鱘感染海豚鏈球菌組織病理學(xué)研究

文/王靜波 徐立蒲 劉建男 張文 呂曉楠 王小亮 曹歡 王姝

鱘魚(yú)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的大型冷水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。近年來(lái)，鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，各種病害尤其是細(xì)菌性疾病日益嚴(yán)重，制約了鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。鏈球菌是一種條件性人畜共患病病原菌，可引起局部組織蜂窩織炎、心內(nèi)膜炎及化膿性腦膜炎等。其中，海豚鏈球菌可感染多種海淡水魚(yú)類，引起魚(yú)類的腦膜炎和敗血癥。目前已有多例海豚鏈球菌感染西伯利亞鱘、施氏鱘和雜交鱘等引起暴發(fā)性疾病的報(bào)道，海豚鏈球菌已成為鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的重要威脅。為此，有必要開(kāi)展鱘魚(yú)感染海豚鏈球菌后的病理?yè)p傷特征研究，探索海豚鏈球菌對(duì)鱘魚(yú)的致病機(jī)制，為鱘魚(yú)鏈球菌病的準(zhǔn)確診斷和防治措施研究奠定基礎(chǔ)。

一、病原菌的鑒定與組織病理切片制作

（一）患病鱘

采自河北保定某鱘魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)。

（二）病原分離與鑒定

取癥狀典型的患病鱘，無(wú)菌操作從肝、脾和腎劃線分離，于腦心浸液瓊脂（BHIA）平板和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h。

病原菌鑒定采用API鑒定系統(tǒng)和16S rDNA分子生物學(xué)方法。

（三）主要試劑和設(shè)備

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、API 20 STREP鑒定試劑條、UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒、PCR相關(guān)試劑；試驗(yàn)試劑酸性分化液、二甲苯、無(wú)水乙醇、切片石蠟、樹(shù)膠、蘇木精、伊紅染液等；全自動(dòng)脫水機(jī)、包埋機(jī)、冷凍機(jī)、切片機(jī)、烘片機(jī)。

（四）組織病理切片制作與觀察

取患病魚(yú)肝、腦、心、鰓、腎、脾和肌肉等組織于10%中性福爾馬林中固定。固定組織經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和常規(guī)石蠟切片，切片厚度為4μm。切片經(jīng)HE染色，中性樹(shù)膠封片，用Leica DM4000 LED 觀察并拍照記錄。

二、主要病理變化

（一）臨床癥狀

患病魚(yú)外觀主要癥狀為口周圍、腹部?jī)蓚?cè)骨板、肛門(mén)出血（圖1）。剖檢見(jiàn)部分試驗(yàn)魚(yú)腹腔中有紅色血樣腹水；肝臟充血并有出血點(diǎn)（圖2）；脾臟腫大；腸道充血發(fā)紅，腸壁變薄，腸道積液；腎臟明顯腫大，出血呈紫黑色或嚴(yán)重糜爛不易剝離。

圖1 魚(yú)口周圍充血、腫脹

圖2 腹腔紅色血水、肝臟淤血、脾臟缺血

（二）病原分離鑒定

分離菌在BHIA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h的菌落特征為：白色、圓形、邊緣齊整、扁平、直徑約0.3mm～0.5mm。在血瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24h，菌落為圓形，中心白色，周邊半透明，形成β溶血環(huán)。氧化酶陰性，觸酶反應(yīng)陰性，革蘭氏染色陽(yáng)性，卵圓形，呈鏈狀或雙排鏈狀。

采用API 20 STREP 系統(tǒng)和PCR 16S rDNA 基因鑒定為海豚鏈球菌。

（三）組織病理學(xué)變化

組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)鱘魚(yú)呈全身性感染的敗血癥表現(xiàn)，各器官組織都有不同程度病變，尤以脾臟和腎臟的病理?yè)p傷最為嚴(yán)重。各器官組織的具體病理?yè)p傷情況如下。

腦：腦膜疏松，水腫增厚，并伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血，有大量色素沉積（圖3A）；感染后期腦基質(zhì)疏松、水腫呈海綿狀，神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)局灶性的液化性壞死（圖3B）。

圖3 雜交鱘海豚鏈球菌感染的組織病理學(xué)變化

肝：肝血竇擴(kuò)張、淤血，肝靜脈淤血或缺血（圖3C）；肝細(xì)胞腫脹，彌漫性空泡變性，部分區(qū)域發(fā)生液化性壞死，感染后期有中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3D）。

脾：脾臟被膜水腫增厚甚至與實(shí)質(zhì)剝離；脾組織嚴(yán)重淤血、出血，脾實(shí)質(zhì)淋巴細(xì)胞被紅細(xì)胞取代，呈出血性壞死性脾炎。脾紅髓與白髓邊界模糊不清，結(jié)構(gòu)不清；部分區(qū)域白髓壞死，淋巴細(xì)胞減少，組織疏松（圖3E）。感染后期脾被膜成片脫落，脾實(shí)質(zhì)組織嚴(yán)重缺血，淋巴細(xì)胞大量減少、嗜酸性粒細(xì)胞顯著增多，部分區(qū)域出現(xiàn)嚴(yán)重的液化性壞死（圖3F）。

腎：整個(gè)腎臟組織缺血，腎間組織中紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少，部分區(qū)域出現(xiàn)液化性壞死導(dǎo)致腎間質(zhì)疏松；腎間組織中嗜酸性粒細(xì)胞異常增多（圖3G）。腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性，甚至壞死脫落，腎小管上皮細(xì)胞透明滴狀變，嚴(yán)重時(shí)腎小管上皮細(xì)胞和腎小管管腔內(nèi)可見(jiàn)大量均質(zhì)紅染的蛋白質(zhì)顆粒（圖3H）。

鰓：鰓組織病變較輕微，主要表現(xiàn)為鰓小片上皮細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血。

骨骼?。杭∪饨M織病變較輕微，僅見(jiàn)肌纖維輕微變性腫脹。

三、結(jié)果與分析

在致病性鏈球菌中，海豚鏈球菌宿主范圍廣泛，可感染海淡水魚(yú)類和其他動(dòng)物，是危害性強(qiáng)的人畜共患病病原和水產(chǎn)病原。目前，鱘魚(yú)海豚鏈球菌感染的病例日益增多，海豚鏈球菌已成為養(yǎng)殖鱘魚(yú)中危害大的細(xì)菌性病原之一。本研究發(fā)現(xiàn)，在患病鱘各器官組織中，脾臟和腎臟損傷最為嚴(yán)重，為主要的靶器官和組織。脾臟實(shí)質(zhì)組織壞死、嚴(yán)重出血，淋巴細(xì)胞減少，呈出血性壞死性脾炎；腎臟則主要表現(xiàn)為腎間組織壞死，腎小管上皮細(xì)胞透明滴狀變，嗜酸性粒細(xì)胞增多；肝臟和腦組織可見(jiàn)液化性壞死灶，肝臟中有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。海豚鏈球菌感染不同宿主時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同癥狀，如引起海豚的多灶性皮下膿腫、人的蜂窩織炎、關(guān)節(jié)炎等，魚(yú)類則多表現(xiàn)為全眼球炎、腦膜炎和敗血癥。本研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚(yú)海豚鏈球菌病的臨床癥狀與人、海豚等動(dòng)物有較大差異，與其他魚(yú)類感染海豚鏈球菌較為相似，但未見(jiàn)到明顯的全眼球炎癥狀，這可能主要與宿主的種屬特異性有關(guān)。

魚(yú)類的脾臟和腎臟是重要的免疫器官。脾臟是機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要場(chǎng)所，同時(shí)也具有造血功能，是紅細(xì)胞、各種粒細(xì)胞產(chǎn)生、儲(chǔ)存和成熟的主要場(chǎng)所。魚(yú)類的腎臟也具有造血功能，腎間組織中含有大量的免疫細(xì)胞，可以不依賴抗原刺激而產(chǎn)生相應(yīng)的免疫細(xì)胞，是抵御外界病原入侵的直接防線。研究表明，海豚鏈球菌具有多個(gè)重要毒力基因，如cpsD（編碼莢膜多糖，能協(xié)助其逃避宿主細(xì)胞的清除作用）、simA（編碼M樣蛋白，能夠保護(hù)細(xì)菌免受巨噬細(xì)胞的吞噬，使免疫球蛋白失去免疫活性）和sagA（編碼溶血素，能夠破壞正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，使宿主紅細(xì)胞發(fā)生溶血），這些毒力基因在細(xì)菌入侵、免疫逃避和體內(nèi)增殖中發(fā)揮重要作用。感染海豚鏈球菌后，鱘魚(yú)脾臟和腎臟的嚴(yán)重病變提示海豚鏈球菌具有很強(qiáng)的毒力，可以突破脾臟和腎臟的免疫防御系統(tǒng)。脾臟和腎臟的損傷又進(jìn)一步降低了鱘魚(yú)的防御能力，為細(xì)菌進(jìn)一步大量增殖、形成全身感染、引發(fā)多組織器官損傷和敗血癥創(chuàng)造了條件。

許多報(bào)道表明，海豚鏈球菌可突破宿主的血腦屏障，引起魚(yú)類等多種動(dòng)物的化膿性腦膜炎。本研究中患病鱘腦膜水腫增厚，有大量色素沉積，腦基質(zhì)發(fā)生局灶性的液化性壞死，表明海豚鏈球菌可突破鱘的血腦屏障，引起腦膜炎。同時(shí)，在患病鱘腦組織中并未發(fā)現(xiàn)化膿性炎癥的標(biāo)志——中性粒細(xì)胞的存在，這可能與感染濃度較大，病程較短有關(guān)，即細(xì)菌雖然突破了鱘的血腦屏障，但尚未在腦組織內(nèi)大量增殖，也未來(lái)得及引起腦組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)以形成明顯的化膿病灶。此外，患病鱘肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，部分區(qū)域發(fā)生液化性壞死并伴有中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步證實(shí)海豚鏈球菌可引起鱘魚(yú)多器官損傷，以及化膿性炎癥。本研究還發(fā)現(xiàn)，感染海豚鏈球菌后，鱘肝臟和腎臟中嗜酸性粒細(xì)胞顯著增多，這可能與魚(yú)體清除病原、抗感染有關(guān)。嗜酸性粒細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體重要的免疫防御細(xì)胞，在抗細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。脾臟和腎臟組織中嗜酸性粒細(xì)胞大量增殖，在殺傷細(xì)菌的同時(shí)，也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥進(jìn)展，損傷組織并最終引起多器官損傷。