食管鱗狀細胞癌NET1的表達和淋巴管浸潤與病理的相關性

黃海濤， 丁勝光， 王 飛， 陸晨希， 仲崇俊

(南通市第一人民醫(yī)院胸心血管外科，江蘇 南通 226001)

?

·基礎研究·

食管鱗狀細胞癌NET1的表達和淋巴管浸潤與病理的相關性

黃海濤， 丁勝光， 王 飛， 陸晨希， 仲崇俊

(南通市第一人民醫(yī)院胸心血管外科，江蘇 南通 226001)

目的 探討食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC)組織中神經(jīng)上皮細胞轉化基因1(neuroepithelial cell transforming gene 1， NET1)的表達及D2-40標記的腫瘤淋巴管浸潤與病理之間的相關性。方法 采 用Western印跡法檢測ESCC組織及正常食管組織中NET1蛋白的表達情況，免疫組織化學法檢測ESCC中NET1及D2-40的表達情況，觀察D2-40標記的淋巴管內癌細胞浸潤(lymphatic vessel invasive， LVI)的情況，分析NET1、LVI與臨床病理指標之間的關系及患者5年生存率的差異。結果 NET1在ESCC組織中陽性表達率(++/+++)為61.3%(20.4%/40.9%)(49/80)，正常食管組織中表達陽性率為10.5%(2/19)，2例均為弱陽性(+)，LVI在ESCC組織中的陽性率為36.3%(29/80)，NET1高表達、LVI陽性與ESCC的淋巴結陽性轉移、臨床分期呈正相關(P<0.05)，與腫瘤的神經(jīng)血管侵犯相關(P<0.05)，而與性別、年齡、組織學分級無明顯相關性(P>0.05)。NET1高表達與LVI陽性密切相關(P=0.012)，NET1高表達或LVI陽性的ESCC患者術后的生存率明顯降低，而且同時存在NET1高表達和LVI陽性的ESCC患者術后5年生存率最低。結論 聯(lián)合檢測NET1及LVI可以提高對食管鱗癌患者的術后臨床病理分期及預后的判斷的準確性。

神經(jīng)上皮細胞轉化基因1； D2-40； 食管鱗狀細胞腫瘤； 淋巴管浸潤

淋巴結轉移(lymph node metastasis， LNM)是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC)最常見的轉移方式，伴有LNM的ESCC患者預后較差[1- 5]。淋巴管浸潤(lymphatic vessel invasion， LVI)是指在常規(guī)H-E染色切片中淋巴管內皮細胞圍成的管腔內觀察到腫瘤細胞，與LNM密切相關[6]。平足蛋白又稱腎小球上皮細胞整合膜蛋白，是一種跨膜蛋白，在淋巴管內皮細胞上有表達，可作為淋巴管內皮的標志物[7]。D2-40可用于免疫組化檢測平足蛋白，可客觀地顯示淋巴管[8]。NET1最初是從神經(jīng)上皮瘤中分離鑒定出來的，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移有關。NET1與ESCC的關系目前尚不清楚。

本研究收集ESCC標本，采用Western印跡法檢測NET1表達情況，通過D2-40標記ESCC淋巴管，在H-E染色下觀察并計數(shù)LVI，同時免疫組化檢測NET1蛋白在ESCC中的表達情況，分析NET1的表達與LVI之間的相關性，通過生存分析NET1高表達、LVI陽性對ESCC患者術后生存率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2010年1月至2012年12月南通市第一人民醫(yī)院胸心血管外科ESCC標本80例，術前胃鏡活檢病理明確為鱗狀細胞癌，均無術前化療、放療等治療史。其中男性50例，女性30例，年齡46～78歲。術后病理： 組織學分級Ⅰ級27例，Ⅱ級32例，Ⅲ級21例；浸潤黏膜及黏膜下層24例，侵達肌層28例，侵達漿膜28例；伴淋巴結轉移60例，無淋巴結轉移20例；TNM分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期21例，Ⅲ期42例，Ⅳ期3例。全部標本分別在無壞死區(qū)癌灶、癌旁3cm內及遠端正常食管取材。每例標本取材時均分為2份，1份取材后立即放置在液氮中冷凍，用于NET-1蛋白Western印跡法檢測；另1份用福爾馬林固定，用于NET-1蛋白免疫組化檢測。

1.2 Western印跡法檢測蛋白

提取食管鱗癌組織蛋白，置于-20℃保存，每個樣品取20μl，加入等體積loading buffer，于聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%積存膠，12%分離膠)分離蛋白，積存膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳時間約 1h。采用濕式轉移法，在冰浴中350mA恒流轉移2h；電轉移后的PVDF膜用依次脫脂奶粉封閉，在 1∶ 200 NET-1一抗中室溫孵育24h，1×TBST溶液洗膜，加1∶2000稀釋的二抗，室溫孵育2h，暗房中用ECL溶液顯色，壓片，顯影，顯示各個組織標本的NET-1蛋白表達情況，然后1×TBST溶液洗膜，在1∶ 400 β-actin一抗中4℃孵育24h，1×TBST溶液洗膜，加1∶2000稀釋的二抗，室溫孵育2h，暗房中用ECL溶液顯色，壓片，顯影，顯示內參蛋白表達情況。

1.3 免疫組化檢測

按照試劑說明書檢測NET-1表達。石蠟切片脫蠟至水，微波抗原修復，EnVision兩步法過氧化物酶阻斷液孵育5min，第一抗體NET-1(工作濃度1/200)；室溫30min，DAB顯色。蘇木精輕微襯染。NET-1陽性定位于胞漿或胞膜，呈紅褐色顆粒狀，陽性表達用半定量積分判斷結果。陽性細胞≤5%為0分，6%～ 25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。陽性強度暗紅為1分，紅為2分，紅褐色為3分。陽性細胞數(shù)與陽性強度相乘，0分為“-”，1～4分“+”，5～8分為“++”，9～ 12分為“+++”，++/+++為高表達[13]。

1.4 隨訪

隨訪截止日期為2015年12月31日，中位隨訪時間為42個月。對患者通過電話或門診復查進行隨訪，記載患者的生存情況及在NET1不同表達情況及LVI陰性或陽性時總體5年的生存率差異。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0行χ2檢驗及Pearson相關性分析，應用Kaplan-Meier法進行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ESCC及正常食管組織中NET1蛋白的表達情況

與正常的食管組織比較，ESCC組織中NET1蛋白表達水平明顯升高，見圖1。

圖1 ESCC組織及正常食管組織中NET1的表達情況Fig.1 Expression of NET1 in ESCC and normal esophageal tissue

2.2 食管鱗狀細胞組織中NET1及D2-40的表達

NET1蛋白陽性信號主要分布于核周胞漿，為棕褐色顆粒，見圖2。80例食管鱗癌患者中，49例(61.3%)NET1呈高表達(++/+++)，正常食管組織中僅有10.5%的患者NET1呈陽性(+)表達(P<0.05)。D2-40陽性的淋巴管在食管鱗癌內及癌旁組織中均有表達，細胞漿染色呈棕黃色或褐色，呈管腔狀或者條索狀，管壁覆蓋單層上皮細胞，管壁周圍無清晰的平滑肌細胞和基底膜，管腔內無紅細胞。LVI陽性表現(xiàn)為： D2-40陽性的淋巴管內可見單個、數(shù)個或成團的癌細胞。本組ESCC患者LVI陽性率為36.25%。

圖2 食管鱗狀細胞中NET1陽性蛋白表達Fig.2 Expression of positive NET1 protein in esophageal squamous cell carcinomaA： NET1高表達；B： NET1低表達；C： LVI陽性；D： LVI陰性

2.3 NET1、LVI陽性與ESCC病理的關系

ESCC組織中NET1蛋白的表達與癌組織浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期有關(P<0.05)，隨著腫瘤浸潤深度的增加、淋巴結的轉移及腫瘤分期的增高，NET1高表達率也逐漸增高；而在不同性別、年齡、組織學分級患者中，NET1的表達差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.4 NET1與LVI的相關性

23例患者NET1高表達和D2-40陽性，25例患者NET1低表達和D2-40陰性，NET1高表達與D2-40標記陽性LVI密切相關(r=0.280，P=0.012)。

2.5 NET1表達及LVI陰性或陽性對5年生存率的影響

NET1高表達的ESCC患者的5年生存率明顯低于低表達的患者(P=0.002)，見圖3；D2-40標記LVI陽性的ESCC患者5年生存率低于陰性的患者(P<0.001)，見圖4；NET1高表達同時LVI陽性的ESCC患者5年生存率最低，NET1低表達同時LVI陰性的食管患者5年生存率較高(P<0.001)，見圖5。

表1 NET1的表達、D2-40標記的陽性LVI與ESCC組織臨床病理資料的關系

圖3 NET1高表達與低表達患者5年生存曲線Fig.3 Survival curve of 5-year in patients with NET1 high and low expression

圖4 LVI陰性與陽性患者5年生存曲線Fig.4 Survival curve of 5-year in patients with LVI positive and negative

圖5 NET1的表達與LVI陰性或陽性患者5年生存曲線Fig.5 Survival curve of 5-year in patients with positive or negative NET1 expression and LVI

3 討 論

ESCC的發(fā)生、發(fā)展、轉移與多種因素相關，其中ESCC細胞間黏附分子的改變導致細胞間黏附的缺失是其發(fā)生轉移的關鍵步驟。NET1屬于鳥核苷酸交換因子家族成員，能夠幫助小G蛋白GDP和GTP間的相互轉化，因而NET1可以特異性激活Rho家族蛋白RhoA，其主要的生物學效應是調控肌動蛋白細胞骨架的聚集和重構、細胞間黏附的分離和細胞基質的分解重構，與癌細胞的轉移密切相關[9]。淋巴結轉移是判斷ESCC患者預后不良的一個重要預測因子。通過D2-40標記淋巴管檢測到淋巴管浸潤表明淋巴結轉移已突破第1步。本研究通過D2-40標記ESCC旁組織中淋巴管平足蛋白的表達檢測淋巴管浸潤的情況，分析淋巴管浸潤與NET1表達及ESCC臨床病理之間的關系。

NET1在多種腫瘤中高表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移[9-14]。研究[13]，發(fā)現(xiàn)NET1與非小細胞肺癌的生物學行為密切相關，但NET1與ESCC的關系尚不明確。本研究結果初步揭示了NET1與ESCC臨床病理的相關性。本組病例中NET1的高表達率達61.3%，與ESCC的臨床病理分期密切相關，隨著ESCC浸潤深度的增加，NET1高表達率也不斷增加(Tis-1 37.5%、 T2 57.1%、 T3 89.3%，P<0.001)，伴有淋巴結轉移ESCC患者的NET1高表達率(N1-3， 70%)明顯高于無淋巴結轉移(N0，35%)的ESCC患者(P= 0.005)。伴有血管或神經(jīng)侵犯的ESCC患者的NET1高表達率明顯增加(P=0.019、P=0.025)。

本研究通過D2-40標記淋巴管，檢測LVI的陽性率為36.52%，與文獻[15-16]報道數(shù)據(jù)(33%～89%)相比處于偏低的陽性率，其差異的原因主要與入組患者的差異性有關，與LVI計數(shù)的標準有一定關系，本組對于可疑陽性的標本均予排除。在LVI與ESCC臨床病理關系的研究中發(fā)現(xiàn)： 淋巴結陽性轉移的患者中LVI陽性率達到43.3%，本組20例淋巴結轉移陰性的ESCC患者中有3例患者出現(xiàn)LVI陽性，雖然他們的T分期為Tis-1，這表明部分早期的ESCC患者已伴有淋巴管的擴散，LVI的檢測對于這部分患者的預后判斷尤為重要。

本研究結果提示，NET1高表達與D2-40標記的LVI陽性密切相關。ESCC通過淋巴管到淋巴結轉移是非常重要的轉移途徑。LVI陽性提示著ESCC細胞已經(jīng)侵入淋巴管，表明該ESCC患者的癌細胞開始向遠處轉移，部分患者未達到淋巴結(淋巴結檢測陰性)或部分患者癌細胞已達遠處淋巴結(區(qū)域淋巴結檢測為陽性)。NET1高表達的ESCC患者容易出現(xiàn)LVI陽性，這正與上述的NET1生物特性密切相關。因此，聯(lián)合檢測NET1的表達和LVI陽性與否，提高ESCC患者病理學分期的準確性，對患者后期的治療具有指導性價值。

聯(lián)合檢測NET1的表達和LVI陽性與否對患者預后的判斷也有非常重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)： NET1高表達或LVI陽性的ESCC患者術后的生存率明顯降低，而且同時存在NET1高表達和LVI陽性的ESCC患者術后5年生存率最低。因此，ESCC患者若同時出現(xiàn)NET1高表達和LVI陽性提示預后不良。

本組標本檢測時選取腫瘤中心部位組織及癌旁組織，無法對所有患者的ESCC全部標本進行檢測，可能存在部分實際LVI陽性的患者未能統(tǒng)計到。還需要投入更多人力財力完善標本的檢測。目前，研究[17-18]在肺癌患者的外周血中發(fā)現(xiàn)含有肺癌相關信息物質的外泌體(exosome)，進一步的研究將采集大樣本食管患者的外周血提取exosome，檢測NET1的轉錄及表達情況，然后通過細胞及動物水平評價NET1在ESCC中的作用。

[1] Eguchi T， Nakanishi Y， Shimoda T， et al. Histopathological criteria for additional treatment after endoscopic mucosal resection for esophageal cancer： analysis of 464 surgically resected cases[J]. Mod Pathol， 2006，19： 475-480.

[2] Kodama M， Kakegawa T. Treatment of superficial cancer of the esophagus： a summary of responses to a questionnaire on superficial cancer of the esophagus in Japan[J]. Surgery， 1998，123： 432-439.

[3] Shiozaki H， Doki Y， Yamana H， et al. A multi-institutional study of immunohistochemical investigation for the roles of cyclin D1 and E-cadherin in superficial squamous cell carcinoma of the esophagus[J]. J Surg Oncol， 2002，79： 166-173.

[4] Imamura Y， Hayashi N， Sato N， et al. Extensive lymphatic spread of cancer cells in patients with thoracic esophageal squamous cell carcinoma： detection of CEA-mRNA in the three field lymph nodes[J]. J Surg Oncol， 2010，102： 509-515.

[5] Ando N， Iizuka T， Ide H, et al. Surgery plus chemotherapy compared with surgery alone for localized squamous cell carcinoma of the thoracic esophagus： a Japan Clinical Oncology Group Study-JCOG9204[J]. J Clin Oncol， 2003，21： 4592-4596.

[6] Ishii M， Ota M， Saito S， et al. Lymphatic vessel invasion detected by monoclonal antibody D2-40 as a predictor of lymph node metastasis in T1 colorectal cancer[J]. Int J Colorectal Dis， 2009，24： 1069-1074.

[7] Schacht V， Dadras SS， Johnson LA， et al. Up-regulation of the lymphatic marker podoplanin， a mucin-type transmembrane glycoprotein， in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors[J]. Am J Pathol， 2005，166： 913-921.

[8] Gockel I， Domeyer M， Sgourakis GG， et al. Prediction model of lymph node metastasis in superficial esophageal adenocarcinoma and squamous cell cancer including D2-40 immunostaining[J]. J Surg Oncol， 2009，100： 191-198.

[9] Carr HS， Zuo Y， Oh W， et al. Regulation of focal adhesion kinase activation， breast cancer cell motility， and amoeboid invasion by the RhoA guanine nucleotide exchange factor Net1[J]. Mol Cell Biol， 2013，33： 2773-2786.

[10] Kawata H， Shimada N， Kamiakito T， et al. RhoC and guanine nucleotide exchange factor Net1 in androgen-unresponsive mouse mammary carcinoma SC-4 cells and human prostate cancer after short-term endocrine therapy[J]. Prostate， 2012，72： 1071-1079.

[11] He S， Wei YZ， Wang GL， et al. Study of RNA interference targeting NET-1 combination with sorafenib for hepatocellular carcinoma therapy in vitro and in vivo[J]. Gastroenterol Res Pract， 2013，2013： 685150.

[12] Zhang J， Wang J， Chen L， et al. Expression and function of NET-1 in human skin squamous cell carcinoma[J]. Arch Dermatol Res， 2014，306： 385-397.

[13] Huang HT， Qiao Y， Chen L， et al. Dual silencing of NET-1 and VEGF genes affect biological behavior of lung cancer in vitro experiment[J]. Acta Medica Mediterr， 2015，31(1)： 73-81.

[14] Ji ZJ， Wang JL， Chen L. Inhibition of skin squamous cell carcinoma proliferation and promote apoptosis by dual silencing of NET-1 and survivin[J]. Oncol Rep， 2015，34： 811-822.

[15] Xue L， Lu HQ， He J， et al. Expression of FOXP3 in esophageal squamous cell carcinoma relating to the clinical data[J]. Dis Esophagus， 2010，23： 340-346.

[16] Shimada H， Okazumi S， Matsubara H， et al. Impact of the number and extent of positive lymph nodes in 200 patients with thoracic esophageal squamous cell carcinoma after three-field lymph node dissection[J]. World J Surg， 2006，30： 1441-1449.

[17] Qin X， Xu H， Gong W， et al. The tumor cytosol miRNAs， fluid miRNAs， and exosome miRNAs in lung cancer[J]. Front Oncol， 2015，4： 357.

[18] Li J， Jun Yu， Liu A， et al. β-Elemene against human lung cancer via up-regulation of P53 protein expression to promote the release of exosome[J]. Lung Cancer， 2014，86： 144-150.

Relationship of NET1 expression and D2- 40 labeled lymphatic vessel invasion with clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma

HUANGHai-tao，DINGSheng-guang，WANGFei，LUChen-xi，ZHONGChong-jun

(Dept. of Thoracic and Cardiovascular Surgery， Nantong First People’s Hospital， Nantong 226001， Jiangsu Province， China)

Objective To study the relationship of NET1 expression and D2-40 labeled lymphatic vessel invasion(LVI) with clinicopathological characteristics of esophageal squamous cel carcinoma(ESCC). Methods The expression of NET1 in ESCC and normal esophageal tissue was detected by Western blot. Immunohistochemistry was used to detect the expression of NET1 and D2-40 protein in 80 cases of ESCC and D2-40 labeled LVI was identified. The relationship of NET1 expressions and D2-40 labeled LVI with clinical pathological characteristics of ESCC was analyzed. The overall 5-year survival rate was analyzed by Kaplan-Meier survival analysis. Results The positive expression(++/+++) rate of NET1 was 61.3%(20.4%/40.9%) in ESCC and 10.5%(+) in normal esophageal tissue. NET1 high expression and positive LVI was significantly correlated with positive lymph node metastasis， TNM stage， nerve and blood vessel invasion(P<0.05)， but not with gender， age， tumor differentiation(P>0.05). The positive correlation between NET1 high expression and positive LVI was found(P=0.012). The 5-year survival rate of patients with NET1 high expression or positive LVI was significantly lower. The 5-year survival rate of patients with NET1 high expression and positive LVI was lowest. Conclusion Combined detection of NET1 and D2-40 is of value in clinical staging and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma.

neuroepithelial cell transforming gene 1； D2-40； esophageal squamous cell carcinoma； lymphatic vessel invasive

10.16118/j.1008-0392.2016.05.007

2016-06-04

南通市衛(wèi)生局青年基金(WQ2014020)

黃海濤(1979—)，主治醫(yī)師，博士.E-mail： hht1979@126.com

陸晨希.E-mail： luchenxint@126.com

R 735.1

A

1008-0392(2016)05-0034-06