四君子湯含藥血清對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖及多胺調(diào)控NPM及p53表達(dá)的影響

涂小華，楊光勇，楊 欣，徐萌萌，鄧 穎，何光志，王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 1.機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，2.微生物教研室，貴州 貴陽 550025)

胃腸黏膜屏障對(duì)機(jī)體有很重要的保護(hù)作用，胃酸、非甾體類抗炎藥、氧化應(yīng)激、炎癥等均可引起胃腸黏膜損傷。黏膜損傷后，機(jī)體將啟動(dòng)黏膜快速修復(fù)過程，包括黏膜損傷早期修復(fù)(細(xì)胞遷移)，細(xì)胞增殖、黏膜重構(gòu)等過程，該過程受到多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控，多胺(包括腐胺、精脒及精胺)為其重要調(diào)控因素之一。眾多研究表明，不管是生理還是病理情況下，多胺對(duì)胃腸道黏膜生長(zhǎng)過程中是必不可少的，減少細(xì)胞內(nèi)多胺將抑制上皮細(xì)胞增殖并破壞上皮黏膜的完整性[1-2]。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)是一種細(xì)胞核仁的磷蛋白，對(duì)細(xì)胞增殖有重要的調(diào)控作用；p53基因主要調(diào)控細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡等過程；多胺可通過下調(diào)NPM及p53表達(dá)而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖[3-5]。

四君子湯為臨床常用方，源于宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草等比例組方，具有益氣健脾之功效，該方為臨床治療脾虛證的代表方劑。目前研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可調(diào)控多胺信號(hào)通路鈣離子上下游指標(biāo)而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞遷移[6-8]，可影響多胺及黏膜屏障相關(guān)蛋白而發(fā)揮防治胃腸黏膜損傷作用[9]。上皮細(xì)胞增殖是黏膜損傷后修復(fù)的重要環(huán)節(jié)之一，四君子湯可上調(diào)c-Myc而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖[10]，但其促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制尚未明確，本研究通過觀察四君子湯對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)多胺含量、多胺信號(hào)通路NPM、p53 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探討四君子湯促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為研究四君子湯修復(fù)胃腸黏膜損傷作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 IEC-6細(xì)胞(大鼠小腸上皮細(xì)胞)，購自上海中喬新舟生物科技有限公司(生產(chǎn)單位：美國Sciencell公司)，貨號(hào)：ZQ0783。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠20只，♀♂各半，體質(zhì)量(200±20)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11072622011001638，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均符合中國倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在避光、通風(fēng)環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度45%-50%，飼料由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于制備含藥血清。

1.1.3藥物及試劑 人參、茯苓、炒白術(shù)、炙甘草等實(shí)驗(yàn)用中藥材均購自北京同仁堂(貴陽分店)；胎牛血清(批號(hào)：1606F，澳大利亞Bovogen Biological公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(批號(hào)：20200211)，高糖DMEM(批號(hào)：20200310)，胰酶(批號(hào)：20191030)，均為賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；腐胺(putrescine，PUT，貨號(hào)：D13208-25G)，精脒(spermidine，SPD，貨號(hào)：S2626-1G)，均為美國sigma公司產(chǎn)品；α-二氟甲基鳥氨酸(α-Difluoromethylornithine，DFMO，貨號(hào)：288500-25MG-M，德國Calbiochem公司)，MTT(批號(hào)：1015D058)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：PC0020)，彩虹180廣譜蛋白Marker(批號(hào)：1120B021)，均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；RIPA裂解液(貨號(hào)：P0013B)，PMSF(貨號(hào)：ST506)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(貨號(hào)：P0012A)，5×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)：P0285)，均為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光液(貨號(hào)：1705060，美國 Bio-Rad公司)；β-actin一抗(貨號(hào)：4970S)，GAPDH一抗(貨號(hào)：5174S)，p53一抗(貨號(hào)：2524S)，NPM一抗(貨號(hào)：3542S)，均為美國CST公司產(chǎn)品；山羊抗兔二抗(批號(hào)：GR3321256-7，英國abcam公司)；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：9767)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：AJ92011A)，PCR熒光染料(批號(hào)：AJE1687A)，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.1.4主要儀器 RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；3111 CO2培養(yǎng)箱，Multiskan go酶標(biāo)儀，Nanodrop lite超微量紫外可見光分光光度計(jì)，Multifuge X1R離心機(jī)，均為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；N-EVAP-111氮吹儀(美國 Organomation公司)；ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，均為美國Agilent technologies公司產(chǎn)品；DMil倒置相差顯微鏡(德國徠卡公司)；TC-96/G/H(b)梯度PCR儀(杭州博日科技有限公司)；CFX96熒光定量PCR儀，Power PacTMBasic電泳儀，ChemicDocTMXRS+凝膠成像儀，均為美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1四君子湯含藥血清的制備 人參、茯苓、炙甘草、炒白術(shù)各75 g，藥材打粉(不宜過細(xì))，12倍量水浸泡2 h后文火煎煮提取2 h，紗布過濾，收集濾液；同法再煎煮1次；2次濾液合并后減壓濃縮至含生藥量為1 mg·L-1的四君子湯水提液。將SD大鼠隨機(jī)分為四君子湯組(灌胃四君子湯水提液，給藥劑量13 g生藥·kg-1·d-1)及空白組(灌胃等體積生理鹽水)，每組10只。每天灌胃2次，連續(xù)4 d，d 4一次性灌胃全天劑量，給藥2 h后乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血，血樣靜置2 h后，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，混勻同組血清，56 ℃滅活30 min，以0.22 μm 微孔濾膜過濾后分裝，得空白血清及四君子湯含藥血清，-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前以含0.5%胎牛血清的DMEM將空白血清稀釋成10%(體積分?jǐn)?shù))空白血清培養(yǎng)基，將SJZDS分別稀釋成5%、10%及20%四君子湯含藥血清培養(yǎng)基備用。

1.2.2IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 參照文獻(xiàn)方法[6]進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，IEC-6細(xì)胞以濃度為5×107個(gè)·L-1接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)基為5%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，參照文獻(xiàn)方法[11-12]加入無血清的DMEM血清饑餓24 h后，空白對(duì)照組每孔加入200 μL含10%空白血清培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入200 μL含PUT(終濃度10 μmol·L-1)的10%空白血清培養(yǎng)基，SJZDS低、中、高劑量組分別加入200 μL 5%、10%及20% SJZDS含藥血清培養(yǎng)基；DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，除空白對(duì)照組外，其余各組均在上述給藥方法基礎(chǔ)上加入2.5 mmol·L-1的DFMO，DFMO組加入含DFMO(終濃度2.5 mmol·L-1)的10%空白血清培養(yǎng)基；分別培養(yǎng)24、48及72 h，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)，37 ℃避光孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率/%=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。每組5-6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.3HPLC法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多胺(PUT及SPD)含量 IEC-6細(xì)胞以濃度為8×107個(gè)·L-1接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“1.2.2”(培養(yǎng)基體積為2.5 mL)，每組6個(gè)復(fù)孔，2個(gè)復(fù)孔合并為一個(gè)樣品；給藥24 h后，參照文獻(xiàn)方法[7]收集細(xì)胞內(nèi)多胺并將其衍生化，按其色譜條件檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PUT及SPD含量，多胺含量=細(xì)胞樣品中多胺含量(nmol)/細(xì)胞樣品中細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.4熒光定量PCR法檢測(cè)NPM及p53 mRNA表達(dá) IEC-6細(xì)胞以濃度為8×107個(gè)·L-1接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“1.2.2”(培養(yǎng)基體積為2.5 mL)；給藥培養(yǎng)48 h后，RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，立即檢測(cè)RNA純度及濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(去基因組DNA)將各組樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA樣品加入熒光染料及引物后，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：25 μL反應(yīng)體系，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算NPM及p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量。每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence for qPCR

1.2.5Western blot 法檢測(cè)NPM及p53蛋白表達(dá) IEC-6細(xì)胞以濃度為8×107個(gè)·L-1接種于6孔板，每孔2.5 mL，血清饑餓及給藥方法同“1.2.2”(培養(yǎng)基體積為2.5 mL)；給藥培養(yǎng)48 h后，刮取細(xì)胞并用RIPA裂解液(臨用前加PMSF)提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，蛋白樣品(加入上樣緩沖液)沸水浴5 min制備蛋白印跡上樣樣品并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結(jié)束后，將膠及PVDF膜制備“三明治”，放入電轉(zhuǎn)液中恒流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min；根據(jù)PVDF膜上的marker切膜，將膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h；分別用β-actin一抗，NPM一抗4 ℃孵育過夜(p53蛋白表達(dá)同法操作)，洗膜3次，加入山羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜3次；將PVDF膜浸沒在ECL發(fā)光液中5 min后置于Chemic DocTMXRS+成像儀上成像，以β-actin或GAPDH作為內(nèi)參，Image Lab軟件分析NPM，p53蛋白條帶灰度值。每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SJZDS對(duì)正?；駾FMO負(fù)荷下IEC-6細(xì)胞增殖的影響無負(fù)荷下實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Fig 1，與空白對(duì)照組比較，給藥24 h后，PUT及10%，20% SJZDS均可增加細(xì)胞增殖率(P<0.01)，給藥48 h、72 h后，PUT及5%、10%、20% SJZDS均可增加細(xì)胞增殖率(P<0.01)，提示SJZDS對(duì)正常小腸上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，其藥效與PUT相似。DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Fig 2，與空白對(duì)照組比較，給藥48、72 h后，多胺合成抑制劑DFMO可降低細(xì)胞增殖率(P<0.01)，表明多胺減少可抑制IEC-6細(xì)胞增殖；與DFMO組比較，給藥48 h后，PUT及5%、10%、20% SJZDS均可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的細(xì)胞增殖率降低(P<0.01)；給藥72 h后，PUT及10%、20% SJZDS均可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的細(xì)胞增殖率降低(P<0.01)，提示SJZDS可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖，該作用與影響多胺有關(guān)。

2.2 SJZDS對(duì)正?；駾FMO負(fù)荷下PUT及SPD含量的影響無負(fù)荷下實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 2及Fig 3，與空白對(duì)照組比較，PUT及5%、10%、20%SJZDS可提高PUT含量(P<0.01)，PUT及10%、20% SJZDS可增加SPD含量(P<0.05，P<0.01)，提示SJZDS可增加正常小腸上皮細(xì)胞內(nèi)PUT及SPD含量，其藥效與PUT相似。DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 3及Fig 4，與空白對(duì)照組比較，多胺合成抑制劑DFMO可降低PUT及SPD含量(P<0.01)，表明多胺合成抑制劑可降低細(xì)胞內(nèi)多胺含量；與DFMO組比較，PUT及10%、20% SJZDS可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的PUT及SPD含量的減少(P<0.01)，提示SJZDS可提高小腸上皮細(xì)胞內(nèi)多胺含量。

Tab 2 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and n=3)

Tab 3 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and SPD loaded by n=3)

Fig 1 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on **P<0.01 vs Control group

Fig 2 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on IEC-6 cell proliferation loaded by n=6)**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs DFMO group

Fig 3 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and n=3)

Fig 4 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on contents of cellular PUT and SPD loaded by n=3)

2.3 SJZDS對(duì)正?；駾FMO負(fù)荷下NPM mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 5結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，PUT，5%、10%、20% SJZDS均可降低NPM mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。Fig 6結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，DFMO可提高NPM mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.01)；與DFMO組比較，PUT，5%、10%、20% SJZDS可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的NPM mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。提示SJZDS可降低NPM mRNA及蛋白表達(dá)，且該作用與影響多胺有關(guān)。

2.4 SJZDS對(duì)正?；駾FMO負(fù)荷下p53 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 7結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，PUT，10%、20% SJZDS可降低p53 mRNA表達(dá)(P<0.01)，PUT，5%、10%、20% SJZDS可抑制p53蛋白表達(dá)(P<0.01)。Fig 8結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，DFMO可提高p53 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.01)；與DFMO組比較，PUT，5%、10%、20% SJZDS可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的p53 mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)。提示SJZDS可降低p53 mRNA及蛋白表達(dá)，且該作用與影響多胺有關(guān)。

Fig 5 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of NPM mRNA and n=3)1：Control;2：PUT;3：5%SJZDS;4：10%SJZDS;5：20%SJZDS；*P<0.01,**P<0.01 vs Control group

Fig 6 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of NPM mRNA and protein loaded by n=3)1：Control;2：5%SJZDS+DFMO;3：10%SJZDS+DFMO;4：20%SJZDS+DFMO;5：PUT+DFMO;6：DFMO；**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs DFMO group

Fig 7 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of p53 mRNA and n=3)1：Control;2：PUT;3：5%SJZDS;4：10%SJZDS;5：20%SJZDS；**P<0.01 vs Control group

Fig 8 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on expression of p53 mRNA and protein loaded by n=3)1：Control;2：5%SJZDS+DFMO;3：10%SJZDS+DFMO;4：20%SJZDS+DFMO;5：PUT+DFMO;6：DFMO；**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs DFMO group

3 討論

四君子湯為治療脾虛證的經(jīng)典方劑，臨床常用其加減方或結(jié)合其他藥物治療脾虛證相關(guān)的黏膜病變，該方可顯著改善患者的脾胃功能，緩解消化性潰瘍患者癥狀，促進(jìn)病灶愈合[13-14]。四君子湯上述功效的發(fā)揮與其修復(fù)胃腸黏膜損傷的作用有關(guān)。有研究表明，四君子湯可通過促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移而修復(fù)胃腸黏膜損傷，其作用機(jī)制與影響多胺信號(hào)通路有關(guān)[7]，該通路是維持胃腸黏膜完整性的重要信號(hào)通路之一。本研究從上皮細(xì)胞增殖角度探討四君子湯的作用機(jī)制，給藥24、48及72 h后，SJZDS可促進(jìn)正常小腸上皮細(xì)胞(非分化、非瘤性)增殖，該作用與文獻(xiàn)[10]結(jié)果相似；多胺合成抑制劑DFMO可阻斷鳥氨酸脫羧酶(多胺合成限速酶)活性，降低多胺的生物合成，DFMO對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，給藥48 h及72 h后，SJZDS可逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，表明四君子湯促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖的作用可能與影響多胺有關(guān)。為進(jìn)一步探討在細(xì)胞增殖過程中四君子湯與多胺信號(hào)通路的關(guān)系，本研究采用高效液相色譜法檢測(cè)給藥24 h后細(xì)胞內(nèi)多胺含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SJZDS可提高細(xì)胞內(nèi)PUT及SPD含量，且還可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的PUT及SPD含量的降低，進(jìn)一步表明四君子湯促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖作用與影響多胺有關(guān)。

在轉(zhuǎn)錄水平，p53蛋白對(duì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因有重要的調(diào)控作用，多胺對(duì)轉(zhuǎn)錄后p53基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，p53蛋白下調(diào)可促進(jìn)小腸黏膜生長(zhǎng)。多胺減少可穩(wěn)定p53 mRNA而提高p53 mRNA及蛋白的表達(dá)，此外，多胺合成減少還可抑制Mdm2的表達(dá)，減少M(fèi)dm2與p53復(fù)合物的形成而降低p53蛋白的降解，p53蛋白表達(dá)升高可提高細(xì)胞周期阻滯基因(如p21)轉(zhuǎn)錄而抑制上皮細(xì)胞增殖，最終抑制小腸黏膜的生長(zhǎng)[3,5,15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SJZDS不僅可降低p53 mRNA及蛋白表達(dá)，還可逆轉(zhuǎn)DFMO所致的p53 mRNA及蛋白表達(dá)升高，提示四君子湯可負(fù)調(diào)控p53 mRNA及蛋白的表達(dá)，該作用與影響多胺有關(guān)。NPM是一個(gè)多功能磷蛋白，具有組裝核糖體及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，通過與細(xì)胞內(nèi)不同蛋白結(jié)合而調(diào)控這些蛋白的活性。天然多胺類對(duì)小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)有重要調(diào)控作用。已有研究表明，NPM為小腸上皮細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子之一，多胺合成減少可提高NPM基因及蛋白表達(dá)，NPM與p53相互作用而增加NPM/p53復(fù)合物的形成，最終穩(wěn)定p53表達(dá)而抑制腸上皮細(xì)胞增殖。此外，靶向NPM的小分子干擾RNA抑制NPM表達(dá)后，p53蛋白穩(wěn)定性下降，最終抑制p21活性而促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SJZDS對(duì)NPM mRNA及蛋白表達(dá)具有抑制作用，且可逆轉(zhuǎn)多胺合成抑制劑DFMO所致的NPM mRNA及蛋白表達(dá)增加，提示四君子湯對(duì)NPM有負(fù)調(diào)控作用，該作用與影響多胺有關(guān)。

有研究采用HPLC-MS分析四君子湯水煎液及其含藥血清化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)四君子湯水煎液及其含藥血清中的有效成分主要來源于人參及甘草，人參主要以原型化學(xué)成分，甘草則以水解產(chǎn)物的形式存在于在血液中[16]。結(jié)合前期研究結(jié)果，四君子湯多糖可通過影響多胺而促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù)[7]，四君子湯多糖、人參及甘草的主要有效成分等可能是四君子湯促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有待進(jìn)一步明確。另有研究表明，甘草可通過影響HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，降低p21及p53 mRNA的穩(wěn)定性而促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖[17]。RNA結(jié)合蛋白HuR是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中的重要調(diào)節(jié)因子之一，對(duì)許多基因的mRNA穩(wěn)定性有調(diào)節(jié)作用，復(fù)方四君子湯下調(diào)p53 mRNA表達(dá)的作用是否與影響HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，降低p53 mRNA穩(wěn)定性有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，四君子湯可通過增加細(xì)胞內(nèi)多胺含量，下調(diào)生長(zhǎng)相關(guān)基因NPM及p53表達(dá)而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖；多胺合成抑制劑DFMO則降低細(xì)胞內(nèi)多胺含量，上調(diào)NPM及p53 mRNA及蛋白表達(dá)而抑制小腸上皮細(xì)胞增殖，四君子湯可逆轉(zhuǎn)DFMO的作用。結(jié)合前期研究表明，四君子湯可通過促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞遷移及細(xì)胞增殖而修復(fù)胃腸黏膜損傷，多胺信號(hào)通路為其作用靶點(diǎn)之一。后續(xù)考慮考察四君子湯對(duì)多胺信號(hào)通路NPM與p53相互作用及其他生長(zhǎng)相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并結(jié)合胃腸黏膜損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討四君子湯促進(jìn)胃腸黏膜上皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為研究四君子湯修復(fù)胃腸黏膜損傷作用提供參考。