羥基紅花黃色素A通過激活自噬抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移

崔清卓，劉博宇，李穎云，鄭玉光 ，安勝軍，劉 玉，李愛英，趙京山,

(1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心,2.河北中醫(yī)學(xué)院科技處，3.河北省心腦血管病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050200)

動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、PTCA術(shù)后血管再狹窄等心血管疾病是威脅人類健康的頭號(hào)殺手，致死率高，現(xiàn)已呈年輕化趨勢(shì)[1]，發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。心血管疾病有相似的病理基礎(chǔ)—血管重構(gòu)，又稱為血管重構(gòu)性疾病，常表現(xiàn)為血管壁細(xì)胞異?；罨?、增殖及遷移。通常動(dòng)脈粥樣斑塊出現(xiàn)在血管內(nèi)膜，造成血管內(nèi)膜狹窄，引發(fā)一系列病變，故一般認(rèn)為血管病變“從內(nèi)膜開始”，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)血管外膜也在血管病變中發(fā)揮著重要作用，有觀點(diǎn)認(rèn)為血管病變“由外而內(nèi)”發(fā)生[2]。血管外膜成分復(fù)雜，包括成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)是血管外膜中最主要的細(xì)胞成分，對(duì)血管損傷最早做出反應(yīng)，表現(xiàn)為異?；罨?，通過分泌多種細(xì)胞因子，如成纖維特異性因子1、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶1等參與血管重構(gòu)，促進(jìn)內(nèi)膜增生，甚至遷移至血管內(nèi)膜，直接參與血管重構(gòu)[3-4]。抑制VAFs遷移有望成為治療血管重構(gòu)性疾病的新靶點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)自噬與心血管疾病密切相關(guān)，研究顯示自噬激活抑制內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞增殖、遷移進(jìn)而改善動(dòng)脈粥樣硬化[5]，然而自噬激活對(duì)血管外膜成纖維細(xì)胞遷移的作用未見報(bào)道。

心血管疾病如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，在中醫(yī)中屬于胸痹的范疇，是心脈痹阻所致，臨床常用活血化瘀藥治療。而紅花是常用的活血化瘀藥之一。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是藥典規(guī)定鑒定紅花的標(biāo)志物，是其活血化瘀的主要有效成分，在臨床治療心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[6-7]，研究顯示HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠VAFs增殖和膠原合成有抑制作用[8]。本實(shí)驗(yàn)主要探討HSYA是否通過調(diào)控自噬抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移作用，為臨床新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量160 g左右，購買于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)編號(hào)：IP07187。

1.1.2藥品與試劑 羥基紅花黃色素A(S26799，上海源葉生物科技有限公司)；angiotensin Ⅱ(A9290-10，北京索萊寶公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(01447，美國Gibco公司)；胎牛血清(20050405，杭州四季青生物科技有限公司)；CCK-8溶液(SB-CCK8S，上海圣爾生物有限公司)；MDC染色試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；GAPDH兔抗大鼠抗體(ab8245，英國Abcam公司)；α-SMA兔抗大鼠抗體(CY5295，Abway抗體公司)；Vimentin兔抗大鼠抗體(CY5134，Abways抗體公司)；LC3(00084321，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；Beclin1兔抗大鼠抗體(00073614，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；p62兔抗大鼠抗體(00069958，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；IgG(H+L)HRP羊抗兔抗體(ab0101,Abway抗體公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(311，賽默飛世爾科技有限公司)、酶標(biāo)儀(VICTOR Nivo，德國Perkln Elmer公司)；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(ECLIPSE Ts2，日本Nikon公司)；高速離心機(jī)購于Eppendorf(Germany)公司；電泳、電轉(zhuǎn)膜儀(1645050，美國Bio-Lad公司)；多功能成像系統(tǒng)(Fusion FX5 Spectra，法國Vilber公司)；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1貼塊法培養(yǎng) VAFs 25%烏拉坦麻醉SD大鼠(腹腔注射給藥：10 μL·g-1)，使用高壓滅菌的手術(shù)器械在無菌條件下剪去皮毛，逐層開腹，剪取胸主動(dòng)脈，PBS清洗干凈后，浸泡于培養(yǎng)基中，顯微器械剪去周圍脂肪組織及結(jié)締組織剝凈血管，縱向剖開，洗去血管內(nèi)殘留血跡，彎鑷輕輕刮去內(nèi)膜及中膜，將血管外膜剪成約1 mm2的小塊貼于無菌培養(yǎng)皿中，待組織塊貼牢且不能干透時(shí)，加入15%胎牛血清培養(yǎng)基(85% DMEM/F12培養(yǎng)基+15%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素混合物)，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3 d即可爬出細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)90%以上，去除組織塊，采用胰酶消化法進(jìn)行傳代，選用第3代第6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光鑒定VAFs 將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔鋪于提前放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清，用PBS清洗兩遍；加入0.25%Triton X 100，孵育5 min進(jìn)行細(xì)胞打孔；PBS搖洗3遍，每次5 min；山羊血清封閉液37 ℃孵育30 min；兔抗鼠Vimentin、α-SMA抗體(1 ∶200)分別37 ℃孵育1 h；PBS搖洗3遍，每次5 min；驢抗兔CY3熒光抗體37 ℃避光孵育30 min；PBS搖洗3遍，每次5 min；用含DAPI的抗淬滅封片劑封片；于倒置熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.2.3CCK-8法建立Ang Ⅱ 量效和時(shí)效曲線 將細(xì)胞以3 000個(gè)/孔鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁，長勢(shì)穩(wěn)定后，饑餓培養(yǎng)12 h，設(shè)置不同濃度梯度的Ang Ⅱ(0、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置空白對(duì)照組(即不加細(xì)胞的溶劑對(duì)照組)，各組加入100 μL含對(duì)應(yīng)濃度Ang Ⅱ的培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，依據(jù)CCK-8試劑盒說明書，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀中測(cè)490 nm處吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞活力(cell viability)。

細(xì)胞活力=(A給藥組-A空白組)/(A正常組-A空白組)

將細(xì)胞以3 000個(gè)/孔鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁，長勢(shì)穩(wěn)定后，饑餓培養(yǎng)12 h，采用含有量效曲線所確定最佳Ang Ⅱ濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置不同時(shí)間梯度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置空白對(duì)照組，分別于0、12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，于490 nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4CCK-8法建立HSYA量效和時(shí)效曲線 將細(xì)胞以3 000個(gè)/孔鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁，長勢(shì)穩(wěn)定后，饑餓培養(yǎng)12 h，設(shè)置不同濃度梯度的HSYA(0、5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置空白對(duì)照組(即不加細(xì)胞的溶劑對(duì)照組)，各組加入100 μL含不同濃度HSYA的含藥培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀中測(cè)490 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

將細(xì)胞以3 000個(gè)/孔鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，饑餓培養(yǎng)12 h，設(shè)置不同時(shí)間梯度(0、12、24、48 h)，每個(gè)梯度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置空白對(duì)照組，各組加入含有量效曲線所確定最佳HSYA濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，分別于0、12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，于490 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.5細(xì)胞分組 細(xì)胞分為NC組，Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ+HSYA組，Ang Ⅱ+ HSYA+Baf組，Ang Ⅱ+Baf組。各組細(xì)胞處理如下：除NC組給予正常培養(yǎng)基，余組均以含Ang Ⅱ 10-7mol·L-1培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，各給藥組建立Ang Ⅱ誘導(dǎo)模型后，Ang Ⅱ組恢復(fù)正常培養(yǎng)基，3個(gè)藥物治療組分別給予含40 μmol·L-1HSYA，40 μmol·L-1HSYA+100 nmol·L-1Baf，100 nmol·L-1Baf的培養(yǎng)基，繼續(xù)干預(yù)24 h。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移的作用 將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔鋪于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)100%，饑餓培養(yǎng)12 h后，用黃槍槍頭在6孔板中劃痕，并拍照記錄，記0 h，細(xì)胞處理如“1.2.5”，處理結(jié)束后，拍照記錄，記24 h，隨機(jī)取3個(gè)劃痕視野計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)遷移的細(xì)胞個(gè)數(shù)，拍照后收集各組細(xì)胞提蛋白用作Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.7MDC法檢測(cè)自噬小體 將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔鋪于提前放置有蓋玻片的24孔板，細(xì)胞處理如“1.2.5”，參照MDC試劑盒說明書進(jìn)行，4%多聚甲醛室溫固定25 min；1×Washing buffer清洗3遍；MDC染色工作液室溫染色45 min；1×Washing buffer 清洗3遍；將Collection buffer滴于蓋玻片上，于熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)單位面積自噬斑點(diǎn)數(shù)量。

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，加入一定量蛋白裂解液(蛋白裂解液為RAPI ∶蛋白酶抑制劑=100 ∶1)，冰上裂解30 min；離心：4 ℃，12 000 r·min-1，15 min；取上清，利用Lowrry法測(cè)定蛋白含量；按比例加入一定量4× Loading buffer，98 ℃，煮沸5 min；配制12% SDS-Page膠，每組蛋白上樣約20 μg進(jìn)行電泳，電泳條件設(shè)置為80 V，35 min，120 V，50 min；濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，設(shè)置為300 mA，1 h 10 min；5%脫脂奶粉，常溫孵育2 h；兔抗鼠一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，10 min/次，洗3次；山羊抗兔二抗常溫孵育50 min；TBST洗膜，10 min/次，洗3次；條帶浸泡于ECL發(fā)光液(A液 ∶B液=1 ∶1)，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，用Vision Capt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定本實(shí)驗(yàn)成功從大鼠胸主動(dòng)脈血管外膜中培養(yǎng)出VAFs，VAFs成梭形(Fig 1)，并通過免疫細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VAFs的標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)陽性，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)陰性(Fig 2)。

Fig 1 Pictures of cell cultures (×40)A:P0 generation;B:P1 generation;C:P2 generation;D:P3 generation

Fig 2 Expression of vimentin and α-SMA proteins in VAFs (×100)(n=3)Vimentin or α-SMA：Red；The nucleus：Blue

2.2 Ang Ⅱ的時(shí)效量效曲線采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間Ang Ⅱ?qū)AFs增殖活力的影響，F(xiàn)ig 3A結(jié)果顯示，隨著劑量的增加，Ang Ⅱ?qū)AFs的增殖活力，先呈劑量依賴性增大，后呈劑量依賴性減小，在10-7mol·L-1濃度時(shí)，Ang Ⅱ?qū)AFs的增殖作用最明顯(P<0.01)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)Ang Ⅱ 的濃度采用10-7mol·L-1。10-7mol·L-1的Ang Ⅱ?qū)Σ煌瑫r(shí)間的VAFs增殖作用的結(jié)果顯示(Fig 3B)，隨著時(shí)間的延長，Ang Ⅱ?qū)AFs的增殖活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中12 h、24 h對(duì)VAFs細(xì)胞活力增強(qiáng)最明顯(P<0.01)。

Fig 3 Effect of Ang Ⅱ on VAFs cell n=6)A：Effects of different concentrations of Ang Ⅱ on VAFs cell viability；B：Effects of different time of Ang Ⅱ on VAFs cell viability.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 group.

2.3 HSYA的時(shí)效量效曲線采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度HSYA對(duì)VAFs增殖活力的作用，結(jié)果顯示(Fig 4A)，隨著劑量的增加，VAFs增殖活力呈劑量依賴性降低，且濃度>20 μmol·L-1時(shí)，HSYA對(duì)VAFs增殖抑制，差異具有顯著性(P<0.05)，當(dāng)濃度大于80 μmol·L-1時(shí)，HSYA對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用(Fig 4C)，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)VAFs增殖活力抑制最明顯，且對(duì)細(xì)胞無細(xì)胞毒性的濃度，即40μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8法檢測(cè)不同時(shí)間HSYA(40 μmol·L-1)對(duì)VAFs增殖活力的影響，F(xiàn)ig 4B結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，40 μmol·L-1的HSYA對(duì)VAFs的增殖活力呈時(shí)間依賴性降低，在作用48 h時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞毒(Fig 4D)，選擇對(duì)細(xì)胞增殖活力抑制作用明顯(P<0.05)且沒有毒性作用的24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 4 Effect of HSYA on VAFs cell n=6)A：Effects of different concentrations of HSYA on VAFs cell viability；B：Effects of different time of HSYA on VAFs cell viability；C and D.Images of different concentrations and time of HSYA on VAFs (×40)；*P<0.05，**P<0.01 vs 0 group.

2.4 HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移的作用為初步探究HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移的作用，細(xì)胞分為3組：NC組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+HSYA組。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移的作用，F(xiàn)ig 5結(jié)果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ明顯促進(jìn)VAFs的遷移(P<0.01)，HSYA干預(yù)24 h后，能有效抑制VAFs的遷移(P<0.01)。

Fig 5 Effect of HSYA on migration of A：HSYA inhibited Ang Ⅱ-induced VAFs migration(×40)；B：**P<0.01 vs NC group,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group.

2.5 HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs的自噬小體形成的影響采用MDC法檢測(cè)HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs自噬小體形成的作用，F(xiàn)ig 6結(jié)果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ 刺激24 h后，VAFs中自噬小體增加(P>0.05)；與Ang Ⅱ組相比，HSYA刺激24 h后，明顯增加VAFs中自噬小體的數(shù)量(P<0.01)。

2.6 自噬抑制劑Baf對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移的作用采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬抑制劑Baf對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移，F(xiàn)ig 7結(jié)果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ 組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯增加(P<0.01)，HSYA干預(yù)24 h后，VAFs細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.01)。與HSYA組相比，Baf組VAFs遷移數(shù)量明顯增加(P<0.05)，與Baf組相比，Baf與HSYA共處理組VAFs細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.05)。

2.7 自噬抑制劑Baf對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)VAFs自噬小體形成的影響采用MDC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬抑制劑Baf對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs自噬小體數(shù)量的影響，F(xiàn)ig 8結(jié)果顯示，與NC組相比，Ang Ⅱ組自噬斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加(P<0.05)；與Ang Ⅱ相比，HSYA明顯增加了自噬熒光斑點(diǎn)的數(shù)量(P<0.05)，HSYA與Baf共處理組呈相同趨勢(shì)，與HSYA和Baf共處理組相比，Baf處理自噬小體數(shù)量明顯降低(P<0.05)。

2.8 HSYA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的作用采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，F(xiàn)ig 9結(jié)果顯示，與正常組相比，Ang Ⅱ處理組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)無明顯影響；與Ang Ⅱ組相比，HSYA處理明顯增加自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ的表達(dá)，降低p62蛋白表達(dá)(P<0.05)；與HSYA處理組相比，HSYA和Baf共處理后自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與HSYA和Baf共處理組相比，Baf單獨(dú)處理組自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ 表達(dá)明顯降低(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)升高(P>0.05)。

Fig 7 Effect of HSYA and autophagy inhibitor on migration of Ang Ⅱ-induced n=3)A：Wound healing assay(×40);B：The number of migrated cells.1:NC;2:AngⅡ;3:AngⅡ+HSYA;4:AngⅡ+HSYA+Baf;5:AngⅡ+Baf;**P<0.01 vs NC group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;△P<0.05 vs Ang Ⅱ+HSYA group.

Fig 8 Effect of HSYA and autophagy inhibitor on number of autophagosomes in Ang Ⅱ-induced n=3)A：The autophagosomes are shown in blue(×100)；B：The number of autophagosome;1:NC;2:AngⅡ;3:AngⅡ+HSYA;4:AngⅡ+HSYA+Baf;5:AngⅡ+Baf;*P<0.05 vs NC group;#P<0.05 vs Ang Ⅱ group;△P<0.05 vs Baf group.

Fig 9 Effect of HSYA on protein expression of LC3,Beclin1 and p62 in Ang Ⅱ-induced n=3)1:NC;2:AngⅡ;3:AngⅡ+HSYA;4:AngⅡ+HSYA+Baf;5:AngⅡ+Baf;**P<0.01 vs Ang Ⅱ group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ+HSYA group;△P<0.05,△△P<0.01 vs Ang Ⅱ+HSYA+Baf group.

3 討論

21世紀(jì)初，Li等[9]利用LacZ標(biāo)記追蹤發(fā)現(xiàn)了大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中外膜成纖維細(xì)胞遷移至血管內(nèi)膜的直接證據(jù)，研究表明在內(nèi)膜出現(xiàn)增生之前，LacZ標(biāo)記的成纖維細(xì)胞已經(jīng)遷移至內(nèi)膜；血管外膜成分復(fù)雜，與內(nèi)膜的距離較遠(yuǎn)，然而越來越多的研究顯示血管外膜是血管損傷的最早啟動(dòng)者，甚至是主導(dǎo)者[10]。Kadota等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化中，成纖維細(xì)胞的外囊泡促進(jìn)上皮細(xì)胞衰老，推動(dòng)疾病進(jìn)程；Tong等[3]研究顯示，來自原代培養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)血管外膜成纖維細(xì)胞的外泌體，促進(jìn)WKY大鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移，其機(jī)制可能是SHR大鼠VAFs通過分泌血管緊張素轉(zhuǎn)換酶促進(jìn)中膜平滑肌細(xì)胞遷移，加劇血管重構(gòu)。越來越多的證據(jù)顯示，常被忽略的VAFs在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞自噬是目前的研究熱點(diǎn)，自噬通過降解受損細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)蛋白等維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，多種疾病均與自噬相關(guān)[12]，心血管疾病也與自噬有著密切關(guān)系[13]，研究表明，激活自噬可減輕動(dòng)脈粥樣硬化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，機(jī)制可能是通過調(diào)控自噬抑制NLRP3炎性小體[14]，提示自噬對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控至關(guān)重要。自噬是把雙刃劍，另有研究表明，抑制自噬可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善血管重構(gòu)[15]，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。自噬與心血管疾病密切相關(guān)，有望成為改善或治療疾病的新靶點(diǎn)。

紅花活血化瘀，臨床常用于治療心血管疾病[16]，HSYA是活血化瘀中藥紅花中的主要有效成分，具有多種藥理活性，Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)HSYA通過抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞損傷；另有研究顯示HSYA通過激活自噬抑制炎癥反應(yīng)緩解大鼠心臟缺血/再灌注損傷[18]。HSYA是否通過調(diào)控自噬抑制VAFs異常遷移，從而改善血管重構(gòu)尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的胸主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，通過Ang Ⅱ誘導(dǎo)建立VAFs活化模型，探究HSYA對(duì)VAFs遷移的影響。Vimentin和α-SMA分別是VAFs和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的標(biāo)志蛋白，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2)，所培養(yǎng)細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)陽性，說明貼塊法培養(yǎng)得到的細(xì)胞是VAFs；α-SMA蛋白表達(dá)陰性，說明培養(yǎng)得到的細(xì)胞中不含有VSMCs，該結(jié)果表明原代培養(yǎng)的VAFs獲得成功。采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間Ang Ⅱ?qū)AFs細(xì)胞活力的影響，建立Ang Ⅱ?qū)AFs細(xì)胞活力影響的量效時(shí)效曲線(Fig 3)，確定Ang Ⅱ?qū)AFs細(xì)胞活力影響的最佳濃度和時(shí)間分別為10-7mol·L-1和24 h，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用10-7mol·L-1Ang Ⅱ刺激24 h進(jìn)行試驗(yàn)；同樣方法建立HSYA和VAFs細(xì)胞活力影響的量效時(shí)效曲線(Fig 4A)，確定HSYA最佳濃度和時(shí)間分別為40 μmol·L-1和24 h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用40 μmol·L-1HSYA刺激24 h進(jìn)行試驗(yàn)。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 5)，Ang Ⅱ誘導(dǎo)VAFs遷移活性增加，經(jīng)HSYA處理后明顯抑制遷移；MDC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 6)，HSYA處理后明顯增加自噬熒光斑點(diǎn)數(shù)量，以上兩個(gè)結(jié)果初步表明HSYA可能通過激活自噬抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移。為了確證HSYA對(duì)VAFs自噬和遷移的作用，課題組在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，加入自噬抑制劑Baf，Baf抑制自噬小體和溶酶體的結(jié)合，加入Baf后，自噬小體無法與溶酶體結(jié)合降解自噬小體，造成自噬小體堆積，進(jìn)而抑制自噬的進(jìn)程。加入Baf的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 7)，Ang Ⅱ+HSYA+Baf組較Ang Ⅱ+HSYA組遷移細(xì)胞數(shù)增多，兩組結(jié)果差別明顯，說明抑制自噬后VAFs遷移增強(qiáng)，證明了HSYA通過激活自噬，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移，結(jié)果提示HSYA通過激活自噬抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的遷移。為了進(jìn)一步確認(rèn)此結(jié)果，采用同樣的分組，用MDC法檢測(cè)自噬小體的數(shù)量，結(jié)果顯示(Fig 8)，與Ang Ⅱ組相比，HSYA處理后自噬小體明顯增加，HSYA和HSYA與Baf共處理均進(jìn)一步增加了自噬小體數(shù)量，提示自噬小體堆積增加，驗(yàn)證了HSYA對(duì)自噬起促進(jìn)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了HSYA通過激活自噬抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移。

自噬小體的形成是自噬發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，自噬小體的形成分為三個(gè)階段：自噬小體成核、自噬小體延伸、自噬小體成熟，自噬小體在形成過程中將受損的細(xì)胞器或蛋白包裹進(jìn)來，然后成熟的自噬小體與溶酶體結(jié)合，形成自噬溶酶體，利用溶酶體中的溶解酶將自噬小體裂解，清除受損的細(xì)胞器或蛋白，最終完成自噬整個(gè)過程。Beclin1與Vps34和Vps15復(fù)合物結(jié)合完成自噬小體的延伸，再經(jīng)過兩個(gè)泛素化樣系統(tǒng)，分別為Atg5-Atg12系統(tǒng)和LC3系統(tǒng)，進(jìn)一步形成成熟的自噬小體，LC3 Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3 Ⅱ是自噬小體成熟的標(biāo)志。p62也是參與自噬小體形成的關(guān)鍵分子，通常與自噬活動(dòng)呈負(fù)性相關(guān)。為了確證HSYA通過激活自噬抑制VAFs遷移的初步機(jī)制，采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及p62蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，HSYA處理后Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高，表明自噬活動(dòng)增強(qiáng)。Baf抑制自噬是通過抑制自噬小體與溶酶體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，HSYA與Baf共處理后Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅰ/LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化進(jìn)一步升高，p62蛋白表達(dá)降低，提示自噬小體增多，自噬作用增強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了HSYA對(duì)自噬起促進(jìn)作用，進(jìn)而抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移。

綜上所述，HSYA通過激活自噬，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VAFs遷移，改善血管重構(gòu)，有望成為治療心血管疾病的新靶點(diǎn)。后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步在細(xì)胞水平探究HSYA調(diào)控自噬的機(jī)制，在整體水平探究 HSYA改善血管重構(gòu)的作用機(jī)制。