基于生物信息學(xué)探討丹參酮ⅡA治療潰瘍性結(jié)腸炎及其機(jī)制

吳小倩，黃偉芳，孔德松，周偉康，樊志敏

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，整合醫(yī)學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院中醫(yī)藥現(xiàn)代化與大數(shù)據(jù)研究中心，3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院肛腸科，江蘇 南京 210001)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)最早出現(xiàn)于19世紀(jì)中期，是一種病因尚不明確的腸道的非特異性慢性炎癥病，其病程漫長且反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。目前對其仍沒有有效的治療手段，逐年上升的發(fā)病率和高達(dá)50%死亡率，讓其成為消化系統(tǒng)的主要疾病之一。已有很多研究指出，炎癥是腸道疾病誘發(fā)的基礎(chǔ)，如：炎性腸病、腸易激綜合征、結(jié)直腸癌等[2]。結(jié)腸黏膜屏障的受損、腸道菌群失調(diào)與炎癥方面之間也是相互作用的，腸黏膜屏障的破壞可導(dǎo)致微生物易位，誘發(fā)炎癥。腸道穩(wěn)態(tài)的破壞，又會(huì)導(dǎo)致不可控的腸黏膜反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞因子與氧自由基釋放，引發(fā)炎性因子風(fēng)暴[3]。因此，維護(hù)機(jī)體內(nèi)炎癥因子的平衡狀態(tài)，阻斷級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)是防治腸道疾病的重要策略。

丹參SalviamiltiorrhizaBge是傳統(tǒng)中藥，唇形科植物丹參的根及根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。在臨床研究中，丹參因其莖葉中豐富的酚酸類成分與丹參酮類成分已被證實(shí)具有抗炎作用[4]。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)在丹參中含量較高，是其主要有效成分之一，具有較強(qiáng)的生理活性和藥理作用，具有天然抗氧化、抗腫瘤、抗炎除菌和神經(jīng)保護(hù)等作用[5-6]。但是，目前對Tan ⅡA治療UC的作用機(jī)制研究較少，有待進(jìn)一步深入探究。考慮到中藥成分與其功能的復(fù)雜性，生物信息學(xué)為其確定靶標(biāo)和靶點(diǎn)提供了便捷。故本文先通過生物信息學(xué)，在分子的水平上，從靶點(diǎn)和信號(hào)傳導(dǎo)通路預(yù)測治療UC的可能性作用機(jī)制，再通過建立DSS小鼠模型，研究Tan ⅡA對UC的治療作用及其作用機(jī)制，為Tan ⅡA用于UC的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只C57BL/6J小鼠(20±2)g，雄性，SPF級(jí)，購于江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖中心(6-8周)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度(20-25)℃，濕度40%左右，每12 h明暗交替循環(huán)飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2 藥物與試劑丹參酮ⅡA(純度98%，上海純優(yōu)，貨號(hào)：P0019)；葡聚糖硫酸鈉(MW:36000-50000，MP Biomedicals，貨號(hào)：216011050)；糞便隱血試劑定性檢測試劑盒(雷根生物，貨號(hào)：TC0511)；ELISA試劑盒：TNF-α、IL-1β、IL-6(金霖生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：JL30030、JL30027、JL30044)；Abcam公司：兔多克隆抗體COX2(貨號(hào)：ab41762)；兔多克隆抗體INOS(貨號(hào)：ab15323)；兔多克隆抗體TNF-α(貨號(hào)：ab66579)；兔抗PPARγ多克隆抗體(貨號(hào)：ab41762)；兔抗p-IκBa單克隆抗體(貨號(hào)：ab32518)；鼠抗△9 dehydrogenase單克隆抗體(貨號(hào)：ab110330)；甲醛溶液、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、0.9%氯化鈉注射液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器電子天平(上海佑科公司)、顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(德國徠卡公司)、手動(dòng)切片機(jī)(美國Thermo公司)、包埋機(jī)(美國Thermo公司)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)、全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)、JJ-2B勻漿機(jī)(金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)、電熱恒溫水槽(上海銳析儀器設(shè)備有限公司)、Leica ASP300S全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1人群驗(yàn)證 運(yùn)用GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE95095數(shù)據(jù)集，下載UC基因組數(shù)據(jù)。24個(gè)患者的炎癥位置的腸道組織以及非炎癥的腸道組織，組成一一配對的48個(gè)腸道組織標(biāo)本，然后進(jìn)行差異基因表達(dá)強(qiáng)度檢測，篩選在組織中的差異性表達(dá)基因。再使用Limma線性擬合方式進(jìn)行配對樣本的炎癥過程的差異基因分析，以logFC與P值作為篩選條件，所篩選出的基因被視為明顯差異表達(dá)基因。

1.4.2靶點(diǎn)通路富集分析 DAVID數(shù)據(jù)庫是整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具的公開數(shù)據(jù)庫，可對基因和通路進(jìn)行功能注釋。對所有差異基因進(jìn)行GO與KEGG分析，GO富集分析是對差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行細(xì)胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)這3個(gè)方面分析。KEGG通路富集分析，是闡明DEGs的基因功能和參與的細(xì)胞信號(hào)通路，然后以FDR法(FDR<0.05)對P值進(jìn)行了測試和校正，最終設(shè)定閾值P<0.05，獲得具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路。并以上述通路中的預(yù)測靶標(biāo)、作用通路聯(lián)系Tan ⅡA的抗炎作用，構(gòu)建可行性通路。

1.5 小鼠藥效實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1造模與給藥 參考文獻(xiàn)[7]，隨機(jī)抽取50只雄性小鼠C57BL/6J，分為5組：正常對照組(Normal)、模型組(Model)、Tan ⅡA低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組自由飲水，其余各組飲水為4%的葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液，飲水和造模劑每2天更換一次，以防變質(zhì)，保持清潔。正常組和模型組腹腔注射等體積的0.5% CMC-Na溶液，Tan ⅡA組腹腔注射低劑量組20 mg·kg-1、中劑量40 mg·kg-1、高劑量組60 mg·kg-1，從造模d 1開始連續(xù)7 d給藥，每天1次。

1.5.2一般情況與疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的觀測[8]造模期間每天監(jiān)測食物與水的攝入、體質(zhì)量、小鼠精神情況、有無死亡、觀察大便性狀(腹瀉、稀便、血便)并進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評分，DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù))/3。小鼠結(jié)腸炎DAI具體評分標(biāo)準(zhǔn)見Tab 1。

Tab 1 DAI scoring criteria

1.5.3取材 造模開始后d 8，末次給藥后禁食不禁水12 h，頸椎脫臼法處死小鼠，摘取眼球法取血，將收集了血液的EP管置于冰上，靜置2 h以上，4 ℃，1 500 r·min-1，離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。從回盲腸交界處到直腸遠(yuǎn)端區(qū)域解剖其結(jié)腸，PBS沖洗去除糞便，分離出完整的結(jié)腸。取相同部位10%福爾馬林溶液固定，其余組織-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4蘇木精-伊紅染色(HE)病理觀察 用10%甲醛固定，48 h后，石蠟包埋、切片4 μm，60 ℃烘烤1 h，脫蠟至水：二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)各10 min，梯度乙醇脫水各5 min；雙蒸水沖洗10 min；蘇木素染色2-3 min，流水沖洗多余染料，鹽酸酒精分化數(shù)秒后流水沖洗，伊紅染色2 min，蒸餾水稍洗、上行梯度酒精脫水各1-2 min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)透明各2 min；封片、鏡檢，觀察小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)變化并評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照Obermeier等[9]制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.5ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子 血液離心取上清液檢測，將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板中并按說明書加入相應(yīng)試劑，37 ℃孵育30 min，拍板、洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，再同樣操作，加入顯色液，37 ℃避光顯色15 min。加入終止液，于15 min內(nèi)450 mm波長測量各孔OD值并處理數(shù)據(jù)。

1.5.6免疫組化檢測 NF-κB和PPARγ 取病變結(jié)腸組織，用4%多聚甲醛固定。石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌?？乖迯?fù)后加入一抗，孵育后加入二抗，用DAB染色、脫水、透明等方法干燥、密封切片。根據(jù)組織切片進(jìn)行組織學(xué)評分。

1.5.7Western blot檢測結(jié)腸Δ9去飽和脫氫酶、PPARγ和IκBα的表達(dá) 取結(jié)腸組織，于冰上剪碎，加入RIPA裂解液，提取蛋白后離心取上清，采用BCA蛋白定量法測定各樣本蛋白濃度，調(diào)整各樣本蛋白濃度煮沸變性，電泳1.5-2 h，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，接著加入封閉液室溫封閉60 min，加入對應(yīng)稀釋好的一抗、二抗。一抗根據(jù)說明書比例稀釋，4 ℃孵育過夜，TBS洗膜后加入稀釋好的二抗37 ℃搖床1 h，再TBS洗膜，最后加ECL顯影、定影、掃描。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 UC患者差異基因分析Limma線性擬合方式，進(jìn)行配對樣本的炎癥過程的差異基因分析，比較得出數(shù)據(jù)中炎癥組與非炎癥組明顯影響和改變的差異表達(dá)基因共有170個(gè)，分別對炎癥組與非炎癥組數(shù)據(jù)進(jìn)行GEO2R分析，以|log2FC|>1以及FDR<0.05為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，其中l(wèi)ogFC≥1.5代表基因表達(dá)上調(diào)，logFC≤-1.5代表基因表達(dá)下調(diào)，結(jié)果其中有109個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，30個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，根據(jù)所篩選出的差異基因作火山圖(Fig 1)。其中紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，綠代表基因表達(dá)下調(diào)。

Fig 1 Volcano map of DRGs

2.2 GO富集分析和KEGG通路分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析。可得GO富集分析分為3類：CC、MF和BP。其主要富集的CC是細(xì)胞頂端、頂端質(zhì)膜、基地側(cè)膜、血小板α顆粒等區(qū)；分子功能是參與有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、基質(zhì)組織、血管發(fā)育的正向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。將基因GO本體條目按P值進(jìn)行排序，分別選取CC、MF和BP的前10繪制氣泡圖(Fig 2A-C)。Pathway分析靶點(diǎn)基因主要富集參與到的5條最關(guān)鍵的信號(hào)通路(P<0.005))分別為蛋白質(zhì)的消化與吸收途徑、視黃醇途徑、PI3K-Akt通路、青少年后期糖尿病醇途徑與與亞油酸途徑(Fig 3)。

Fig 2 Bubble chart of GO function analysisA:Cell composition;B:Molecular function;C:Biological process.

Fig 3 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.3 小鼠一般狀態(tài)的影響建立DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型，進(jìn)行初步研究評估Tan ⅡA對UC小鼠的治療作用。實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組小鼠體重增加、飲食大便均正常。其余各組小鼠在飲用4% DSS后，造模組小鼠3 d后出現(xiàn)精神不振、體質(zhì)量下降，d 4普遍出現(xiàn)稀便、肉眼血便。Tan ⅡA給藥組從d 4開始也出現(xiàn)精神不佳、食欲下降、稀便，但各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比較好。如Tab 2所示，與對照組相比，模型組的DAI評分為(3.41±0.52)明顯上升(P<0.001)。給藥之后，Tan ⅡA各組的DAI評分分別為3.27±0.45、2.9±0.24和2.45±0.28明顯低于模型組(P<0.05)，Tan ⅡA高劑量組與低、中劑量相比評分更低，說明Tan ⅡA對UC小鼠具有一定的治療作用。

Tab 2 Score of disease activity index in each

2.4 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察通過HE染色進(jìn)一步分析Tan ⅡA對小鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)改變的影響。正常組對照組小鼠結(jié)腸上皮屏障完整，腺體排列規(guī)則，未見水腫、潰瘍，無炎癥細(xì)胞浸潤，隱窩結(jié)構(gòu)完整。與正常對照組相比，模型組炎癥累及腸壁全層，上皮破壞、結(jié)構(gòu)不清，隱窩消失，單核、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。Tan ⅡA治療后呈劑量依賴性地減輕DSS誘導(dǎo)的病理改變(Fig 4A)。此外，組織學(xué)分析顯示Tan ⅡA改善了結(jié)腸黏膜的損傷，評分均低于模型組(Fig 4B)。

Fig 4 Effect of Tan ⅡA on pathological morphology of colon tissues in UC mice (× 200)A:HE staining (× 200).B:Histopathological score of colon in IBD mice by Tan ⅡA.##P<0.01 vs Normal；**P<0.01vs Model.

2.5 對結(jié)腸炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的水平。結(jié)果如Fig 5所示，正常對照組小鼠血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均值分別為467、203、65 ng·L-1，模型組各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯上升,分別

達(dá)到了711、248和121 ng·L-1，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，Tan ⅡA給藥后TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯降低，且與低劑量組相比，高劑量組下降趨勢更為明顯。表明Tan ⅡA對DSS誘導(dǎo)的小鼠UC具有一定的改善作用，能減少促炎細(xì)胞因子的釋放且具有劑量依賴性。

2.6 對小鼠結(jié)腸組織的免疫調(diào)控機(jī)制的影響NF-κB p65在正常組織中無或者表達(dá)低，在UC活動(dòng)期表達(dá)較高。如Fig 6A所示，無活性時(shí)NF-κB p65一般表達(dá)于胞質(zhì)中，有活性后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。與正常對照組相比，模型組結(jié)腸組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)量高，Tan ⅡA給藥組表達(dá)量較模型組低，高劑量細(xì)胞核中數(shù)量尤為明顯。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，空白對照組、模型組和Tan ⅡA給藥組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB之間的表達(dá)差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig 6B)。使用Western blot方法檢測了各組小鼠結(jié)腸組織中的IκBα磷酸化(p-IκBα)的蛋白的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)如Fig 7所示，與正常對照組相比，模型組p-IκBα的表達(dá)量明顯增加，Tan ⅡA治療后p-IκBα表達(dá)量下降，表明Tan ⅡA可抑制NF-κB信號(hào)通路激活，從而起到抗炎作用。

Fig 5 Effect of Tan ⅡA on TNF-α,IL-1β and IL-6 in serum of UC mice#P<0.05，##P<0.01 vs Normal；*P<0.05，**P<0.01 vs Model.

有報(bào)道顯示，在飲食中添加CLA可以預(yù)防腸道炎癥，所以我們用Western blot方法檢測了結(jié)腸組織中的Δ9去飽和脫氫酶，在體內(nèi)CLA可通過Δ9脫氫酶由內(nèi)源途徑產(chǎn)生[7]，結(jié)果如Fig 7所示，隨著Tan ⅡA給藥量的增加，Δ9去飽和脫氫酶的表達(dá)增加，說明了Tan ⅡA含量越多，CLA的含量也隨之上升。CLA誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡又屬于PPARγ依懶型[10]，在CLA刺激下，PPARγ能夠誘導(dǎo)抗炎基因的轉(zhuǎn)錄[11]。我們接著對UC小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行PPARγ免疫組化方法，PPARγ在正常組織中表達(dá)含量低或者無，有活性時(shí)主要表達(dá)于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，并與病變的嚴(yán)重度相關(guān)，炎癥越重，表達(dá)量越低。反之，相反。結(jié)果如Fig 6所示，在空白對照組中PPARγ表達(dá)量高，模型組結(jié)腸組織細(xì)胞核中PPARγ表達(dá)量低，Tan ⅡA給藥組表達(dá)量較模型組高，且高劑量細(xì)胞核中數(shù)量尤為明顯。Fig 7結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中的PPARγ的蛋白水平明顯降低，給藥低、中、高組PPARγ的蛋白水平上升，高劑量組較為明顯。說明對NF-κB信號(hào)通路的作用可能是由通過CLA與PPARγ介導(dǎo)的。

Fig 6 Effect of Tan ⅡA on NF-κB activation and PPARγ expression in colonic tissues of UC mice#P<0.05 vs Normal；*P<0.05，**P<0.01 vs Model.

Fig 7 Effect of Tan ⅡA on expression of Δ9 dehydrogenase and PPARγ protein in colon tissues of UC miceA:The band diagram detected by Western blot.B:Comparison of the gray value of Western blot results,with β-actin as the internal reference.##P<0.01 vs Normal；*P<0.05，**P<0.001 vs Model.

3 討論

UC是一種自身免疫性疾病，病因尚未明確，目前多認(rèn)為與遺傳、感染、免疫失調(diào)、環(huán)境等因素相關(guān)?；谂cUC相關(guān)的途徑與調(diào)節(jié)的靶標(biāo)，我們先從GEO數(shù)據(jù)庫下載UC患者的表達(dá)數(shù)據(jù)庫GSE95095，利用GPL14951進(jìn)行差異基因表達(dá)強(qiáng)度檢測，然后對差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)了這些靶基因主要富集的通路，并且這些通路都有可能參與了抑制炎癥調(diào)控。近年來，對于細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K-Akt在腸道炎癥反應(yīng)過程發(fā)揮的作用研究較多，但亞油酸對腸道炎癥反應(yīng)的有益作用報(bào)道較少，所以我們基于上面的生物信息學(xué)探討CLA與宿主抗炎機(jī)制之間的關(guān)系。

CLA的同分異構(gòu)體有20多種，通過對免疫細(xì)胞、免疫細(xì)胞因子、免疫應(yīng)答和過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ途徑的影響調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，從而延緩動(dòng)物以及人類機(jī)體免疫力的衰退[12]。研究發(fā)現(xiàn)，CLA誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡屬于PPARγ依賴型。CLA能增加脂肪細(xì)胞、骨骼肌、結(jié)腸黏膜和巨噬細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)和活性[13]。CLA對促炎癥細(xì)胞因子的調(diào)控與活化型的核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ有關(guān)，PPARγ在抑制炎癥因子生成方面起很重要的作用[14-15]。在UC中，PPARγ可以通過抑制誘導(dǎo)抑制因子IκB激酶的產(chǎn)生抑制NF-κB活性，進(jìn)而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，減輕UC炎癥反應(yīng)。CLA與PPARγ的配體過氧化物酶體增殖物的生理特性結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)生理特性都比較相似，這有可能是CLA激活PPARγ實(shí)現(xiàn)抗炎機(jī)制的關(guān)鍵因素。所以，探索CLA與PPARγ介導(dǎo)的調(diào)控下游NF-κB信號(hào)通路為靶點(diǎn)的治療藥物，將為UC治療提供新思路與方法。

本研究采用4%的DSS法建立的UC小鼠模型，觀察不同劑量的Tan ⅡA對于小鼠一般狀態(tài)、炎癥因子及腸道黏膜損傷的改善作用，以及是否可以通過CLA和PPARγ介導(dǎo)的抗炎機(jī)制調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)Tan ⅡA確實(shí)緩解了小鼠體質(zhì)量減輕、糞便出血等情況，結(jié)腸組織病理切片表現(xiàn)出Tan ⅡA對于DSS小鼠可保護(hù)結(jié)腸黏膜、減少炎性細(xì)胞浸潤。驗(yàn)證了Tan ⅡA確實(shí)可以改善小鼠UC狀況。接著，我們進(jìn)一步探討了Tan ⅡA在結(jié)腸細(xì)胞中CLA激活PPARγ實(shí)現(xiàn)抗炎途徑所涉及的機(jī)制。與正常對照組相比，模型組CLA和PPARγ蛋白表達(dá)量下降，p-IκBα蛋白表達(dá)明顯升高，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平也高于正常組，但治療7 d后，Tan ⅡA處理將其趨勢逆轉(zhuǎn)，CLA和PPARγ蛋白表達(dá)量上升，p-IκBα、TNF-α、IL-6、IL-1β水平下降，有明顯差異(P<0.05)。

據(jù)此，本研究可以推斷Tan ⅡA對DSS誘導(dǎo)的UC疾病具有保護(hù)作用，且其作用機(jī)制可能與CLA激活PPARγ基因，阻斷下游NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，上調(diào)腸黏膜屏障保護(hù)因子的蛋白表達(dá)有關(guān)。本課題組接下來將通過體外實(shí)驗(yàn)和代謝組學(xué)對其藥效與通路機(jī)制做進(jìn)一步研究，證明其有效性，為開發(fā)新藥提供安全、有效的藥理學(xué)證據(jù)。