019，2020;楊振興等，2019a，2019b，2020），但針對EHDV-1型毒株的報(bào)道僅呂敏娜等（2017）進(jìn)行分離鑒定，因此亟待掌握我國EHDV-1型毒株的流行情況，防控EHDV向高海拔、高緯度和高寒地區(qū)擴(kuò)散。本研究通過在我國云南、廣東和廣西設(shè)立牛羊蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)和哨兵牛，成功分離獲得7株EHDV-1型毒株，利用特異性引物分別擴(kuò)增7株EHDV-1型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列，并進(jìn)行測序和進(jìn)化分析。

本研究分離獲得7株EHDV-1型毒株的Seg-2核苷酸序列及其推導(dǎo)VP2氨基酸序列高度同源，在基于Seg-2核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，7株EHDV-1型毒株聚類形成一個(gè)獨(dú)特的中國進(jìn)化分支，提示我國EHDV-1型毒株的Seg-2序列可能來自共同的祖先病毒。雖然7株EHDV-1型毒株共同構(gòu)成中國進(jìn)化分支，但分離自廣西的2株病毒及分離自云南和廣東的5株病毒分別聚類為兩簇，說明我國流行EHDV-1型毒株的Seg-2序列在遺傳特征上存在一定地域差異。此外，分離獲得的7株EHDV-1型毒株與西方地域型毒株聚為一簇，而我國流行的EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株均為東方地域型（李占鴻等，2019，2020;楊振興等，2019a，2019b，2020），提示EHDV-1型毒株與我國流行的其他血清型EHDV的Seg-2序列起源不同，可能是西方地域型毒株早期侵入我國的結(jié)果，但在長期的進(jìn)化過程中又形成一個(gè)相對獨(dú)立的進(jìn)化分支。

基于Seg-3核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，分離自廣西的2株病毒與分離自云南和廣東的5株病毒分屬不同地域亞型（Eastern-1和Eas-tern-2），提示我國EHDV-1型毒株的Seg-3序列可能來自不同的祖先病毒。此外，我國EHDV-1型毒株的Seg-3和Seg-6序列均屬于東方地域型，且與日本分離毒株具有最近的親緣關(guān)系。我國流行EHDV-1型毒株的Seg-2序列均來源于西方地域型毒株，而Seg-3和Seg-6序列均為典型的東方地域型，說明西方地域型毒株在侵入我國后可能與本土流行的毒株發(fā)生重配，類似情況也存在于BTV重配毒株中（Nomikou et al.，2015）。可見，雖然我國EHDV-1型毒株與屬于西方地域型的EHDV-1型毒株分布區(qū)域相隔較遠(yuǎn)，但西方地域型的EHDV-1型毒株仍能侵入我國，給我國EHD的防控帶來巨大挑戰(zhàn)。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)與我國EHDV-1型毒株Seg-2序列親緣關(guān)系最近的西方地域型毒株，無法確定其祖先病毒，因此其來源及傳入時(shí)間和傳入途徑尚未明確。

4 結(jié)論

EHDV-1型毒株已在我國南方地區(qū)廣泛流行，其Seg-2和Seg-6序列分別具有最近的共有祖先病毒，而Seg-3序列來自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我國流行EHDV-1型毒株中的出現(xiàn)，說明西方地域型毒株在侵入我國后可能與本土流行的毒株發(fā)生重配，即我國流行的EHDV-1型毒株為西方地域型與東方地域型的重配型毒株，為防范強(qiáng)致病性西方地域型毒株傳入我國而造成畜牧業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失提供了警示。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-09-08

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1200505，2016YFD0500908）;農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303035）;云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2017HB055）

通訊作者：李華春（1958-），https：//orcid.org/0000-0002-4284-1049，博士，研究員，主要從事動(dòng)物蟲媒病毒研究工作，E-mail：Li_huachun@hotmail.com;楊恒（1978-），https：//orcid.org/0000-0002-6447-2985，博士，研究員，主要從事動(dòng)物蟲媒病毒研究工作，E-mail：yangheng2008.cool@163.com

第一作者：李卓然（1985-），https：//orcid.org/0000-0001-8183-723X，博士，主要從事動(dòng)物蟲媒病毒遺傳學(xué)及病毒免疫學(xué)研究工作，E-mail：lizhuoran85@126.com