越南紫薯胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚胎形成

胡根海，張曉紅，趙元增

（河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

【研究意義】紫薯〔Ipomoea batatas（L.）Lam〕又稱紫心甘薯、黑薯，為1 年生旋花科類草本植物，因薯肉常呈紫色或紫黑色而得名。紫薯不僅可以直接食用，而且還可以用于色素提取、飲品開發(fā)，具有更廣應(yīng)用價值［1］。越南紫薯與一般的紫薯相比，淀粉和維生素含量更高，口感特別粉糯。和普通國產(chǎn)紫薯相比，越南紫薯果肉皮薄細(xì)嫩，薯香濃郁，肉質(zhì)細(xì)膩，但薯塊較小。目前紫薯的薯塊均較小，平均每667 m2產(chǎn)量在2 000 kg 左右［2］，如審定品種寧紫薯1 號2 年平均為1 805.6 kg，遠(yuǎn)低于普通甘薯3 000 kg 以上的產(chǎn)量。因此改良越南紫薯提高產(chǎn)量穩(wěn)定品質(zhì)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】生產(chǎn)上常用莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗［3］。在薯苗培育過程中要消耗大量的薯塊，這直接導(dǎo)致栽培種苗無法滿足人們的需求［4-5］。組織培養(yǎng)可以誘導(dǎo)形成胚性愈傷，胚性愈傷進(jìn)一步發(fā)育形成體細(xì)胞胚胎，體細(xì)胞胚胎發(fā)育為植株，在體細(xì)胞胚胎分化擴(kuò)繁過程中可以顯著提高繁殖系數(shù)。甘薯是種性退化速率較高的作物，無性繁殖幾代后薯塊品質(zhì)即下降，體細(xì)胞胚是相對穩(wěn)定的繁殖方式，有利于種苗繁育的遺傳穩(wěn)定。有研究報道甘薯的塊根組織培養(yǎng)已獲得愈傷組織，但未獲得胚性愈傷［6］，通過莖尖、葉片培養(yǎng)易獲得愈傷組織，同時可獲得少量胚性愈傷［7-8］。已有研究認(rèn)為胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率可能與甘薯基因型有關(guān)，不同基因型的甘薯誘導(dǎo)率差異極大［9］。目前紫薯多見誘導(dǎo)愈傷的報道［10-11］和莖尖培養(yǎng)直接成苗技術(shù)［12-14］，而且這些材料是20 世紀(jì)90 年代最初引進(jìn)的紫肉甘薯品種日本農(nóng)家種山川紫的后代?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】越南紫薯是紫薯一個新引進(jìn)種，其組織培養(yǎng)還未見報道，試驗擬以越南紫薯為材料，以葉片和莖段作外植體，分析6-BA 和NAA 在愈傷組織誘導(dǎo)中的作用，2,4-D 和6-BA 在愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織、ABA 在胚性愈傷形成體細(xì)胞胚胎中的作用，探討在MS 培養(yǎng)基中附加植物生長調(diào)節(jié)物誘導(dǎo)胚性愈傷并分化為體細(xì)胞胚的有效方案。【擬解決的關(guān)鍵問題】篩選適合越南小紫薯基因型的外植體誘導(dǎo)愈傷組織、胚性愈傷和體細(xì)胞胚的適宜培養(yǎng)基，為越南紫薯的工廠化育苗和遺傳改良提供途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試越南紫薯于2020 年3 月6 日購自超市蔬菜區(qū)。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫薯催芽育苗 2020 年3 月8 日培養(yǎng)盒中排列紫薯，用細(xì)沙覆蓋，澆水保持濕潤，置于25～30 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，約10 d 左右出芽，待芽長到20 cm 時備用。

1.2.2 外植體獲得 挑選幼嫩正在生長的葉片和莖段，流水沖洗后，在超凈工作臺上，先用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗1～2 次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% HgCl2消毒2～3 min，無菌水沖洗4～6 次，無菌濾紙吸干表面水分，無菌剪刀將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm 的小方塊，莖段剪成1 cm，接種到30 mL 固體MS 培養(yǎng)基上，25（±0.5）℃黑暗培養(yǎng)3 周后，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)室25（±0.5）℃光照培養(yǎng)，光照條件2 000～3 000 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，誘導(dǎo)獲得的愈傷組織。

1.2.3 激素組合 激素組合見表1，其中A、B、C、D 分別代表6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）和脫落酸（abscisic acid,ABA）的濃度，與編號對應(yīng)的為濃度，如A1 表示6-BA 的濃度為0.1 mg/L，B2 表示NAA 濃度為0.6 mg/L，A1B2 表示在培養(yǎng)基中添加的6-BA 濃度為0.1 mg/L，NAA 濃度為0.6 mg/L。對紫薯葉片、莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時僅使用A、B 激素組合，胚性愈傷組織誘導(dǎo)使用A、C 激素組合，體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)使用A、B、D 激素組合。

表1 培養(yǎng)基不同激素處理Table 1 Different hormone treatments in medium（mg/L）

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo) 愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、植物凝膠2.6 g/L 及不同濃度的6-BA 和 NAA，調(diào)節(jié)pH 至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15～20 min。將紫薯莖段和葉片外植體，分別接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每瓶5 個外植體，3 次重復(fù)。在誘導(dǎo)起始階段進(jìn)行7 d 的黑暗處理，接著轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25（±0.5）℃，光照強(qiáng)度為1 200 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計并記錄愈傷組織產(chǎn)生情況。

1.2.5 胚性愈傷組織誘導(dǎo) 分化培養(yǎng)基為MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖40 g/L、植物凝膠2.6 g/L 及不同濃度的6-BA 和2,4-D，調(diào)節(jié)pH 至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15～20 min。將1.2.4誘導(dǎo)的愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基中，每瓶3 塊，培養(yǎng)溫度25（±0.5）℃，光照強(qiáng)度1 200 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，培養(yǎng)60～80 d 后統(tǒng)計并記錄胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、出胚率。

1.2.6 體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo) 體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、植物凝膠2.6 g/L及不同濃度的6-BA、NAA 和ABA，調(diào)節(jié)pH 至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15～20 min。將1.2.5 誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷放置于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行出胚誘導(dǎo)，繼代2 周后可見產(chǎn)生體胚，每個培養(yǎng)基10 瓶，每瓶3 個愈傷塊，培養(yǎng)溫度28（±0.5）℃，光照強(qiáng)度1 200 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，出胚后統(tǒng)計并記錄出胚率。

1.2.7 體細(xì)胞胚植株再生及煉苗移栽 將成熟的體胚轉(zhuǎn)移至MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)發(fā)育成正常小植株時，逐漸打開瓶口，7 d 后移栽至基質(zhì)中。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=長出愈傷的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100

愈傷組織初始接種質(zhì)量=接種后培養(yǎng)基質(zhì)量－原培養(yǎng)基質(zhì)量

愈傷組織生長量=培養(yǎng)30 d 后愈傷組織質(zhì)量－愈傷組織初始接種質(zhì)量

出胚率（%）=出胚愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù)×100

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對越南紫薯不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗對越南紫薯嫩葉和莖段同時進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果顯示暗培養(yǎng)7 d 后，外植體的切口處均出現(xiàn)愈傷組織，莖段更為明顯，切口處可見黃白色愈傷組織。隨后，愈傷組織繼續(xù)生長，在葉片的四周切口處均出現(xiàn)愈傷組織，莖段外植體兩端形成愈傷組織塊，逐漸呈啞鈴狀（圖1A）。A、B 兩種激素不同濃度組合對葉片和莖段愈傷組織誘導(dǎo)率的影響無顯著差異（表2），兩種外植體愈傷誘導(dǎo)率在所有激素濃度組合均達(dá)到100%，且愈傷組織顏色、質(zhì)地和生長狀況均良好，說明6-BA 和NAA 組合有利于紫薯愈傷組織的誘導(dǎo)；但不同濃度和組合愈傷組織生長量存在差異，愈傷組織狀態(tài)也不同，當(dāng)NAA 濃度相同時，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織生長量逐漸增高，最佳6-BA 濃度為1.0 mg/L，過高的6-BA 濃度也會抑制愈傷組織生長量；NAA 濃度較低時誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃綠色疏松，高濃度誘導(dǎo)的愈傷組織較致密，NAA 濃度為0.2 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L 時，誘導(dǎo)效果優(yōu)于較高激素濃度。

表2 不同激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different hormone combinations on callus induction

2.2 激素對越南紫薯胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將葉片或莖段誘導(dǎo)的愈傷組織，轉(zhuǎn)接至胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)。誘導(dǎo)8 周左右，結(jié)果顯示胚性愈傷組織與普通愈傷組織有明顯形態(tài)差異（圖1B）。不同激素配比胚性愈傷組織形成效果差異明顯，由表3 可知，在愈傷組織向胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化過程中，2,4-D起著重要作用，2,4-D 濃度過低過高均不利于胚性愈傷組織的形成，2.0 mg/L 為最佳胚性愈傷組織誘導(dǎo)濃度；不同6-BA 濃度對胚性愈傷出愈率影響不同，其中0.1 mg/L 有利于增加胚性愈傷組織出愈率，較高6-BA 濃度不利于胚性愈傷組織的形成，且濃度越高出愈率降低。

表3 不同激素組合對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on embryogenic callus induction

2.3 激素對越南紫薯體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，開始體胚分化，逐漸出現(xiàn)綠色的胚（圖1C），隨著時間延長，體細(xì)胞胚越來越大，直至發(fā)育成成熟胚（圖1D）。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計體細(xì)胞胚胎個數(shù)，由表4 可知，不同激素組合誘導(dǎo)所得體細(xì)胞胚胎有較大的差異，最高為A1B1D3 組合（MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L），綜合分析3 種激素水平體細(xì)胞胚胎的獲得及其后續(xù)進(jìn)一步成長情況可知，當(dāng)NAA 處于較高水平時，出胚率較低，且隨6-BA 濃度水平提高也呈現(xiàn)出胚率降低的趨勢。

表4 不同激素組合對胚性愈傷體胚化誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects of different hormone combinations on embryogenesis of embryogenic callus

2.4 體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)成苗及移栽馴化

將不同激素組合培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入MS ＋蔗糖3%的培養(yǎng)基上，使其進(jìn)一步發(fā)育生長成苗（圖1E、F）。由表4 可知，不同來源體細(xì)胞胚胎后續(xù)生長表現(xiàn)有差異，由A1B1D3培養(yǎng)基誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚的成苗率最高為77.8%，其次為A2B4D2、成苗率61.1%，其余培養(yǎng)基誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚成苗率均較低，部分未能發(fā)育成植株，且其體細(xì)胞胚發(fā)育過程中有白化干枯死亡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 不同外植體對愈傷組織形成的影響

不同甘薯品種其愈傷組織形成能力也不同［14-15］，而且外植體不同其形成愈傷組織的難易程度也不同［16-18］。本試驗發(fā)現(xiàn)越南紫薯葉片和莖段在相同激素組合處理下，形成愈傷的能力基本一致，但愈傷生長量略有差異，葉片形成的愈傷量略高，這與周麗艷等［19］的研究結(jié)果一致，而且由于葉片易采集數(shù)量多，形成愈傷組織量較高，因此適宜作細(xì)胞工程初始培養(yǎng)的外植體。紫薯外植體愈傷組織形成的決定因素是激素組合，如6-BA 的使用量直接影響愈傷生長量，較低和過高的6-BA 濃度均導(dǎo)致愈傷生長量偏低，較低的NAA 濃度有利于增加愈傷組織生長量。越南紫薯誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3.2 愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織

甘薯誘導(dǎo)愈傷組織可以分為非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織2 類，一般直接由外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為非胚性愈傷組織，這種愈傷呈水乳狀，乳白色，結(jié)構(gòu)疏松，且生長旺盛，但不能直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎，從而再生成植株［19-20］。紫薯工廠化種苗生產(chǎn)需要大量體細(xì)胞胚胎，這需要通過改變培養(yǎng)條件將非胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織，從而形成大量體細(xì)胞胚胎，培育所需的再生苗。已有研究認(rèn)為胚性愈傷組織的形成與激素和品種有關(guān)［10］，對單一品種而言，主要是激素影響胚性愈傷組織的形成。本試驗發(fā)現(xiàn)越南紫薯胚性愈傷組織的形成起主要作用的是2,4-D，較低或過高的2,4-D 直接影響胚性愈傷組織的形成和數(shù)量，這與楊強(qiáng)強(qiáng)等［21］、崔紅等［22］的結(jié)論一致，6-BA 對胚性愈傷組形成有輔助作用，適宜的6-BA 濃度可以使胚性愈傷組織量達(dá)到最大。

3.3 胚性愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎

胚性愈傷組織進(jìn)一步發(fā)展的方向與培養(yǎng)基的成分和激素有關(guān)，只有適宜的培養(yǎng)基和激素濃度才能獲得較多的體細(xì)胞胚胎。ABA 對胚性愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)育為體細(xì)胞胚胎起著重要的作用［23-24］，對刺槐的研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織后繼續(xù)在高濃度激素下繼代，胚性愈傷組織會持續(xù)脫分化，不能產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎［25］。本試驗將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不同繼代培養(yǎng)基表現(xiàn)出不同誘導(dǎo)效果，在低6-BA 和NAA 濃度下，胚胎率誘導(dǎo)與ABA 有關(guān)，在0.5 mg/L 濃度體細(xì)胞胚胎有較高發(fā)生率；較高的6-BA 和NAA濃度都會導(dǎo)致體細(xì)胞胚胎發(fā)生率降低，而高NAA濃度體細(xì)胞胚胎發(fā)生率為零。說明在較低濃度6-BA 和NAA 下，培養(yǎng)基再附加一定濃度的ABA有利于紫薯體細(xì)胞胚胎發(fā)生，本試驗的最佳組合為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，越南紫薯葉片和莖兩種外植體接種在普通愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，黑暗處理1 周后轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，葉片具有略高的愈傷組織形成能力，其誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；愈傷組織必須轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織才能進(jìn)一步發(fā)育形成體細(xì)胞胚胎，由愈傷組織到胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化需要高濃度的2,4-D 誘導(dǎo)和低濃度6-BA 輔助，其最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L +2,4-D 2.0 mg/L。胚性愈傷出現(xiàn)后，需要撤掉2,4-D，改用MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L 才能誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚胎。在胚性愈傷進(jìn)一步發(fā)育為體細(xì)胞胚胎過程中，低6-BA 和NAA 濃度下誘導(dǎo)胚胎率與ABA有關(guān)，體細(xì)胞胚胎可在MS ＋蔗糖3%培養(yǎng)基上生長成苗。