小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留檢測研究進展

黃建華

（南充市糧油監(jiān)測站，四川 南充 637000）

赤霉病主要分布在潮濕的溫帶地區(qū)，中國大部分地區(qū)都處于這一地區(qū)，這是中國禾谷類作物受脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染較嚴(yán)重的原因之一，在多雨年份污染狀況則更為嚴(yán)重。因此，準(zhǔn)確、快速地測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留量對糧食安全具有十分重要的意義。文章綜述小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留檢測研究進展，以期為小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留檢測提供參考。

1 概 述

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，由Yoshizawa 等[1]于20 世紀(jì)70 年代在被鐮刀菌污染的小麥等禾谷類食物中發(fā)現(xiàn)并鑒定，是一類B 型單端孢霉烯族真菌毒素，主要是由鐮刀菌（Fusarium spp.）感染小麥、大麥、玉米等谷物產(chǎn)生[2-3]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇理化性質(zhì)穩(wěn)定，對高壓、高熱和弱酸條件具有較強的耐受性，在谷物磨粉、食品生產(chǎn)及日常食物烹調(diào)加工過程中均難以被破壞[4]。其能抑制蛋白質(zhì)、DNA 和RNA 的合成，會對人和動物產(chǎn)生廣泛且明顯的毒性效應(yīng)，包括細胞毒性、免疫抑制和致畸作用及可能的弱致癌性，可引起家畜拒食、嘔吐、生長延遲、生殖紊亂等癥狀以及引起人類免疫抑制、貧血、頭痛、嘔吐、厭食和腹痛等癥狀[5-8]?；诿撗跹└牭毒┐嫉男再|(zhì)及毒性，其對小麥等谷物的污染嚴(yán)重威脅人畜的生命健康，已經(jīng)引起了世界各國的重視，除已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織定為最危險的自然發(fā)生的食品污染物，也已被國際癌癥研究機構(gòu)公布為三類致癌物[9-10]。目前世界上至少有37 個國家和組織制定了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量標(biāo)準(zhǔn)[11]，中國《GB 2761—2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了小麥、小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量不得超過1 000 μg/kg。

小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赤霉病粒含量之間存在顯著線性關(guān)系，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是小麥等谷物赤霉病的重要指示性毒素[12-13]。近年來，由于氣候變化和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的改變，赤霉病已成為影響禾谷類作物生產(chǎn)的最為嚴(yán)重的真菌病害之一[14]。

2 檢測方法

目前，小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留檢測的分析方法主要包括薄層色譜法、免疫化學(xué)分析方法、色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等檢測方法。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法是最早用來分析真菌毒素的方法，具有簡便、經(jīng)濟、對設(shè)備和檢驗人員要求不高等特點，適用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量高的樣品的檢測。但薄層色譜法過程中的制備薄層板、點樣、展開、顯熒光、觀察和評定、定量測定等步驟，操作要求高，需要熟練掌握正確的實驗操作方法。

魏潤蘊[15]研究表明采用薄層色譜法對小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量進行測定，當(dāng)加標(biāo)1 mg/kg 時，平均回收率為91.2%?！禛B 5009.111—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》第三法即為薄層色譜法，其最低檢出量為100 ng，檢出限為300 μg/kg，適用于小麥及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定。

2.2 免疫化學(xué)分析方法

免疫化學(xué)分析方法是利用抗原抗體反應(yīng)的原理進行脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法和發(fā)光免疫測定法。該類方法具有快速方便、靈敏度高、特異性強、不需要昂貴儀器設(shè)備等優(yōu)點，在小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留檢測中已得到廣泛應(yīng)用。但會因抗體與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的乙酰化類似物的交叉反應(yīng)而易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[16-17]。

賈衛(wèi)昌等[18]分別用高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫吸附法對小麥進行檢測，二者在 200 ～1 500 μg/kg 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好相關(guān)性，方法回收率為80%～120%；Yan 等[19]在制備出高靈敏性、高親和力、高特異性的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體基礎(chǔ)上，建立了基于間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的方法，使得檢測靈敏度提升為7.83 ng/mL，最低檢出限低至0.20 ng/mL，在小麥等樣品中的添加回收率為78.6%～116.8%。侯霄煜[20]對酶聯(lián)免疫吸附法檢測小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法進行了優(yōu)化，待測樣品無需凈化，且具有快速、敏感、方便等優(yōu)點。

謝婷婷等[21]采用高效液相色譜法和時間分辨熒光免疫層析法分別對小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行檢測，其中時間分辨熒光免疫層析法檢測其回收率為85.7%～118.8%，精密度為9.6%，方法檢出限與定量限分別為232.2 μg/kg 和358.1 μg/kg，并且與 HPLC 法相比，檢測結(jié)果無顯著性差異，準(zhǔn)確度較高。陳永忠等[22]建立了增強化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法來定量檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，在0.01～100.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性相關(guān)，檢測限為0.19 ng/mL，板內(nèi)板間變異系數(shù)低于8%，對小麥樣品按照添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、中、低3 個水平進行回收率試驗，結(jié)果回收率為 90.0%～126.8%。并與酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法進行比較，該法具有高靈敏度、高特異性，且樣品前處理簡單，節(jié)省時間，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，能夠滿足對谷物類糧食中的微量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行現(xiàn)場監(jiān)測。

2.3 色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜法具有高分離效能、準(zhǔn)確度高、可靠性好的優(yōu)勢，質(zhì)譜技術(shù)具有定性能力強、靈敏度高等特點。色譜質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合了色譜、質(zhì)譜兩者的優(yōu)點，大大提高分析的靈敏度和可靠性。色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇較薄層色譜法、免疫化學(xué)分析方法具有明顯的優(yōu)勢，具有高速、高效、高分辨、微量檢測及分析自動化的性能和技術(shù)優(yōu)勢，被越來越多的研究者采用。

趙芳[23]采用免疫親和柱凈化—高效液相色譜（IAC—UPLC 法）測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留量，該方法在84 ～4 200 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，方法檢出限為51 μg/kg，在0.428 0 ～1.5836 mg/kg 的添加濃度水平范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率為81.4%～100.9%。何攀等[24]改進了免疫親和高效液相色譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法，該方法優(yōu)化色譜分離條件，通過改變紫外檢測波長來降低雜質(zhì)信號干擾，并利用二極管陣列檢測器進行波長掃描，收集色譜結(jié)果為陽性的紫外吸收光譜，通過與建立的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)光譜普庫進行匹配性檢索的定性結(jié)果判斷，能有效避免假陽性的出現(xiàn)，提高樣品檢測的準(zhǔn)確度。該方法在50～5 000 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 89，在50～5 000 μg/kg 的添加水平的加標(biāo)回收率為91.7%～97.2%，精密度（RSD）為0.83%～3.21%。歐陽毅等[25]采用聚乙二醇和水對小麥樣品進行振蕩提取，提取液分別用活性炭、柱層析硅膠、中性氧化鋁、酸性氧化鋁、堿性氧化鋁凈化，比較幾種吸附劑對小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留檢測的凈化效果，結(jié)果表明，用酸性氧化鋁凈化效果最好。該方法加標(biāo)平均回收率和精密度較好，在500 ～2 000 μg/kg 的添加水平的加標(biāo)回收率為91.0%～103.7%，精密度（RSD）為2.3%～8.5%。張正煒等[26]采用氣相色譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留量，樣品用乙腈/水混合液提取，提取液經(jīng)水浴氮吹吹干，三甲基硅烷咪唑TMSI 和三甲基氯硅烷TMCS 衍生化混合試劑衍生，用電子捕獲檢測器測定。該方法的最低檢測濃度為0.01 mg/kg，在0.01～1.00 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 5，在0.04～1.00 mg/kg的添加水平的加標(biāo)回收率為93.8%～108.5%，精密度（RSD）為4.3%～8.6%。

李瑞園等[27]采用HPLC—MS/MS 法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物的殘留量，樣品用乙腈/水混合液提取，提取液經(jīng)MycosepTM227 凈化柱凈化，采用負離子電噴霧電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，外標(biāo)法定量。該方法中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在5.0～200.0 μg /L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 8，檢出限為0.10 μg/kg，定量限為0.33 μg/kg，在5.0、20.0、100.0 μg/kg 的添加水平的加標(biāo)回收率分別為93.6%、98.6%和93.8%，精密度（RSD）分別為5.4%、2.8%和3.9%。黃娟等[17]采用固相萃取—高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測小麥中的嘔吐毒素，樣品經(jīng)乙腈/水溶液提取，HLB 固相萃取小柱富集凈化。該方法的檢出限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg，在20～1 000 μg /L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997。在50、100、500 μg/kg 的添加水平的加標(biāo)回收率分別為81.8%、104.1%和79.5%，精密度（RSD）分別為10.4%、13.0%和11.3%。楊帥等[28]采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，樣品采用乙腈/水/甲酸混合溶液提取。方法中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在10～100 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.997 4，檢出限為0.873 μg/kg，定量限為2.911 μg/kg。在10、20.0、40 μg/kg 的添加水平的加標(biāo)回收率分別為111.7%、100.1%和83.5%，精密度（RSD）分別為6.7%、3.5%和2.0%。夏義平等[29]報道了UPLC-MS/MS 內(nèi)標(biāo)稀釋法測定糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇不確定度的評定，試驗主要分析了測量重復(fù)性（精密度）、標(biāo)準(zhǔn)儲備液、配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品提取過程、儀器、線性回歸等因素的不確定度。王志元等[30]采用氣相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜測定小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，樣品用丙酮提取，弗羅里硅土柱凈化，N—七氟丁酰咪唑進行衍生，該方法的檢出限為0.01 mg/kg。

3 展 望

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，食品安全也越來越受到重視，但是全球小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的污染卻較為嚴(yán)重，所以加強小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留檢測甚為重要。通過檢測實時了解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的污染情況并針對性地對其進行防控，對確保糧食和食品安全具有重要意義，因此，目前世界各國政府都十分重視對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的污染分析和定期監(jiān)測工作，并制定了相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。相信隨著世界經(jīng)濟的不斷發(fā)展，科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，上述3 種小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇殘留檢測方法也會進一步創(chuàng)新與完善，總的發(fā)展趨勢是靈敏度更高、特異性更強、精密度更高、速度更快、操作更加便捷。