牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因表達載體的構建及生物信息學分析

樊新麗，鄭會珍，翟雪潔，范士龍，馬 英，陳宋琴，韋麗婷，劉一凡，巴音查汗，張 楊

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 保存于新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院寄生蟲實驗室的牛環(huán)形泰勒蟲陽性DNA。

1.1.2 主要試劑 pET-28a(+)及pEGFP表達載體，由新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院寄生蟲實驗室提供；T4DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker、大腸埃希氏菌DH5α及BL21(DE3)感受態(tài)細胞、PMD18-T，TaKaRa公司產品；PCR產物回收試劑盒，Sigma公司產品；膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產品；質粒小提試劑盒，QINGEN公司產品；其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 離心機(Cence?H1650)，北京時代北利離心機有限公司產品；電子天平(METTLER TOLEDO)，梅特勒一拖力多(上海)儀器公司產品；DK-600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，一恒科學儀器(上海)有限公司產品；PCR儀，美國伯樂(Bio-Rad)公司產品；DYY-Ш-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電儀，北京六一生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1TaAMA1目的基因擴增 按照GenBank中發(fā)表的牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因的序列(登錄號：ANW48430.1)，使用Primer5軟件設計2對特異性引物。引物序列設計及合成如表1，以牛環(huán)形泰勒蟲陽性DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產物在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證，按照QIAGEN生物技術有限公司DNA片段純化試劑盒要求回收目的片段，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列及酶切位點

1.2.2 構建重組pMD18-T-AMA1質粒及驗證 將回收產物與pMD18-T連接，連接反應體系如表2?；靹蚝螅庞? ℃，連接12 h。連接產物轉化于大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞，對克隆菌進行驗證并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表2 連接反應體系

1.2.3 構建重組pET-28a-AMA1和pET-28a-AMA1表達質粒及驗證 將回收的PCR產物和質粒載體pET-28a及pEGFP分別經內切酶BamHⅠ和HindⅢ于37 ℃雙酶切1 h后電泳驗證，試劑盒回收酶切PCR純化產物和質粒載體pET-28a及pEGFP，在T4連接酶作用下按比例混合16 ℃連接過夜，連接產物轉化大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，均勻涂布于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質粒，進行雙酶切鑒定。將初步鑒定正確的陽性克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并通過NCBI中Blast進行比對分析。

1.2.4 獲得蛋白序列及構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹 使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白數(shù)據(jù)庫，以測序比對結果搜索得到TaAMA1蛋白的氨基酸序列信息。以測定蛋白序列利用BlastP搜索模式生物如雙芽巴貝斯蟲(JN572801.1)、牛巴貝斯蟲(QDK56771.1)、吉氏巴貝斯蟲(ACY07255.1)、卵形巴貝斯蟲(AKR16110.1)、東方巴貝斯蟲(AHW45797.1)、惡性瘧原蟲(AFM28827.1)、莫氏巴貝斯蟲(QKY59678.1)、分歧巴貝斯蟲(ACC96234.2)、小泰勒蟲(XP-766171.1)、馬泰勒蟲(XP-004833099.1)、田鼠巴貝斯蟲(XP-021338488.1)，獲得TaAMA1在不同物種中的同源蛋白序列。使用DNA Star軟件中的Protean程序分析同源性，用Mega 7.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ)A方法構建系統(tǒng)進化樹，Boot-strap分析重復數(shù)設置為1 000。

1.2.5 理化性質分析、抗原表位及亞細胞定位預測 利用生物學信息分析軟件對測序結果進行TaAMA1氨基酸理化性質(分子式、分子質量、酸堿性、等電點和穩(wěn)定性)、親/疏水性、信號肽、跨膜區(qū)域、磷酸化位點、抗原表位、亞細胞定位分析，各軟件網址和用途見表3。

表3 各軟件網址和用途

1.2.6 蛋白高級結構預測 用SOPMA在線預測軟件(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)預測牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白的二級結構。

1月17日，水利部召開全國水利系統(tǒng)黨風廉政建設工作視頻會議，貫徹落實黨的十八屆三中全會、十八屆中央紀委三次全會和習近平總書記重要講話精神，總結水利系統(tǒng)2013年黨風廉政建設和反腐敗工作，部署2014年工作。水利部黨組書記、部長陳雷強調，要緊密團結在以習近平同志為總書記的黨中央周圍，標本兼治、懲防并舉，銳意進取、扎實工作，大力推進水利系統(tǒng)黨風廉政建設和反腐敗工作，為水利改革攻堅和跨越發(fā)展提供堅強有力的保障。水利部黨組副書記、副部長矯勇主持會議，黨組成員、中紀委駐部紀檢組組長董力作工作報告，部領導胡四一、劉寧、李國英、蔡其華、周學文，總工程師汪洪出席會議。

2 結果

2.1 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因PCR擴增

擴增產物大小為828 bp(圖1)，與預期的目的基因片段大小相一致。測序結果經Blast比對，與牛環(huán)形泰勒蟲(KX231677.1)同源性為99.72%。

M.DNA標準DL 2 000；1,2,3.AMA1基因PCR產物；4.陰性對照

2.2 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因表達載體的構建及驗證

對TaAMA1進行雙酶切，經10 g/L瓊脂凝膠電泳，pET28a-AMA1酶切片段分別為5 369 bp和828 bp(圖2A)，pEGFP-AMA1酶切片段分別為3 355 bp和828 bp(圖2B)，經Blast比對，與牛環(huán)形泰勒蟲(KX231677.1)同源性為99.72%，說明原核真核表達載體構建成功。

2.3 AMA1生物信息學分析

2.3.1 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1同源性分析及構建系統(tǒng)進化樹 由圖3和圖4可知克隆所得TaAMA1基因氨基酸序列與小泰勒蟲(Thelieriaparva)同源性最高(69.9%)，遺傳距離最近，位于同一個分支，與馬泰勒蟲(Thelieriaequi)的同源性稍微遠，與惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)序列同源性相差更大。

M1.DNA標準DL 15 000；M2.DNA標準DL 2 000； A：1,3.pET-28a-AMA1未酶切；2,4.pET28a-AMA1經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切； B：1,3.pEGFP-AMA1未酶切；2,4.pEGFP-AMA1經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切

圖3 不同物種AMA1基因核酸序列同源性比對分析

2.3.2 理化性質、信號肽及跨膜區(qū)域 利用ExPASy網站在線軟件對TaAMA1蛋白的理化特性進行了預測分析，結果顯示，TaAMA1基因編碼蛋白分子式為C1 331H2 134N398O413S4，原子總數(shù)4 280，氨基酸數(shù)量為276，分子質量為30.448 ku，理論等電點為9.94，屬于堿性蛋白；帶負電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為24，帶正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為41；在體外培養(yǎng)哺乳動物網織細胞內半衰期估計是7.2 h，不穩(wěn)定系數(shù)為37.93(標準40以下為穩(wěn)定蛋白)，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為70.62，親水性總平均值為-0.705，預測該蛋白為親水性蛋白；由ProtScale在線軟件預測得知，TaAMA1蛋白的親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，親水性預測分析進一步印證了GRAVY值分析的結果，TaAMA1屬于親水蛋白。通過TMHMM Server v.2.0在線發(fā)現(xiàn)，該蛋白未見到跨膜信號，因此該蛋白不屬于跨膜蛋白。經信號肽預測分析發(fā)現(xiàn)，TaAMA1序列中不包含信號肽(圖5)。

●本文測定

2.3.3 磷酸化位點 利用Net-Phos3.1 Server網站在線軟件對TaAMA1蛋白的磷酸化位點進行了預測分析，結果顯示，TaAMA1蛋白氨基酸序列上共有38個磷酸化位點，包括26個絲氨酸磷酸化位點，10個蘇氨酸磷酸化位點，2個絡氨酸磷酸化位點(圖6)。表明TaAMA1蛋白共存在38個潛在的翻譯后修飾(post-translation modification,PTM)。

圖6 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白磷酸化位點預測

2.3.4 B細胞抗原表位分析 采用DNA Star程序中Protean軟件預測AMA1蛋白B細胞抗原表位，結果見圖7。由圖7可知，該蛋白屬于親水性蛋白，柔韌性較好；抗原性及表面可及性較高。因此，將AMA1蛋白柔韌性、疏水性、表面可及性及抗原指數(shù)進行綜合分析，再結合在線軟件IEDB分析預測該蛋白含有9個潛在抗原表位，結果見圖8和表4。

表4 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1的B細胞表位預測

圖7 Protean預測牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白B細胞表位

圖8 IEDB預測牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白B細胞表位

2.3.5 亞細胞定位 為進一步揭示TaAMA1在細胞中發(fā)揮功能的部位，經PSORTⅡ預測發(fā)現(xiàn)，此蛋白定位于細胞核的可能性為87%，位于線粒體、細胞骨架及細胞質中可能性為4.3%。

A.親疏水性分析；B.跨膜結構預測；C.信號肽預測

2.3.6 二級結構 應用SOPMA軟件預測TaAMA1蛋白的二級結構，結果顯示，TaAMA1蛋白二級結構中α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲、延伸鏈分別占23.91%、7.61%、49.64%、18.84%(圖9)。

圖9 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白的二級結構分析

3 討論

生物信息學是一門醫(yī)學、統(tǒng)計學、數(shù)學、物理學和計算機科學交叉的學科。與傳統(tǒng)的研究方法相比，生物信息學方法具有高效和低成本的特點，該方法已被廣泛應用于分析預測蛋白質的功能、結構和其他生物學特性。牛環(huán)形泰勒蟲是一種細胞內寄生蟲，至今無有效治療方法及預防疫苗。AMA1作為高度保守性蛋白，被選定為最有前景的疫苗候選抗原之一，由微線體分泌。微線體蛋白在蟲體入侵宿主細胞的早期發(fā)揮識別和黏附作用，是免疫原性極強的毒力因子。Deans J A等[13]首次從諾氏瘧原蟲(裂殖子頂端復合體)中發(fā)現(xiàn)AMA1，隨后AMA1在頂復門其他種中相繼發(fā)現(xiàn)。本研究成功克隆出AMA1基因，目的基因為828 bp，與預期片段大小相一致，成功構建了原核表達載體pET28aAMA1及真核表達載體pEGFP-AMA1，預測TaAMA1基因編碼蛋白分子式為C1 331H2 134N398O413S4，原子總數(shù)4 280，氨基酸數(shù)量為276，分子質量為30.448 ku，理論等電點為9.94，不穩(wěn)定系數(shù)為37.93，該蛋白為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為70.62，親水性總平均值為-0.705，預測該蛋白為親水性蛋白，無跨膜區(qū)及信號肽，為進一步研究AMA1蛋白的功能奠定基礎。

化學修飾是蛋白質加工的主要方式。前體蛋白常需要進行一系列的翻譯后修飾才能成為具有功能的成熟蛋白。目前已知的翻譯后修飾多達400余種[14]，最常見的有磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化等。磷酸化是蛋白翻譯后修飾中最為廣泛的共價修飾形式，蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程，調節(jié)著包括細胞的增殖、發(fā)育、分化、骨架調控、凋亡、新陳代謝等幾乎所有的生命活動過程，并且可逆的蛋白質磷酸化是目前所知的最主要的信號傳導方式[15]。通過生物信息學在線程序分析TaAMA1蛋白含有38個磷酸化位點，預示其在細胞信號轉導的控制具有顯著作用，AMA1蛋白可以通過調節(jié)這些磷酸化位點實現(xiàn)其生物學功能，同時提示該蛋白具有潛在的抗原表位。蛋白質的亞細胞定位分析有助于確定AMA1蛋白在牛環(huán)形泰勒蟲體內的主要分布[16]。亞細胞定位分析顯示，AMA1位于細胞核的可能性最高(87%)，提示TaAMA1可能在細胞核中發(fā)揮作用。

抗原表位分析對研究蛋白質的抗原性具有重要的參考價值。通過開展對抗原表位的研究，既可以了解抗原蛋白的結構和功能，揭示病原的致病機制和免疫機理，也可為研究表位疫苗做準備。對蛋白質的抗原表位鑒定有X線晶體衍射技術和氨基酸序列分析技術。前者雖可獲得最詳盡的信息，但費時且價格昂貴。在抗原氨基酸序列分析的諸多方法中Jameson-Wolf 法是最常用的方法之一[17]。本研究采用Protean軟件結合在線軟件IEDB綜合分析TaAMA1蛋白的Jameson-Wolf 指數(shù)，預測TaAMA1蛋白具有9個抗原表位，提示其具有免疫原性。抗原表位是蛋白質抗原性的基礎，正確而詳細地繪制蛋白質抗原表位的圖譜，對疾病的診斷及預后判定、定點改造蛋白質分子以降低蛋白質藥物的免疫原性、設計疫苗分子結構以及免疫干預治療等具有重要意義。

蛋白質的二級結構因其構型及所處的位置和數(shù)量不同而表現(xiàn)出不同的功能[18]。對抗原表位有很大影響。α-螺旋和β-折疊結構規(guī)則，不易變形，較難嵌合抗體，一般不作為抗原表位，其主要功能是作為蛋白質骨架起穩(wěn)定作用。而蛋白質的轉角及無規(guī)卷曲則比較松散，易于發(fā)生扭曲、盤旋并展示在蛋白的表面，成為抗原表位的可能較大[19]。TaAMA1蛋白二級結構中α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲、延伸鏈分別占23.91%、7.61%、49.64%、18.84%，其中無規(guī)則卷曲占比例最高(49.64%)，提示可能具有多個抗原表位。

本研究成功構建原核表達質粒pET28a-AMA1及真核表達質粒pEGFP-AMA1，同源性及系統(tǒng)進化樹分析顯示與小泰勒蟲氨基酸序列同源性最大，生物信息學分析預測有38個磷酸化修飾位點，亞細胞定位預測位于細胞核的比例為87%，B細胞抗原表位分析顯示該蛋白含有9個潛在抗原表位，二級結構預測顯示有多個抗原表位，可為后續(xù)AMA1是否可作為牛環(huán)形泰勒蟲候選疫苗分子及研究其結構功能奠定基礎。。