胡椒堿抗ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化活性及作用機(jī)制

王俊如，張 樹，姚衛(wèi)云，李 瑜，牛銀波，張光偉 ，余 琦，李晨睿

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，3.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710021)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由于血清膽固醇附著于動(dòng)脈內(nèi)膜或動(dòng)脈壁，造成凹凸不平的粥樣脂質(zhì)沉積。由壞死核心、鈣化區(qū)域、脂質(zhì)和發(fā)炎的平滑肌組成的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞泡沫細(xì)胞，以及大動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維素的積累是動(dòng)脈粥樣硬化的病理特征[1-2]。《中國心血管報(bào)告2017》數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)階段我國心血管疾病患者約有2.9億人次，占居民死亡人數(shù)的40%以上，在我國各種疾病死亡率中居于首位[3]。

他汀類藥物作為目前治療AS的一線藥物，副作用相對(duì)較大，長期服用會(huì)導(dǎo)致肝酶異常、肌肉毒性及糖尿病的發(fā)生[4-5]。另外，治療AS的用藥周期較長，因此研發(fā)副作用較小的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物成為醫(yī)藥工作者面臨的重大挑戰(zhàn)之一。有研究報(bào)道，多種天然產(chǎn)物能夠有效對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的形成，如姜黃、丁香和銀杏葉等藥物提取物以及丹參酮IIA(tanshinone IIA，Tan IIA)、廣藿香醇(patchouli alcohol，PA)、黃芪總黃酮(total flavonoids of astragalus，TFA)和淫羊藿苷(icariin)等天然單體[6-11]。胡椒堿(piperine，PIP)是胡椒科植物胡椒(PipernigrumL.)和蓽拔(PiperlongumL.)中含量最高的生物堿單體，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗抑郁和抗腫瘤等作用[12]。據(jù)報(bào)道脂質(zhì)異常和氧化應(yīng)激是AS形成的關(guān)鍵因素，PIP能有效降低鎘引起的小鼠脾細(xì)胞的氧化損傷，以及降低高脂肪喂養(yǎng)(high-fat diet，HFD)的C57BL/6N小鼠體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化水平[13]。然而，PIP在體內(nèi)水平是否能夠?qū)笰S的發(fā)生、發(fā)展目前尚未見報(bào)道。本研究擬利用高脂高膽固醇喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠研究PIP對(duì)AS的治療效果，并利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞探討PIP的作用機(jī)制，以期為AS的治療提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料8周齡雄性ApoE-/-小鼠24只，體質(zhì)量(21.0±0.5)g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(陜)2020-001。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑胡椒堿(批號(hào)：MCP510928)(上海友思生物科技有限公司，上海)；膽固醇檢測試劑盒(批號(hào)：20191201)、甘油三酯檢測試劑盒(批號(hào)：20190428)、LDL-C檢測試劑盒(批號(hào)：20190808)、HDL-C檢測試劑盒(批號(hào)：20190819)、Ox-LDL檢測試劑盒(批號(hào)：20190608)(中生北控生物科技有限公司，北京)；白介素6檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α檢測試劑盒(華美生物工程有限公司，武漢)；SanTaq PCR試劑盒(批號(hào)：MK3829)(TaKaRa Bio，美國)；油紅O染色試劑盒(批號(hào)：MGC20191201)(無錫恒緣生物醫(yī)藥，無錫)；BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：20191223)(南京建生物工程有限公司)、ECL生物發(fā)光顯色試劑盒(批號(hào)：20191120)(Pirece，美國)；CCK-8、NO檢測試劑盒(批號(hào)：120718190315)、MDA檢測試劑盒(批號(hào)：030819190614)、ROS檢測試劑盒(批號(hào)：030918191024)、SOD活性檢測試劑盒(032219190614)、Western及IP細(xì)胞裂液(批號(hào)：20200108)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；RT-qPCR試劑盒(批號(hào)：P5019)(北京天根生化科技有限公司，北京)；脂多糖(批號(hào)：MC0738)(Sigma，美國)。

1.3 主要儀器InAlyzer-DXA人體成分分析儀(韓國Medikors公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；PCR儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 動(dòng)物分組與給藥小鼠于SPF級(jí)潔凈動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(con)、胡椒堿高劑量組(PIP-H，50 mg·kg-1)、胡椒堿低劑量組(PIP-L，10 mg·kg-1)，每組8只。小鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，給予含0.15%膽固醇(Wako；Japan)及21%脂肪的高脂飼料，同時(shí)給予小鼠PIP灌胃。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)潔凈動(dòng)物房中，自由飲水，12 h明暗循環(huán)照明。

1.5 樣本采集給藥結(jié)束后，用0.3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，劑量為0.02 mL·g-1。采用心臟穿刺的方法取血，全血于4 ℃靜置2 h，4 000 r·min-1離心20 min，分離上層血清后，置于-80 ℃冰箱保存待測。分離小鼠肝臟，用生理鹽水潤洗后-80 ℃冰箱保存待測。

1.6 血清生化指標(biāo)測試取40 μL血液上清應(yīng)用氧化酶法，通過Synergy HT酶標(biāo)儀檢測血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesaterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)的濃度。采用ELISA試劑盒對(duì)小鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)濃度進(jìn)行檢測，并根據(jù)說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 主動(dòng)脈油紅O染色ApoE-/-小鼠麻醉后，剝離胸主動(dòng)脈并用4%多聚甲醛固定24 h。固定液中取出后，PBS清洗2次，沿血管壁將主動(dòng)脈縱向剖開并浸入油紅O染液中，室溫下染色1 h。75%乙醇鏡下分化至管腔內(nèi)脂肪斑塊呈橘紅色或紅色，間質(zhì)清晰。之后用蒸餾水清洗2 min，85%異丙醇清洗3遍，再用蒸餾水洗3遍。平鋪好主動(dòng)脈，用數(shù)碼相機(jī)拍照，用于觀察AS斑塊面積。使用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行雙盲定量分析主動(dòng)脈內(nèi)脂肪斑塊面積，并計(jì)算斑塊面積占總面積的百分比，即斑塊面積/總面積×100%。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、丙二醛和超氧化物歧化酶含量測定將HUVEC細(xì)胞以2×108L-1的密度接種在6孔板中，并用1 mg·L-1LPS誘導(dǎo)HUVECs 24 h。之后用不同濃度(0.01、0.05 μmol·L-1)的PIP預(yù)處理2 h，然后加入LPS和PIP共同孵育24 h。隨后用Griess Reagent法以及MDA和SOD檢測試劑盒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量進(jìn)行測定。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR測定將HUVECs以2×108L-1的密度接種在6孔板中，用1 mg·L-1LPS誘導(dǎo)HUVECs 24 h，然后用不同濃度(0.01、0.05、0.1 μmol·L-1)的PIP預(yù)處理2 h，之后加入LPS和PIP共同孵育細(xì)胞24 h。根據(jù)說明書提取RNA，使用分光光度計(jì)檢測RNA的濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA。使用SYBR Green的非專一型qPCR技術(shù)檢測HUVECs內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)。使用的PCR引物序列見Tab 1。

Tab 1 PCR primer sequence

1.10 免疫印跡試驗(yàn)100 mg肝組織樣本加入裂解液，使用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，離心提取組織蛋白。如“1.9”中處理細(xì)胞后，6孔板每孔加150 μL裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。BCA測蛋白濃度后，統(tǒng)一每個(gè)樣本總蛋白上樣量。配制濃縮膠和分離膠，上樣后接上電泳儀，隨后將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，依次進(jìn)行脫脂奶粉封閉以及一抗、二抗孵育，之后加發(fā)光液曝光處理，進(jìn)而分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PIP對(duì)ApoE-/-小鼠血脂的影響PIP在不同劑量下對(duì)高脂、高膽固醇喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂影響的結(jié)果如Fig 1所示。結(jié)果表明，PIP-H和PIP-L組ApoE-/-小鼠血清中TC濃度與con組相比差異無顯著性；而高、低劑量的PIP能明顯降低ApoE-/-小鼠血清中TG和LDL-C的水平(P<0.05)，并明顯增加HDL-C的水平。結(jié)果表明，PIP能夠明顯降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂濃度，從而具有抗AS的活性。

Fig 1 Effects of PIP on plasma levels of LDL-C，HDL-C,TC and TG in ApoE-/-mice after oral administration of low and high doses of PIP n=8)*P<0.05 vs control group.

2.2 PIP對(duì)ApoE-/-小鼠血清中TNF-α和CRP水平的影響AS與炎癥相關(guān)，用ELISA法對(duì)ApoE-/-小鼠血清中的TNF-α和CRP炎癥因子水平進(jìn)行檢測。與con組比較，PIP-H和PIP-L組ApoE-/-小鼠血清中炎癥因子TNF-α和CRP的水平均明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明，PIP能有效降低ApoE-/-小鼠血清中的炎癥水平，從而抑制AS的發(fā)展(Fig 2)。

2.3 PIP對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈樹斑塊面積的影響ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)建立AS模型，灌胃給予高、低劑量的PIP 20周后，分離小鼠主動(dòng)脈并進(jìn)行油紅O染色，通過統(tǒng)計(jì)主動(dòng)脈斑塊面積來反映AS的發(fā)展程度。結(jié)果如Fig 3所示，與con組相比，PIP-H和PIP-L組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈樹AS的面積百分比明顯降低(P<0.05)，并且PIP-H組小鼠主動(dòng)脈樹AS的面積百分比低于PIP-L組的AS面積百分比。結(jié)果表明，PIP可以有效改善高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈樹AS斑塊的形成。

Fig 2 Effects of PIP on serum levels of TNF-α and CRP in ApoE-/- mice after oral administration of low and high doses of PIP n=8)*P<0.05 vs control group.

Fig 3 Effects of PIP on formation of atherosclerotic lesion areas in ApoE-/- mice after oral administration of low and high doses of PIP n=8)Aortic trees were stained with oil red O,and lesion areas were calculated in total aorta.*P<0.05 vs control group.

2.4 PIP對(duì)HUVECs細(xì)胞上清液中NO含量的影響通過Griess Reagent方法測定HUVECs細(xì)胞經(jīng)LPS和不同濃度PIP處理后上清液中亞硝酸鹽含量，從而間接計(jì)算NO的濃度。結(jié)果如Fig 4所示，LPS在1 mg·L-1的濃度下可以明顯降低HUVECs內(nèi)NO的產(chǎn)生(P<0.05)。加入0.01 和0.05 μmol·L-1濃度的PIP可以提高細(xì)胞上清液中NO的含量(P<0.05)。結(jié)果表明，PIP能夠促進(jìn)HUVECs內(nèi)NO的產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

2.5 PIP對(duì)HUVECs細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化水平的影響基于丙二醛(MDA)和硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物測定脂質(zhì)氧化水平，檢測HUVECs細(xì)胞內(nèi)MDA含量。結(jié)果如Fig 5所示，1 mg·L-1LPS可以明顯提高HUVECs細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化水平(P<0.05)PIP在0.01 μmol·L-1和0.05 μmol·L-1濃度下可明顯降低細(xì)胞中MDA的產(chǎn)生(P<0.05及P<0.01)。結(jié)果表明，PIP處理可以降低LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化水平升高，從而具有抗氧化應(yīng)激的作用。

Fig 4 Effects of PIP at various concentrations on production of NO in supernatant of LPS induced HUVECs n=6)HUVECs were cultured treated with LPS and/or PIP.#P<0.05 vs control group,*P<0.05 vs LPS group.

Fig 5 Effects of PIP at various concentrations on production of MDA in HUVECs n=3)HUVECs were cultured and treated with LPS and/or PIP.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group.

2.6 PIP對(duì)HUVECs細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力的影響超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種能夠催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶，防御生物體免受氧化損傷。使用WST-8法通過對(duì)WST-8產(chǎn)物的比色分析測定HUVECs細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力。結(jié)果如Fig 6所示，LPS在1 mg·L-1濃度下可以明顯降低HUVECs細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力水平(P<0.05)。PIP在0.01 μmol·L-1和0.05 μmol·L-1濃度下可明顯提高細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力水平(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明，PIP可明顯抑制因LPS導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力的降低，從而表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激的作用。

Fig 6 Effects of PIP at various concentrations on SOD activity in HUVECs n=3)HUVECs were cultured and treated with LPS and/or PIP.#P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs LPS group.

2.7 PIP對(duì)Akt/eNOS通路相關(guān)信號(hào)分子的影響HUVECs細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，給予不同濃度的PIP處理，細(xì)胞內(nèi)Akt/eNOS通路相關(guān)信號(hào)分子的基因水平如Fig 7所示。經(jīng)LPS誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞內(nèi)Akt、eNOS和Bcl-2基因水平明顯下調(diào)(P<0.05)，而NF-κB和Bax水平明顯上調(diào)(P<0.05)。給予HUVECs細(xì)胞0.01 μmol·L-1和0.05 μmol·L-1濃度的PIP處理，明顯增加Akt、eNOS、Bcl-2基因的水平(P<0.05及P<0.01)，同時(shí)降低NF-κB和Bax的水平(P<0.05)。RT-qPCR結(jié)果表明，PIP可以上調(diào)Akt基因，促進(jìn)eNOS的表達(dá)，從而提高細(xì)胞內(nèi)NO含量，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

Fig 7 Effects of PIP at various concentrations on gene levels of Akt/eNOS signals in HUVECs n=3)#P<0.05 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group.

2.8 PIP對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟中炎癥及應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測ApoE-/-小鼠肝臟中各種炎癥因子和X-盒結(jié)合蛋白1(XBP1)的表達(dá)，結(jié)果如Fig 8所示，高劑量和低劑量PIP能明顯降低ApoE-/-小鼠肝臟中白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。低劑量PIP明顯降低白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)的水平(P<0.05)，高劑量PIP對(duì)IL-18蛋白含量的降低差異無顯著性。與con組相比，Bcl-2同源相關(guān)蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)經(jīng)高、低劑量PIP處理后，表達(dá)降低但差異無顯著性。XBP1、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)和單核細(xì)胞趨化因子1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1)的蛋白水平經(jīng)高、低劑量PIP處理后與con組相比差異無顯著性。結(jié)果表明，PIP能夠明顯降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠肝組織中炎癥因子(IL-6和IL-18)的水平，初步推測PIP抗AS的活性與抑制炎癥水平相關(guān)。

Fig 8 Effects of PIP on protein expressions related to oxidative stress in liver of ApoE-/- mice after oral administration of low and high doses of PIP n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

2.9 PIP對(duì)HUVECs細(xì)胞PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，結(jié)果如Fig 9所示，HUVECs細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，eNOS、Akt和Bcl-2蛋白水平比con組明顯增加(P<0.05)；iNOS蛋白表達(dá)明顯升高(P>0.05)；PI3K有降低的趨勢，但差異無顯著性。給予高劑量PIP(0.05 μmol·L-1)處理后，與LPS組相比，HUVECs中eNOS、PI3K和Akt蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；低濃度PIP(0.01 μmol·L-1)明顯增加Akt和Bcl-2的水平(P<0.05)。PIP在0.01和0.05 μmol·L-1濃度均能明顯降低iNOS的蛋白水平(P<0.05)。結(jié)果表明，PIP能夠上調(diào)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS信號(hào)水平，通過提高內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO的含量，發(fā)揮抗AS的作用。

Fig 9 Effects of PIP on protein expressions related to PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in HUVECs n=3)HUVECs were cultured and treated with LPS and/or PIP.#P<0.05 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group.

3 討論

AS作為一種成因復(fù)雜的心血管疾病，常伴有冠狀動(dòng)脈和腦血管疾病等，涉及大動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維素的積累。普遍認(rèn)為AS是由于脂肪、血栓、結(jié)締組織和碳酸鈣等在血管(主要是動(dòng)脈)沉積所造成。ApoE-/-小鼠可以發(fā)生自發(fā)性AS，是一種廣泛地用于AS研究的經(jīng)典動(dòng)物模型。高脂飼料喂養(yǎng)加速小鼠的AS病變，與人類的AS斑塊分布高度相似。本研究通過高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，建立小鼠AS模型，研究PIP抗AS的作用及其分子機(jī)制。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PIP給藥改善了小鼠的血脂異常，降低小鼠主動(dòng)脈樹病變斑塊的面積百分比以及小鼠血清中TNF-α和CRP炎癥因子的水平。已有研究顯示，AS的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)炎癥水平和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，如IL-6、IL-18、TNF-α和XBP1等[14]。ApoE-/-小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PIP可以降低血脂和炎癥因子水平，具有抗AS的藥理活性；PIP對(duì)血管的保護(hù)作用可能與PIP抑制膽固醇合成，降低炎癥水平作用相關(guān)。目前研究表明，氧化應(yīng)激可以直接損傷血管壁細(xì)胞，或者通過影響血管壁細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的水平，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與AS的發(fā)生發(fā)展[15]，但本實(shí)驗(yàn)中PIP處理對(duì)XBP1、ICAM1和MCP1等氧化應(yīng)激作用的蛋白水平差異無顯著性。此外，體內(nèi)和體外研究表明，高劑量PIP抗AS的效果與低劑量相比未表現(xiàn)出劑量依賴性。我們前期藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PIP的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)呈現(xiàn)非線性動(dòng)力學(xué)的特征，推測這可能是導(dǎo)致抗AS藥效學(xué)不具有劑量依賴性的原因[16]。

AS的發(fā)生發(fā)展涉及多種細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)是其中重要的原因之一。內(nèi)皮細(xì)胞不僅是循環(huán)血液和血管平滑肌細(xì)胞之間的屏障，還能夠調(diào)節(jié)血管張力、生長及血小板功能。通過LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，以及增加細(xì)胞凋亡來促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。其中脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷HUVEC模型是常被用來研究AS發(fā)展分子機(jī)制的模型之一。NO作為細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放的舒張因子；MDA和SOD水平均可反映機(jī)體氧化及抗氧化的能力，即檢測是否具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化損傷的作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示PIP可以降低HUVECs細(xì)胞內(nèi)氧化狀況，明顯提高上清液中NO含量，具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用。PIP可改善因LPS誘導(dǎo)的HUVECs中MDA和SOD水平的降低，表明PIP通過降低細(xì)胞過氧化水平提高抗氧化能力，改善SOD對(duì)具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

循環(huán)系統(tǒng)中源于內(nèi)皮細(xì)胞的NO具有多種血管保護(hù)功能，如調(diào)節(jié)血管緊張度，抑制血小板聚集、炎癥反應(yīng)、和血管平滑肌的收縮。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過NO發(fā)揮多種抗AS作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是導(dǎo)致AS起始的關(guān)鍵因素。體內(nèi)的NO主要由NOS所產(chǎn)生，NOS 包括3種亞型：eNOS、nNOS和iNOS。在完整的血管中，大部分NO由內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS產(chǎn)生。PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用。近年來的研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路與eNOS的磷酸化及活性密切相關(guān)[17]。其中PI3K的抑制劑可下調(diào)NOS的活性。而黃芪提取物通過激活信號(hào)通路而增加eNOS的表達(dá)，最終提高NO的含量。LPS誘導(dǎo)后的HUVEC細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧，使eNOS功能失調(diào)從而產(chǎn)生大量有損于內(nèi)皮細(xì)胞的超氧陰離子。與此同時(shí)，iNOS被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生大量的NO,NO與eNOS產(chǎn)生的超氧陰離子迅速結(jié)合生成過氧亞硝基陰離子，進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[18]。根據(jù)RT-qPCR和Western blot結(jié)果，PIP可以一定程度緩解氧化應(yīng)激相關(guān)病理狀態(tài)下，上調(diào)PI3K的表達(dá)，從而激活A(yù)kt并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)eNOS的表達(dá)，導(dǎo)致激酶活化，參與內(nèi)皮依賴性的舒張。eNOS作為NO合成的限速酶，是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游調(diào)節(jié)因子，在維持血管的正常生理功能中起關(guān)鍵性作用，PIP促進(jìn)eNOS的表達(dá)，從而提高細(xì)胞內(nèi)NO含量，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本研究已證明PIP可以降低細(xì)胞過氧化水平，從根源上緩解過量產(chǎn)生的活性氧對(duì)eNOS的作用，減少超氧陰離子的產(chǎn)生，從而抑制iNOS的誘導(dǎo)表達(dá)，減少對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而促進(jìn)eNOS正常產(chǎn)生NO。綜上所述，推測PIP具有抗AS作用，且其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用的機(jī)制可能與上調(diào)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。