杜鵑花總黃酮對(duì)急性腦缺血/再灌注損傷大鼠STIM-Orai調(diào)控的G蛋白偶聯(lián)SOCE通路的影響

赫玉香,陸嘉珺,王書(shū)凡,姜晨晨,施 磊,尹秀云,陳 卓,曹 迪,沈?qū)W彬,韓 軍

(國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽省皖南地區(qū)植物藥活性物質(zhì)篩選與再評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，皖南醫(yī)學(xué)院藥物研發(fā)中心，藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

缺血性腦卒中是一種常見(jiàn)的腦血管疾病，是世界上第二大死亡原因。由于腦血管突然阻塞，限制了對(duì)腦組織相關(guān)區(qū)域的血液供應(yīng)，從而對(duì)人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響?？焖僭俟嘧⒖勺畲蟪潭鹊販p少腦組織的結(jié)構(gòu)和功能損傷，是最有效的缺血治療方法之一。然而，腦血流的恢復(fù)也會(huì)導(dǎo)致再灌注損傷。因此，深入研究缺血性腦卒中損傷修復(fù)機(jī)制對(duì)腦功能的重建具有十分重要的意義。

研究表明，Ca2+內(nèi)流可導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，破壞離子平衡，而缺血性損傷引起的神經(jīng)元內(nèi)鈣超載，可導(dǎo)致不可逆性的細(xì)胞損傷[1]。其中G蛋白偶聯(lián)鈣庫(kù)操作性鈣離子通道(store-operated calcium entry，SOCE)是介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要通道之一,其核心蛋白由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule，STIM)和鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子(calcium release-activated calcium modulator，Orai)構(gòu)成[2]。在急性缺血損傷中，STIM2基因敲除后，H9c2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放減少，線粒體鈣超載減輕[3]。在暴露于全腦缺血大鼠的海馬中，STIM1和Orai1表達(dá)的增加被認(rèn)為是導(dǎo)致過(guò)度鈣內(nèi)流的最主要原因，SOCE通路代表了缺血性神經(jīng)元死亡的一個(gè)重要的非興奮性毒性機(jī)制[4]。

杜鵑花總黃酮(total flavones ofRhododendronsimsiiPlanch，TFR)是從中藥杜鵑花中提取的黃酮類(lèi)有效部位，其主要成分為金絲桃苷、蘆丁、映山紅素等黃酮化合物[5]。研究表明[6]，TFR可以舒張大鼠的基底動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈，改善腦血液循環(huán)。我們課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)[5]，TFR對(duì)全腦缺血/再灌注大鼠腦損傷具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與TFR作用于腦基底動(dòng)脈，激活瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族4通道(transient receptor potential vanilloid channel 4，TRPV4)，繼而激活小電導(dǎo)鈣激活鉀通道與中電導(dǎo)鈣激活鉀通道，阻滯Ca2+內(nèi)流，促使腦基底動(dòng)脈舒張有關(guān)。盡管SOCE與腦缺血性損傷有關(guān)，但TFR改善大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠腦損傷是否與SOCE通路有關(guān)，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大腦中動(dòng)脈閉塞建立局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，探究TFR減輕大鼠急性腦缺血/再灌注損傷與STIM-Orai調(diào)控的G蛋白偶聯(lián)SOCE通路之間的關(guān)系，將有助于對(duì)缺血性腦卒中機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，為其防治提供新的思路和候選藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑TFR購(gòu)自上海源葉生物科技科技有限公司(批號(hào)：A0276)；2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-APB，批號(hào)：D9754)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；IL-1檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：E08055r)、IL-6檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：E04640r)及TNF-α檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：E11987r)均購(gòu)自Cusabio公司；STIM1抗體(批號(hào)：ab108994)、STIM2抗體(批號(hào)：ab59342)、Orai1抗體(批號(hào)：ab175040)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)抗體(批號(hào)：ab179463)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；GAPDH(批號(hào)：AF7021)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)抗體(批號(hào)：AF7022)購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào)：K1621)、PowerUp SYBR Green Master Mix(批號(hào)：A25742)均購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2 儀器腦定位儀(美國(guó)哈弗公司)；ST8R高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher科技公司)；Model 550酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；生理檢測(cè)儀(美國(guó)哈弗公司)；Mini PROTEAN電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；逆轉(zhuǎn)錄PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Mini PROTEAN轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(美國(guó)ABI公司)。

1.3 動(dòng)物成年雄性SD大鼠(280-320)g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。許可證號(hào)為SCXK(蘇)2017-0001。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將大鼠飼養(yǎng)在塑料籠子中，控制環(huán)境，溫度：(23±2)℃，濕度：60%±5%，模擬12 h交替光暗周期。所有動(dòng)物均可獲得標(biāo)準(zhǔn)飲食和自由飲水。

1.4 分組與給藥將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組，分別是Sham組、MCAO組、TFR(100 mg·kg-1)組、TFR(100 mg·kg-1)+2-APB(2.5 mg·kg-1)組、2-APB(2.5 mg·kg-1)組，每組各8只。Longa評(píng)分1-3分納入實(shí)驗(yàn)，除Sham、MCAO組大鼠給予生理鹽水灌胃外，TFR(100 mg·kg-1)采用術(shù)后立即尾靜脈注射給藥，2-APB(2.5 mg·kg-1)術(shù)前30 min腹腔注射給藥。

1.5 模型建立及改良Longa評(píng)分[7]大鼠用3 %戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈分叉處上方約4 mm處切開(kāi)頸外動(dòng)脈。通過(guò)殘端將4.0單絲尼龍栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈直到產(chǎn)生阻力。2 h后取出，結(jié)扎切口，Sham組不阻斷血流。24 h后按改良Longa評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分：0，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1，提起尾巴，左前爪緊貼胸口處；2，向左轉(zhuǎn)圈；3，向左倒下；4，意識(shí)低迷，不能自主行走；5，死亡。評(píng)分1-3分為造模成功。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量的變化分組同1.4，再灌注24 h后，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血置于采血管中，37 ℃烘箱中靜置30 min，離心(4 ℃，10 min)，吸取上清液置于EP管中，-80 ℃保存。嚴(yán)格按照IL-1、IL-6及TNF-α試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.7 HE染色檢測(cè)大鼠缺血腦組織的病理變化分組同1.4，再灌注24 h后，處死大鼠，取腦組織在4%多聚甲醛中固定、脫水、二甲苯清洗、石蠟包埋、切片(5 μm厚)。脫蠟、染色、0.3%鹽酸分化、氨水稀釋、0.5%曙紅溶液復(fù)染。顯微鏡下觀察大鼠腦組織的病理變化。

1.8 TTC染色法檢測(cè)大鼠大腦梗死面積分組同1.4，再灌注24 h后，以3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后處死大鼠，取腦組織在-20 ℃下冷凍20 min后作冠狀切片。之后在1% TTC中，37 ℃避光染色30 min，4%多聚甲醛溶液固定。在光學(xué)顯微鏡下拍攝圖像。梗死面積的比例/%=梗死面積(淺色區(qū))/橫切面總面積×100%。

1.9 Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3及PKB蛋白表達(dá)水平用蛋白裂解緩沖液提取約100 mg腦組織梗死側(cè)的總蛋白。12 000 r·min-1離心15 min后，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度。以10 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉2 h，加入STIM1(1 ∶3 000)、STIM2(1 ∶400)、Orai1(1 ∶200)、caspase-3(1 ∶1 000)及PKB(1 ∶10 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。再用相應(yīng)的二抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)量條帶信號(hào)的強(qiáng)度，并用軟件Image J 1.43進(jìn)行密度分析。

1.10 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腦組織中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3及PKB mRNA表達(dá)水平用TRIzol從大鼠腦組織梗死側(cè)提取總RNA，微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)純化和定量RNA，取約2 μg總RNA合成cDNA。每組選取的均是梗死側(cè)相同部位的腦組織。然后用PowerUp SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。RT反應(yīng)在95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s下進(jìn)行，共40個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參。相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法分析。引物為：GAPDH正向：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′ 反向：5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′；STIM1正向：5′-CACCAACACCACCATGACAG-3′；反向：5′-TGCTCCTTGGAGTAACGGTT-3′；STIM2正向：5′-CAAGTTGCCCTGCGCTTTAT-3′ 反向：5′-ATTCACTTTTGCACGCACCG-3′；Orai1正向：5′-TGGCCGTGCACCTGTTC-3′ 反向：5′-TTGCTCACAGCCTCGATGTT-3′；caspase-3正向：5′-ATGTCGATGCAGCTAACC-3′ 反向：5′-GTCTCAATACCGCAGTCC-3′ ；PKB正向：5′-CGCCGCCTGATCAAGATGAC-3′ 反向：5′-TCTGGCCTCAAATCGGATGA-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果以改良Longa評(píng)分為基礎(chǔ)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)定，結(jié)果如Tab 1所示，與Sham組相比，MCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與MCAO組相比，TFR組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降(P<0.05)；與TFR組或2-APB組相比，TFR+2-APB組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 1 Comparison of neurological function scores of rats in each

2.2 TFR及SOCE通道抑制劑對(duì)MCAO大鼠血清IL-1、IL-6及TNF-α含量的影響如Fig 1所示，與Sham組相比，MCAO組大鼠血清IL-1、IL-6及TNF-α含量明顯升高(P<0.01)。而TFR組大鼠血清IL-1、IL-6及TNF-α含量明顯低于MCAO組(P<0.01)。與TFR組或2-APB組相比，TFR+2-APB組IL-1、IL-6及TNF-α的含量明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Effects of TFR and SOCE channel inhibitor on contents of IL-1，IL-6 and TNF-α in serum of MCAO **P<0.01 vs Sham;##P<0.01 vs MCAO;&P<0.05，&&P<0.01 vs TFR;$$P<0.01 vs 2-APB

2.3 HE染色觀察MCAO大鼠腦組織的病理變化結(jié)果如Fig 2顯示，Sham組大鼠腦組織細(xì)胞排列規(guī)則，核仁清晰，而MCAO組形態(tài)不規(guī)則，炎性浸潤(rùn)，表現(xiàn)為空泡形成、核溶解、細(xì)胞壞死。與MCAO組相比，TFR組大鼠腦組織仍有神經(jīng)元固縮，但梗死側(cè)細(xì)胞壞死明顯減少；與TFR組或2-APB組相比，TFR+2-APB組大鼠腦組織病理學(xué)損傷得到進(jìn)一步改善。

Fig 2 Effects of TFR and SOCE channel inhibitor on pathological changes of brain tissue in MCAO rats(HE staining，×400)A:Sham;B:MCAO;C:TFR;D:TFR+2-APB;E:2-APB

2.4 TTC染色觀察TFR及SOCE通道抑制劑對(duì)大鼠腦組織梗死面積的影響如Fig 3、4顯示，與Sham組比較，MCAO組大鼠腦組織出現(xiàn)大量梗死灶(P<0.01)。與MCAO組相比，TFR組大鼠腦組織梗死灶明顯減少，腦梗死率明顯降低(P<0.01)；與TFR組或2-APB組相比，TFR+2-APB組大鼠腦梗死灶進(jìn)一步減少，腦梗死率進(jìn)一步降低(P<0.05)。

Fig 3 Photographs of brain sections with TTC stainingA:Sham;B:MCAO;C:TFR;D:TFR+2-APB;E:2-APB

Fig 4 Effects of TFR and SOCE channel inhibitor on cerebral infarction in MCAO **P<0.01 vs Sham;##P<0.01 vs MCAO;&P<0.05 vs TFR;$$P<0.01 vs 2-APB

2.5 TFR及SOCE通道抑制劑對(duì)MCAO大鼠腦組織中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3、PKB蛋白表達(dá)水平的影響如Fig 5所示，與Sham組相比，MCAO組大鼠腦組織STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，PKB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；TFR組相較于MCAO組STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，PKB蛋白明顯上調(diào)(P<0.05)；與TFR組或2-APB組相比，TFR+2-APB組STIM1、STIM2、Orai1及caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，PKB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

Fig 5 Effects of TFR and SOCE channel inhibitor on expression of STIM1，STIM2，Orai1，caspase-3 and PKB protein in brain of MCAO 1:Sham;2:MCAO;3:TFR;4:TFR+2-APB;5:2-APB;**P<0.01 vs Sham;#P<0.05，##P<0.01 vs MCAO;&P<0.05，&&P<0.01 vs TFR;$$P<0.01 vs 2-APB

Fig 6 Effects of TFR and SOCE channel inhibitor on expression of STIM1，STIM2， Orai1，caspase-3 and PKB mRNA in brain of MCAO **P<0.01 vs Sham;#P<0.05,##P<0.01 vs MCAO;&P<0.05 vs TFR;$P<0.05，$$P<0.01 vs 2-APB

2.6 TFR及SOCE通道抑制劑對(duì)MCAO大鼠腦組織中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3、PKB mRNA表達(dá)水平的影響如Fig 6所示，與Sham組相比，MCAO組腦組織STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，PKB mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；TFR組相較于MCAO組腦組織STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，PKB mRNA明顯升高(P<0.05)；與TFR組或2-APB組相比，TFR+2-APB組腦組織STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，PKB mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

3 討論

卒中是造成全球成年人永久殘疾的最常見(jiàn)原因之一，可能會(huì)導(dǎo)致視覺(jué)、感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)行為障礙。盡管組織型纖溶酶原激活劑已被批準(zhǔn)用于卒中治療20多年，但很少有卒中患者真正得到根本性治愈[8]。因此，研究腦卒中的病理分子機(jī)制與篩選出具有神經(jīng)保護(hù)作用的新型抗腦卒中藥物已成為現(xiàn)代中醫(yī)藥的重要課題之一。TFR是一種黃酮類(lèi)化合物，本課題組前期研究表明，TFR具有減輕腦水腫、舒張血管、增加腦血流量等抗缺血性腦卒中作用[5]。

腦缺血可引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而產(chǎn)生更多的細(xì)胞毒物質(zhì)，包括IL-1、IL-6、TNF-α和其他促炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[9]。研究表明，無(wú)論何種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+水平下降而引起細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的方式被稱(chēng)為SOCE[10]。SOCE可以利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+耗竭作為激活信號(hào)，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，以響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放。并且導(dǎo)致缺血/缺氧性神經(jīng)元死亡的主要機(jī)制之一是鈣超載[11]。2-APB是G蛋白偶聯(lián)SOCE通路特異性阻斷劑[12]。本課題組研究結(jié)果顯示，用藥TFR后，原本升高的MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及血清中IL-1、IL-6及TNF-α含量明顯降低，腦組織病理?yè)p傷明顯改善，核溶解減輕，梗死灶明顯減少，腦梗死率明顯降低。而聯(lián)用SOCE抑制劑2-APB阻斷SOCE信號(hào)通路后，MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及血清中上述生化指標(biāo)進(jìn)一步降低，腦組織損傷進(jìn)一步得到改善。表明，TFR與SOCE通道抑制劑2APB聯(lián)用可以有效改善大鼠神經(jīng)功能損傷，減少炎癥因子的釋放，進(jìn)而保護(hù)受損神經(jīng)元。

研究發(fā)現(xiàn)，SOCE通路由STIM和Orai共同介導(dǎo)[2]。目前已知STIM蛋白存在STIM1和STIM2兩種亞型。Orai有三種異構(gòu)體，即Orai1、Orai2和Orai3，它們形成介導(dǎo)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的通道[10]。研究表明，與野生型小鼠相比，STIM1-/-和Orai1-/-骨髓嵌合體在MCAO誘導(dǎo)后24 h的梗死體積均明顯減小[13]。而STIM2的上調(diào)引發(fā)了SOCE的增加，線粒體Ca2+超載[14]。在短暫MCAO模型中，用SOCE特異性阻滯劑2APB預(yù)處理可減輕野生型小鼠的腦損傷，與Orai1-/-骨髓嵌合體小鼠相似[12]。STIM1、STIM2、Orai1與缺血性腦損傷密切相關(guān)，而Orai2和Orai3尚不清楚[15-16]。PKB能夠影響細(xì)胞的存活、增殖和抑制細(xì)胞的凋亡,以維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能。caspase-3作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，它的激活預(yù)示著細(xì)胞的死亡。為了進(jìn)一步研究TFR減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷作用與SOCE信號(hào)通路之間的關(guān)系。我們通過(guò)Western blot和RT-qPCR分別觀察了TFR對(duì)大鼠腦組織中SOCE信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子STIM1、STIM2、Orai1的蛋白與mRNA表達(dá)及caspase-3、PKB的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MCAO組相較于Sham組，大鼠腦組織中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3的蛋白及mRNA表達(dá)均明顯升高，PKB的蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，此結(jié)果與Lang等[17]報(bào)道基本一致。而用藥TFR后，TFR明顯下調(diào)了大鼠腦組織中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3的蛋白及mRNA表達(dá)，上調(diào)了PKB的蛋白及mRNA表達(dá)。而聯(lián)用2-APB后，STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3的基因表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，PKB的基因表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。表明，TFR與SOCE通道特異性阻斷劑2-APB聯(lián)用可增強(qiáng)抑制SOCE通道基因表達(dá)的作用。提示，TFR減輕MCAO大鼠缺血/再灌注腦損傷的作用可能與其抑制腦組織SOCE信號(hào)通道，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活有關(guān)。

綜上，在急性腦缺血損傷發(fā)生時(shí)，TFR可能通過(guò)抑制腦組織SOCE信號(hào)通路，降低鈣超載，減少炎癥介質(zhì)釋放和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，從而發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。鑒于中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)理多為多靶點(diǎn)、多通道、多層次，結(jié)合課題組前期研究成果[18]，我們推測(cè)，TRPV4通道、SOCE信號(hào)通路或一些其他信號(hào)通路可能均參與了TFR減輕MCAO大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，其深入的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。