聚合物納米粒子對(duì)毒素蛋白的抑制性能研究

高勝，李曉曉，魯希華

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

貧困地區(qū)的蛇咬傷問題一直難以攻克[1-2]。目前只能通過注射抗蛇毒血清治療[3]，但是抗蛇毒血清生產(chǎn)成本高，周期長(zhǎng)，且不易攜帶，在貧困地區(qū)施用困難[4-5]。因此需要一種廉價(jià)且有效的替代藥物。無毒共聚物納米粒子作為替代治療方案，逐漸顯示出優(yōu)勢(shì)[6-7]。通過在聚合物中摻入具有與靶標(biāo)大分子互補(bǔ)官能團(tuán)的單體，其可以與毒素蛋白大分子的多個(gè)表面位點(diǎn)相互作用，從而有效抑制靶標(biāo)的毒性[8-9]。且該納米粒子成本低，易合成，方便攜帶[10-11]。本文以尖吻蝮蛇毒蛋白為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，合成了多種含有不同官能團(tuán)的聚合物納米粒子，以篩選出對(duì)其具有良好抑制作用的粒子。為今后毒素蛋白的抑制研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨(APS)、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-環(huán)己基丙烯酰胺、N-(4-(三氟甲基)芐基)丙烯酰胺、N-苯乙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基苯丙氨酸、磷酸緩沖液、酪蛋白、血清、氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán)R250和分子量Mark、尖吻蝮蛇毒液干粉末均為分析純。

BI-200SM型動(dòng)態(tài)光散射儀；JEM-2100型透射電子顯微鏡；UV-1800型紫外分光光度計(jì)；164-5050型基礎(chǔ)電泳儀。

1.2 納米凝膠的制備

采用乳液聚合法制備納米凝膠NPs。將單體、交聯(lián)劑和乳化劑在超純水中混合至最終摩爾濃度為65 mmol/L，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌60 min脫氣。加入引發(fā)劑APS，并加熱至70 ℃反應(yīng)4 h。將反應(yīng)混合物暴露于空氣中，終止聚合。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中透析，除去反應(yīng)原料和乳化劑等[12]。

圖1 NPs合成示意圖Fig.1 The synthesis of the NPs

1.3 蛋白酶抑制實(shí)驗(yàn)

將納米凝膠濃縮，配制成5 mL凝膠溶液，加入1 mL粗蛇毒液，在37 ℃下溫育15 min。加入1%酪蛋白，在37 ℃下孵育24 h。添加750 μL 5%的三氯乙酸，以沉淀未被蛇毒水解的酪蛋白。在25 ℃下以5 000 r/min離心10 min。將上清液與NaOH(1∶1體積)混合，在340 nm處測(cè)量UV吸光度(A樣品)。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次。蛇毒抑制率0%和100%對(duì)照組的紫外數(shù)值分別為A空白和A對(duì)照。

抑制率(%)=[1-(A樣品-A空白)/(A對(duì)照-A空白)]×100%

1.4 納米凝膠的吸附選擇

取等體積納米凝膠與蛇毒在37 ℃下孵育 60 min。以10 000 r/min離心10 min。取出所有上清液，并連續(xù)4次用新鮮的磷酸鹽緩沖液替換上清液，直到上清液中的蛋白質(zhì)耗盡為止。納米顆粒沉淀中添加10 μL的2X加載染料和10 μL緩沖溶液進(jìn)行染色。同樣，向純蛇毒中加入10 μL 2X染料和10 μL緩沖液進(jìn)行染色。將染色的樣品在95 ℃下加熱10 min，以5 000 r/min離心5 min。通過SDS-PAGE進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，并對(duì)完成的凝膠拍照，以進(jìn)行進(jìn)一步的后續(xù)分析。

1.5 納米凝膠生物相容性實(shí)驗(yàn)

將人體纖維細(xì)胞離心分散于PBS中，并以每孔20 000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中。加入150 μL培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。離心沉淀，除去上清液，并用100 μL新鮮培養(yǎng)基代替。加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中溫育4 h。離心，將所有培養(yǎng)基替換為DMSO。在37 ℃溫育 20 min，通過酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米凝膠的合成

NPs與蛋白質(zhì)之間的相互作用非常復(fù)雜，涉及靜電作用、氫鍵作用、空間位阻和疏水作用等多種相互作用[14]。對(duì)于大多數(shù)NPs，它們與靶蛋白的相互作用與NPs中的單體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[15]。通過乳液聚合法合成并組建了一個(gè)丙烯酰胺基聚合物NPs庫，見表1。

表1 具有不同功能性單體的凝膠庫Table 1 Summary of NPs with various functional groups

使用單體包括N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸(AA)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)、N-叔丁基丙烯酰胺(TBA)、N-苯基丙烯酰胺(PAA)、N-環(huán)己基丙烯酰胺(HAA)、N-(4-(三氟甲基)芐基)丙烯酰胺(3FPAA)、N-苯乙基丙烯酰胺(PEAA)、N-丙烯?；奖彼?Aphe)，都含有不同的功能性官能團(tuán)(圖2)。這些單體對(duì)某些蛋白質(zhì)具有極好的親和力[9，16-17]。

圖2 不同單體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Monomers of the NP library

2.2 納米凝膠的表征

將透析純化好的共聚納米水凝膠用超純水稀釋后，使用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)觀察其尺寸和分散性，結(jié)果見表2。

表2 納米水凝膠的粒徑及分散性Table 2 Diameter and PDI of NPs with variousfunctional groups

由表2可知，所有NPs均顯示出良好的分散性(PDI <0.1)，平均動(dòng)力學(xué)直徑為80～100 nm。

使用透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米凝膠的形貌，以 NP 1-3 為例，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，合成的納米水凝膠呈球形，分散良好。

圖3 NP 1-3納米凝膠的TEM形貌圖Fig.3 TEM image of NP 1-3

2.3 納米凝膠的篩選

將NPs與蛇毒混合后,再與偶氮酪蛋白混合，測(cè)定NPs(6 mg/mL)對(duì)蛇毒(0.25 mg/mL)的抑制作用。該方法是定量分析和研究蛇毒抑制作用的最有效方法(圖4)，蛇毒中的蛋白水解酶通過破壞底物酪蛋白酶的肽鍵，使其裂解，并將其片段化為氨基酸，釋放的氨基酸可以被定量測(cè)定，并且蛇毒中的蛋白酶活性越高，分解的底物酪蛋白酶就越多。因此，可以使用定量分光光度法測(cè)定凝膠對(duì)蛇毒的抑制率，結(jié)果見圖5。

圖4 蛋白酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定步驟示意圖Fig.4 Protease assay used to analyze inhibition of enzymatic hydrolysis of Agkistrodon acutu to casein

圖5 不同NPs對(duì)尖吻蝮蛇毒的抑制實(shí)驗(yàn)Fig.5 Inhibition of Agkistrodon acutu venom by NPswith various functional groups

由圖5可知，帶有Aphe的NP 1-7對(duì)蛇毒的抑制作用高達(dá)80%，遠(yuǎn)高出其他NPs對(duì)蛇毒的抑制作用，單體Aphe的存在使得NPs對(duì)蛇毒的吸附抑制具有良好的正效應(yīng)。另外，NP 1-2 與NP 1-1相比，含有陰離子基團(tuán)的NP 1-2抑制率更高，驗(yàn)證了聚合物中陰離子存在的必要性；NP 1-2、 NP 1-3、 NP 1-4中含有單體的疏水性依次增大，三者對(duì)蛇毒的抑制作用也逐次增加，說明NPs保持一定的疏水性更有利于NPs-蛋白的吸附；NP 1-5和NP 1-6中含有的PEAA和3FPAA比NP 1-4的PAA分別多了一個(gè)乙基和碳氟基團(tuán)，但是兩者的蛇毒抑制率卻小于 NP 1-4，結(jié)構(gòu)中多含有的基團(tuán)對(duì)蛇毒的抑制并沒有促進(jìn)作用；最后，NP 1-5與NP 1-7含有完全相同的官能團(tuán)，但是兩者對(duì)蛇毒的抑制作用卻分別為20%和80%，差別很大，說明NPs與生物大分子相互作用時(shí)，正確的空間效應(yīng)也不可忽視。綜上可知，凝膠NP 1-7對(duì)尖吻蝮蛇毒的抑制作用最好。

2.4 NP 1-7的蛋白吸附實(shí)驗(yàn)

使用SDS-PAGE觀察尖吻蛇毒在NP 1-7上的親和吸附情況，在反復(fù)清洗和過濾毒液與NP 1-7的親和復(fù)合物后，對(duì)復(fù)合物進(jìn)行了電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6。NPs吸附的蛇毒蛋白顯示在吸附蛋白條帶中，在吸附條帶中有多個(gè)純蛇毒蛋白對(duì)應(yīng)的條帶(方框處)，證明了NP 1-7對(duì)蛇毒的吸附作用。

圖6 NP 1-7對(duì)尖吻蝮蛇毒的吸附電泳實(shí)驗(yàn)Fig.6 SDS-PAGE visualization of venom andstrongly bound proteins by NP 1-7

2.5 血清存在下NPs對(duì)蛇毒的抑制率

NPs在體內(nèi)的功效會(huì)受到NPs與血清中其他生物大分子非特異性相互作用的影響[18]?；?NIPAm 的納米材料可以在體內(nèi)迅速的吸附其他生物蛋白，獲得蛋白質(zhì)電暈，初始冠狀成分的很大一部分由高度豐富的血清蛋白質(zhì)白蛋白組成。為了確定血清和NPs之間的相互作用是否會(huì)阻礙凝膠對(duì)毒液蛋白的中和，在血清存在的環(huán)境中進(jìn)行NPs對(duì)蛇毒的抑制實(shí)驗(yàn)。將血清和NP 1-7孵育后，再與蛇毒進(jìn)行孵育，結(jié)果見圖7。

圖7 在不同的血清中NP 1-7(6 mg/mL)對(duì)蛇毒(0.25 mg/mL)的抑制作用Fig.7 Inhibition of venom (0.25 mg/mL) by NP 1-7(6 mg/mL) in variable serum

由圖7可知，血清與NP 1-7之間的相互作用對(duì)NPs的蛇毒中和作用產(chǎn)生了影響，與不存在血清相比，隨著體系中血清濃度的逐步增大，NP 1-7對(duì)蛇毒抑制作用從80%逐步降低到20%；但是在較低濃度血清下(<40 mg/mL)，NP 1-7對(duì)蛇毒的抑制作用在50%左右，仍然可觀，此時(shí)體系中的血清蛇毒含量比已經(jīng)高達(dá)160∶1。

2.6 血清存在下的吸附電泳實(shí)驗(yàn)

同樣在血清存在的環(huán)境下，使用SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)觀察NP 1-7對(duì)蛇毒的吸附情況，結(jié)果見圖8。左邊兩個(gè)條帶分別為對(duì)照蛇毒條帶和血清條帶，凝膠吸附條帶為血清存在下NP 1-7對(duì)蛇毒的吸附情況。

圖8 血清和蛇毒同時(shí)存在下的NP 1-7吸附實(shí)驗(yàn)圖Fig.8 NP 1-7 incubated in serum and venom fromAgkistrodon acutus venom

由圖8可知，在血清存在的環(huán)境下，NP 1-7吸附條帶上同樣可以看到純蛇毒所對(duì)應(yīng)的條帶(方框處)，這說明該凝膠在血清和蛇毒同時(shí)存在的情況下，對(duì)蛇毒蛋白仍具有一定的吸附作用。也證明了本實(shí)驗(yàn)中血清存在下的蛇毒抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.7 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估NPs的安全性和生物相容性，使用MTT法確定與NP 1-7共同培養(yǎng)后人體纖維細(xì)胞的存活率，結(jié)果見圖9。

圖9 細(xì)胞在不同濃度NP 1-7中的存活率Fig.9 Survival of cells after incubation withdifferent concentrations of NP 1-7

由圖9可知，將不同濃度的凝膠NP 1-7(125～1 000 μg/mL)與細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，細(xì)胞的存活率均可達(dá)到95%以上。說明NP 1-7具有良好的安全和生物相容性，有望在將來應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)或組織工程領(lǐng)域。

3 結(jié)論

(1)設(shè)計(jì)合成并組建了基于NIPAm的共聚物凝膠納米粒子庫，篩選對(duì)尖吻蝮蛇毒有抑制作用的粒子。DLS和TEM顯示，合成的多種納米凝膠分散性良好(PDI<0.1)；蛋白酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有Aphe單體的納米粒子NP 1-7對(duì)尖吻蝮蛇毒具有較好的抑制作用，抑制率高達(dá)80%。

(2)SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)證明了NP 1-7對(duì)蛇毒的吸附作用，即使在血清存在的環(huán)境下，凝膠poly(NIPAm-Aphe)對(duì)蛇毒仍然具有50%左右的吸附抑制作用。

(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明NP 1-7納米凝膠粒子無明顯毒性，細(xì)胞的存活率均可以達(dá)到95%以上，進(jìn)一步優(yōu)化的poly(NIPAm-Aphe)納米凝膠粒子有望應(yīng)用于人工合成抗體。