一個Leber先天性黑蒙癥家系的分子診斷與產(chǎn)前診斷

余秀蓉，劉伊楚，蘭風華，曾 健，林 娟，王志紅

0 引 言

Leber先天性黑蒙癥(Leber congenital amaurosis, LCA)是1869年由德國眼科醫(yī)師Theodor Leber首先報道[1]。該病是最嚴重的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，可導致嬰兒在出生后1個月內(nèi)完全喪失視力[2]?；純撼１憩F(xiàn)為眼球震顫、固視障礙、畏光、按壓眼球、黑蒙性瞳孔等眼部癥狀。視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG)表現(xiàn)為a、b波平坦，甚至消失，具有診斷價值。LCA具有遺傳和臨床異質(zhì)性，多數(shù)為常染色體隱性遺傳，也有少數(shù)報道為常染色體顯性遺傳，基因突變譜在不同的種群間存在差異[3]。LCA常見的致病基因主要有CEP290、GUCY2D、CRB1、RPE65、IMPDH1、AIPL1和RPGRIP1等，約50%～60%的LCA患者可以通過基因檢測明確病因[4]。本研究采用二代測序方法對一個LCA家系的先證者進行基因診斷，并通過PCR擴增及直接測序方法對該家系的高危胎兒進行產(chǎn)前分子診斷，并回顧了相關(guān)文獻。

1 資料與方法

1.1 研究對象先證者，女，2014年12月生，1歲，因“生后不能視物”就診于我院眼科，眼科檢查：角膜透明，瞳孔直徑2.5 mm，對光反應存在，眼球震顫，眼球內(nèi)陷，指眼征陽性。標準全視野ERG：雙眼未引出正常波形，雙眼各振幅熄滅。眼底照相提示視網(wǎng)膜色素變性，顯示周邊視網(wǎng)膜色素沉著，見圖1?；純耗I臟彩超、生化全套、動脈血氣分析、尿常規(guī)、尿微量蛋白檢查均正常，患兒聽力正常，智力、運動發(fā)育正常。根據(jù)患者病史及檢查結(jié)果，臨床擬診LCA。先證者父母既往身體健康，無LCA家族史。先證者母親再次妊娠16周行遺傳咨詢，并要求對先證者行LCA相關(guān)的基因診斷以及對所懷胎兒進行產(chǎn)前診斷。家系圖見圖2。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(批準號：2016019)，先證者父母均簽署知情同意書。

a：右眼；b：左眼圖示周邊視網(wǎng)膜色素沉著圖1 Leber先天性黑蒙癥患者眼底照相

Ⅰ-1：先證者母親；Ⅰ-2先證者父親；Ⅱ-1：先證者；Ⅱ-2：胎兒圖2 Leber先天性黑蒙癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取采集先證者及其父母外周血各2 mL，先證者母親妊娠20周，由產(chǎn)科醫(yī)師穿刺抽取其羊水約10 mL。使用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)分別提取該家系的外周血和羊水細胞的基因組DNA，并將DNA樣本置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二代測序先證者外周血送深圳華大臨床檢驗中心進行LCA相關(guān)的基因Panel(AIPL1、CABP4、CEP290、CRB1、CRX、GUCY2D、IQCB1、LCA5、LRAT、RD3、RDH12、RPE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1、IMPDH1、OTX2、KCNJ13和NMNAT1)檢測。主要包括DNA文庫制備，芯片捕獲和富集，測序儀完成基因檢測，基因突變分析并結(jié)合致病變異和正常人基因組等數(shù)據(jù)庫篩選出LCA相關(guān)的變異。

1.2.3 Sanger測序針對先證者在IQCB1第11外顯子發(fā)現(xiàn)的突變，按照參考文獻[5]，由鉑尚生物技術(shù)(上海)合成覆蓋突變位點的引物，上游序列：5′-AGATTGCACAACAGCAGCAG-3′，下游序列：5′-TCATCACGTAGCTAGAAAAGTTGG-3′。擴增產(chǎn)物片段長度為389 bp，包含IQCB1基因c.1090C>T突變位點。對先證者及其父母和高危胎兒的基因組DNA進行PCR擴增，配置PCR反應體系，設(shè)置循環(huán)參數(shù)：95 ℃/5 min；95 ℃/30 s，56 ℃/30 s，72 ℃/30 s，共35個循環(huán)；72 ℃/5 min。PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行Sanger測序。

1.2.4 母體基因組污染排除取胎兒羊水細胞和父母外周血的基因組DNA，按照參考文獻[6]用Identifiler試劑盒(ABI公司)進行PCR擴增，使用3100 Avant遺傳分析儀(ABI公司)檢測15個短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR)，再用GeneMapper Software v3.7軟件鑒定STR位點。根據(jù)母親獨有的STR位點是否在羊水細胞樣本中出現(xiàn)，判斷是否存在母體基因組污染[7]。

2 結(jié) 果

2.1 二代測序LCA相關(guān)基因Panel測序發(fā)現(xiàn)先證者IQCB1基因c.1090C>T(p.R364X)純合突變。該突變?yōu)橐阎虏⌒酝蛔儭?/p>

2.2 Sanger測序測序結(jié)果證實先證者存在IQCB1基因c.1090C>T純合突變，先證者父母和高危胎兒的IQCB1外顯子11基因測序顯示均為c.1090C>T雜合突變，見圖3。

a:先證者(Ⅱ-1)檢出IQCB1基因c.1090C>T純合突變；b:先證者父親(Ⅰ-2)檢出IQCB1基因c.1090C>T雜合突變；c:先證者母親(Ⅰ-1)檢出IQCB1基因c.1090C>T雜合突變；d:胎兒(Ⅱ-2)檢出IQCB1基因c.1090C>T雜合突變圖3 Leber先天性黑蒙癥家系IQCB1基因外顯子11部分序列圖

2.3 母體基因組DNA污染的排除胎兒及其父母基因組DNA的STR位點分析結(jié)果顯示：母親基因組DNA獨有的STR位點均未在胎兒羊水細胞中出現(xiàn)，羊水細胞基因組DNA來自獨立個體，因此，可以排除母體基因組DNA污染。

3 討 論

IQCB1(IQ motif containing B1)基因,也稱NPHP5(nephrocystin-5)基因，是眼-腎綜合征(Senior-Loken syndrome, SLSN)最常見的致病基因,該病呈常染色體隱性遺傳[8]。近年來IQCB1基因突變報道主要見于LCA和SLSN患者，截至2019年4月，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database)已收錄44種突變類型，包括19種無義與錯義突變、6種剪接突變、12種小片段缺失突變和7種小片段插入突變。通過二代測序，本研究發(fā)現(xiàn)先證者存在IQCB1基因c.1090C>T(p.R364X)致病性純合突變。該突變由美國Khanna等[9]于2009年首次報道，Tong等[5]和Yu等[10]在3個中國SLSN患者檢測出該純合突變。通過一代測序驗證，先證者的父母親都攜帶有IQCB1基因c.1090C>T雜合突變，他們沒有眼部及腎臟的病變，符合常染色體隱性遺傳的特征。

IQCB1基因位于3q13.3，有15個外顯子，編碼由598個氨基酸殘基組成的蛋白，其中包含一個螺旋結(jié)構(gòu)域(340-373氨基酸殘基)和兩個鈣調(diào)蛋白IQ結(jié)合域(294-323和387-416氨基酸殘基)。該蛋白主要表達在連接感光細胞的纖毛和腎小管上皮細胞的初級纖毛，負責上皮細胞的完整性。有研究表明該蛋白合成障礙會導致視網(wǎng)膜變性和腎囊腫形成[8]。c.1090C>T(p.R364X)為無義突變，該突變提前引入終止密碼子，使得mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止，產(chǎn)生由363個氨基酸組成的異常截短蛋白。由于該截短蛋白喪失了原有蛋白完整的螺旋結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白IQ結(jié)合域，導致蛋白功能缺陷，從而致病。

IQCB1基因突變所致的SLSN典型臨床表現(xiàn)是視網(wǎng)膜和腎臟的病變，而無其他器官損害。該型患者100%會出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，重者早期出現(xiàn)LCA，輕者表現(xiàn)為輕度視力損害和視網(wǎng)膜色素變性，部分患者可僅表現(xiàn)為早發(fā)視網(wǎng)膜色素變性或LCA而無腎功能衰竭[11-12]。2016年，美國猶他大學的Ronquillo等[13]對IQCB1基因敲除小鼠進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)IQCB1基因編碼的蛋白對小鼠光感受器外節(jié)層形成至關(guān)重要，但對小鼠腎臟和小鼠胚胎成纖維細胞纖毛的形成不是必須的。有研究表明，IQCB1基因突變患者發(fā)生腎功能衰竭的年齡差異較大，早者3歲發(fā)病，遲者可延遲到50歲，因此，僅表現(xiàn)為LCA的患者發(fā)生腎功能衰竭的風險高，若未能早期診斷，有可能突然死于水電解質(zhì)失衡[14]。目前IQCB1基因已成為臨床表型為LCA和(或)腎單位腎癆(nephronophthisis, NPHP)患者的共同篩查基因，可明顯提高SLSN的臨床診斷率。

本研究中先證者目前僅表現(xiàn)出LCA而無腎臟病變，需要定期進行尿常規(guī)、尿微量蛋白、腎功能等監(jiān)測以達到早發(fā)現(xiàn)早治療、預防腎衰竭的目的。目前，雖然有報道基因治療方法應用該病的臨床治療[15]，但是產(chǎn)前診斷/胚胎植入前產(chǎn)前診斷仍然是預防此類患兒出生的主要途徑。本研究中胎兒檢測結(jié)果為IQCB1基因c.1090C>T雜合突變，根據(jù)遺傳規(guī)律，該胎兒出生后患SLSN的風險低。先證者母親于妊娠36周2天順產(chǎn)1健康女孩，LCA /NPHP相關(guān)的眼部及腎臟檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。